Introducción
La detección de Streptococcus agalactiae o estreptococo del grupo B (EGB) en la vagina y/o el recto de las mujeres embarazadas y la administración de profilaxis antibiótica intraparto en las portadoras es actualmente el método más eficaz y el más recomendado para prevenir la infección neonatal precoz por EGB1-4.
La elección del medio de cultivo para detectar EGB en escobillones vaginales y/o rectales puede influir de forma importante en la eficacia de esta medida, ya que son diversos los medios de cultivo que se utilizan para este fin.
Por este motivo, hemos realizado un estudio comparativo de tres medios de cultivo con el objetivo de investigar su eficacia en la detección de gestantes portadoras de EGB.
Métodos
Pacientes
Durante un período de 4 meses (de marzo a junio del 2001) se procesaron 1.334 muestras: 861 escobillones vaginales y 473 escobillones rectales pertenecientes a 861 mujeres gestantes. En 388 pacientes se realizó sólo cultivo de escobillón vaginal (grupo A) y en 473 pacientes se cultivaron por separado un escobillón vaginal y otro rectal (grupo B).
Métodos microbiológicos
Las muestras de vagina y de recto se obtuvieron con escobillones que fueron inoculados en medio de transporte de Amies y conservados a temperatura ambiente hasta el momento de su siembra en:
1. Una placa de agar sangre con colistina y ácido nalidíxico (AS-ANC, bioMérieux), incubada a 37 °C en atmósfera con un 5% de dióxido de carbono (CO2) durante 48 h.
2. Un cuarto de placa de medio de Granada (Biomedics), incubada a 37 °C en jarra con atmósfera de anaerobiosis durante 48 h.
3. Un tubo con 2 ml de caldo Todd-Hewitt (CTH, Oxoid) suplementado con 5% de suero de caballo (bioMérieux) y 15 μg/ml de amikacina (Normon), incubado a 37 °C durante 24 h con posterior resiembra con asa calibrada de 10 μl en media placa de AS-ANC que se incubó 24 h a 37 °C en atmósfera con un 5% de CO2.
La identificación de las colonias de EGB se realizó mediante: a) producción de pigmento naranja en medio de Granada; b) aglutinación de partículas de látex (bioMérieux), y c) en los casos dudosos mediante pruebas bioquímicas: hidrólisis del hipurato, bilis-esculina y pyrrolidonil-aminopeptidasa (Rosco).
Resultados
Detección de EGB en muestras vaginales y rectales
Se aisló EGB en 181 muestras (13,6%): 114 de los 861 escobillones vaginales (13,2%) y 67 de los 473 escobillones rectales (14,2%).
De las 181 muestras positivas (114 vaginales y 67 rectales), se aisló EGB en AS-ANC en 109 muestras: en 69 frotis vaginales (sensibilidad del 60,5%) y en 40 frotis rectales (59,7%); en medio de Granada en 153 muestras: en 92 frotis vaginales (80,7%) y en 61 frotis rectales (91%); y en CTH en 176 muestras: en 111 frotis vaginales (97,4%) y en 65 frotis rectales (97%) (fig. 1).
Figura 1. Porcentaje de aislamiento de EGB en cada medio de cultivo sobre el total de cultivos positivos. AS-ANC: agar sangre con colistina y ácido nalidíxico; CTH: caldo de Todd-Hewitt.
Detección de portadoras de EGB
Se detectaron 130 portadoras de EGB: 54 (13,9%) en el grupo A (escobillón vaginal) y 76 (16,1%) en el grupo B (escobillón vaginal y rectal). En este último grupo, 51 pacientes eran portadoras vaginales y rectales (67,1%), nueve sólo portadoras vaginales (11,8%) y 16 sólo portadoras rectales (21,1%).
En ambos grupos de estudio, el porcentaje de portadoras detectadas fue respectivamente del 59,3 y 75% con AS-ANC, del 77,8 y 93,4% con medio de Granada y del 96,3 y 97,4% con CTH. La combinación de AS-ANC o medio de Granada y CTH detectó todas excepto una de las portadoras de EGB, es decir, un 99,3% (fig. 2). Una paciente estaba colonizada en vagina por una cepa no betahemolítica que sólo se detectó en la placa inicial de AS-ANC, mientras que otra paciente presentaba exclusivamente colonización rectal que sólo se detectó en medio de Granada.
Figura 2. Porcentaje de portadoras de EGB detectadas en cada medio de cultivo sobre el total de portadoras. AS-ANC: agar sangre con colistina y ácido nalidíxico; CTH: caldo de Todd-Hewitt.
Discusión
En nuestro estudio, el cultivo en AS-ANC ha demostrado poseer una eficacia limitada para la detección de EGB; sólo ha detectado un 60% de muestras positivas, aunque la combinación del cultivo de escobillón vaginal y rectal ha permitido detectar al 75% de las portadoras.
El AS-ANC no es un medio de enriquecimiento, y su selectividad para detectar estreptococos es moderada5, ya que la presencia de colistina y ácido nalidíxico permite la inhibición de bacterias gramnegativas, pero no de estafilococos y levaduras, que pueden enmascarar el crecimiento de EGB. Además, la detección de EGB se realiza en función de la existencia de betahemólisis, que puede verse inhibida ante la presencia de colonias alfahemolíticas de otros estreptococos y de lactobacilos.
Algunos autores han comprobado que la utilización de un aminoglucósido como la neomicina, junto con el ácido nalidíxico, incrementa la selectividad del medio y permite obtener mejores resultados6. Evidentemente, la utilización de agar sangre sin antibióticos posee una nula selectividad que implica todavía unos peores resultados7,8.
Se ha descrito que un bajo porcentaje de cepas de EGB (menos del 2%) no produce betahemólisis, por lo que estas cepas serían difícilmente identificables, aunque un observador experimentado es capaz de hacerlo en algunos casos en que se obtiene un crecimiento puro y abundante en este medio de cultivo.
El CTH es el medio de enriquecimiento más utilizado para EGB y el recomendado por el Center for Disease Control (CDC)4,9-11. En nuestro estudio ha detectado un 97% de las muestras positivas y el mismo número de portadoras de EGB, siendo el medio más eficaz de los tres probados.
En general, para el crecimiento de estreptococos son aptos diversos caldos de cultivo y todos se han utilizado para detectar EGB, como el caldo de tioglicolato12 o el caldo de Mueller-Hinton5. Los falsos negativos observados al utilizar un caldo selectivo pueden deberse al sobrecrecimiento de otras bacterias, especialmente de enterococos13 o a la inhibición de algunas cepas de EGB por los aminoglucósidos del caldo14.
Hemos observado que la adición de suero o de sangre favorece el crecimiento de EGB y consigue mejores resultados, sobre todo en los cultivos mixtos con enterococos que podrían enmascarar la presencia de EGB en la resiembra en placa.
La adición de antibióticos como gentamicina y ácido-nalidíxico permite la inhibición de bacterias gramnegativas y de estafilococos; nosotros hemos utilizado para este fin la adición de amikacina, ya que con un solo antibiótico se consigue una selectividad similar. Previamente habíamos descrito la posibilidad de obtener un medio selectivo disco-caldo para EGB, mediante la adición de un disco de antibiograma de 30 mg de amikacina a 2 ml de CTH5, que puede ser de utilidad en laboratorios con un número limitado de muestras.
La resiembra posterior del caldo en AS-ANC permite la detección de EGB por su betahemólisis. Algunos enterococos poseen cierta actividad betahemolítica, lo que obliga a realizar pruebas de aglutinación o bioquímicas para confirmar la presencia de EGB.
El medio de Granada en placa es un medio selectivo y diferencial8,15,16, aunque no de enriquecimiento, para EGB, con una composición similar a otros descritos17-20. Los antimicrobianos que lleva incorporados permiten la inhibición de bacterias gramnegativas, estafilococos y levaduras, y facilita el crecimiento de estreptococos y enterococos.
La presencia de inhibidores del ácido fólico induce el desarrollo de un pigmento naranja específico de EGB, en particular cuando se incuba en condiciones de anaerobiosis, lo que sirve para diferenciarlo de otros estreptococos y de los enterococos. Las cepas de EGB no betahemolíticas carecen también de capacidad para producir pigmento.
En nuestro estudio, este medio ha sido positivo en un 80% de las muestras vaginales con EGB y en un 91% de las rectales, y la combinación de ambas muestras ha detectado a un 93% de las portadoras. Hemos observado que un cierto número de pacientes presenta probablemente una densidad de colonización por EGB muy baja, sobre todo en la vagina, que sólo puede ser detectada mediante el empleo de un caldo de enriquecimiento.
Por otro lado, la presencia de pigmento naranja permite una identificación rápida (en 18-24 h) y segura de EGB. No creemos que el hecho de utilizar un cuarto de placa sea la causa de haber obtenido peores resultados, ya que el medio consigue una diferenciación perfecta de cualquier colonia de EGB que crezca. El empleo de un cuarto de placa de medio de Granada ha supuesto en cambio un notable ahorro económico, ya que el coste de este medio es elevado, y también ha disminuido la cantidad de placas incubadas en jarras con atmósfera de anaerobiosis en nuestro laboratorio.
Recientemente, algunos autores han descrito que la incubación de las placas de medio de Granada en aerobiosis, tras cubrir la zona inoculada con un cubreobjetos, permite el mismo desarrollo de pigmento que su incubación en condiciones de anaerobiosis21. Por otra parte, algunos autores han desaconsejado el empleo del medio de Granada en tubo22 ya que, en determinadas condiciones, puede producir un número importante de falsos negativos.
Los mejores resultados los hemos obtenido con la combinación de un medio en placa, AS-ANC o medio de Granada, y un tubo de CTH. Esta combinación ha detectado un 99,3% de las portadoras de EGB. Según estos resultados, el protocolo utilizado actualmente en nuestro laboratorio es el siguiente:
1. Siembra en un cuarto de placa de medio de Granada incubado en anaerobiosis y en un tubo de CTH en las muestras de vagina y de recto en las que se solicita exclusivamente cultivo selectivo de EGB, y se reciben en el horario normal de funcionamiento del laboratorio.
2. Siembra en una placa de AS-ANC y en un tubo de CTH en las muestras en las que se solicita cultivo vaginal no selectivo de EGB (en sospecha de enfermedad de transmisión sexual, amniorrexis prematura y/o prolongada, etc.) y se inoculan otros medios de cultivo (agar Sabouraud, agar chocolate, agar Thayer-Martin y, en ocasiones, agar McConkey), y en las muestras de vagina y de recto para cultivo selectivo de EGB que se reciben en horario de urgencias.
El empleo, desde 1997 del CTH, conjuntamente con AS-ANC y posteriormente con medio de Granada para la detección de EGB, y la posterior administración de profilaxis antibiótica intraparto a las gestantes portadoras, ha reducido de manera drástica la incidencia de sepsis neonatal precoz por EGB en nuestro hospital, hasta unas cifras de 0,18 casos por cada mil recién nacidos vivos durante el período 1997-2001.
