Introducción
Desde finales de los años 1980, la introducción y posterior perfeccionamiento de los tests para la detección de anticuerpos frente al virus de la hepatitis C (VHC), ha permitido reducir enormemente el riesgo de transmisión de este virus 1-3. Las técnicas de biología molecular han logrado reducir el tiempo necesario para la detección de la infección hasta 1-2 semanas 4,5. Otra alternativa para el diagnóstico precoz de la infección por VHC es la determinación de antígeno del core VHC, que según algunos autores 6-8 ofrece resultados similares a las técnicas de biología molecular, con la ventaja de utilizar una tecnología menos compleja. Recientemente ha aparecido en el mercado una prueba para la determinación simultánea de anticuerpos y antígenos frente al VHC (Monolisa HCV Ag/Ab ULTRA; BioRad, Marnes la Coquette, France) con la que potencialmente se reduce el período ventana 8-11. Esta prueba al desarrollarse bajo un formato de análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) y no precisar la manipulación previa de la muestra, es de fácil adaptación para cualquier laboratorio diagnóstico 8,10.
El objetivo del presente trabajo ha sido evaluar la técnica Monolisa HCV Ag/Ab ULTRA y compararla con nuestra técnica de rutina (Ortho HCV 3.0 SAVe test system. Ortho Clinical Diagnostics, Amersham, UK). Para ello han sido estudiados dos grupos de pacientes, población general para escrutinio rutinario de VHC y seguimiento de pacientes hemodializados. Para evaluar la sensibilidad en la detección del VHC en las fases tempranas de la infección, se utilizaron paneles comerciales de seroconversión adecuadamente caracterizados por los fabricantes.
Material y métodos
Grupo 1. Población general
Se estudiaron 1.360 sueros de pacientes a los que se les solicitaba determinación de anticuerpos frente al VHC que correspondían a muestras llegadas a nuestro laboratorios durante el primer semestre de 2005 procedentes de atención primaria y hospital, excluyendo aquellas remitidas desde Nefrología, Digestivo e Infecciosos.
Grupo 2. Pacientes hemodializados
Se estudiaron 333 muestras correspondientes a 183 pacientes en programa de hemodiálisis. Se analizaron entre 1 y 4 muestras por paciente. Dieciséis de los pacientes estaban catalogados como VHC positivos, es decir, tenían infección pasada (AcVHC) o actual (AcVHC + ARN VHC) por VHC.
Paneles de seroconversión
Se analizaron 75 muestras secuenciales de 7 paneles comerciales: cinco provenían de Bioclinical Partner (Franklin, MA; BCP 6213, BCP 6222, BCP 6225, BCP 9041, BCP 9055) y dos de Boston Biomédica Inc. (West Bridgewater, MA; BBI 917, BBI 919). Los paneles contenían entre 7 y 19 muestras. La carga viral, genotipo y resultados de detección de anticuerpos por distintos ensayos comercializados fueron aportados por los fabricantes. A la recepción de estas muestras se alicuotaron en volúmenes de 300-330 μl y fueron congeladas a 80 °C hasta su uso.
Métodos
Todas las muestras del grupo 1 se procesaron simultáneamente por Otho HCV 3.0 test system Enhanced SAVe (Ortho Clinical Diagnostics, Amersham, UK) para la determinación de anticuerpos y por Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA (BioRad, Marnes la Coquette, France) para la determinación simultánea de antígeno y anticuerpos. Los sueros con resultados discrepantes frente a las dos técnicas anteriores se ensayaron con una tercera técnica HCV Abbott AXYM System 3.0 (Abbott, Wiesbaden, Germany). Todas las muestras de los pacientes hemodializados (grupo 2) se estudiaron con las tres técnicas anteriores. Se utilizó la técnica Inno-LIA HCV Score (Innogenetics, Ghent, Belgium) como test confirmatorio en las muestras discrepantes. La determinación de ARN-VHC se realizó mediante Roche Amplicor HCV test, versión 2.0 (Roche Molecular Diagnostic Systems). Para la valoración de resultados serológicos y establecimiento de los resultados de referencia en los pacientes hemodializados nos ayudamos de la historia clínica. Los paneles de seroconversión se ensayaron únicamente por las dos técnicas iniciales (Ortho HCV 3.0 y Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA). En todos los casos los tests se realizaron siguiendo las indicaciones del fabricante.
El test Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA se basa en la combinación de un test indirecto de determinación de anticuerpos y un "sándwich" para la determinación de antígeno. En resumen, la técnica consta de los siguientes pasos: 50 μll de cada muestra o control se incuban a 37 °C durante 90 min con 100 μl de conjugado 1 (conteniendo anticuerpos monoclonales biotinilados anti-core VHC) en pocillos microtiter que contienen en su pared anticuerpos monoclonales frente a proteínas core VHC, proteínas recombinantes NS3 y NS4, y un péptido mutado antígeno-específico del core VHC. Después de un ciclo de lavados se adicionan 100 μl de conjugado 2 (conteniendo anti-IgG humana marcada con peroxidasa y estreptavidina-peroxidasa) a cada pocillo y se procede a incubación 37 °C 30 min. Después de un segundo ciclo de lavados, el complejo antígeno-anticuerpo se revela por la adición de sustrato; la reacción es parada a los 30 min de incubación a temperatura ambiente mediante la adición de 100 μll de ácido sulfúrico 1 N. La absorbancia es medida a 450 nm (filtro referencia a 620 nm). Las muestras son consideradas positivas si su densidad óptica es superior o igual al valor de corte (determinado dividiendo entre 4 la densidad óptica media de los controles positivos).
Resultados
Grupo 1. Población general
En 1.353 de los 1.360 sueros estudiados (99,5%) hubo concordancia en los resultados obtenidos por la técnica Ortho HCV y la de detección simultánea de Ag/Ac Monolisa (1.281 negativos y 72 positivos). En 7 muestras los resultados fueron discrepantes, 5 positivos sólo por Monolisa HCV y 2 positivos sólo por Ortho HCV. Estas muestras fueron estudiadas mediante el test HCV Abbott AXYM, mostrando resultado positivo 2 de las 5 muestras positivas por Monolisa y 1 de las 2 muestras positivas por Ortho HCV. De estas últimas, la que dio resultado positivo mediante la técnica de Abbott, aunque presentó un resultado negativo por el test Monolisa, su absorbancia fue cercana al cutoff (índice s/co 0,74).
Grupo 2. Pacientes hemodializados
La correlación de las dos técnicas (Monolisa HCV y Ortho HCV) fue del 97,6% (308 negativos y 17 positivos de 333 muestras estudiadas). En 8 muestras correspondientes a 8 pacientes, encontramos resultados discrepantes (7 positivos sólo por Monolisa y 1 positivo sólo por Ortho HCV). La tabla 1 muestra los resultados de las 8 muestras discrepantes. La única muestra positiva por Ortho HCV y negativa por Monolisa, no se confirmó por ninguno de los demás test utilizados (HCV Abbott, Inno-LIA, PCR-VHC) por lo que se consideró como negativa (falso positivo por Ortho HCV). Cinco de los 7 positivos por Monolisa también lo fueron por HCV Abbott y test confirmatorio Inno-LIA, por lo que se consideraron verdaderos positivos. La muestra FTR correspondía al seguimiento de un paciente, en el que los resultados mediante HCV Abbott también fueron positivos, aunque cerca del cutoff. Este paciente según su historia clínica era AcVHC(+) antes de entrar en programa de hemodiálisis. Se realizó el test confirmatorio Inno-LIA, presentando un patrón indeterminado con anticuerpos frente a core, patrón que sería compatible con una infección pasada resuelta con anticuerpos residuales, por lo que para el análisis de sensibilidad y especificidad se consideró verdadero positivo. De forma análoga, el paciente CCL mostrando resultado negativo por la técnica de Ortho HCV, positivo por Monolisa y HCV Abbott y un patrón indeterminado (core) mediante Inno-LIA se consideró verdadero positivo. En la tabla 2 se detallan los resultados de E, S, VPP y VPN de las técnicas Ortho HCV en población hemodializada y Monolisa HCV. La E de ambos tests fue muy alta (100 y 99,6% para Monolisa y Ortho, respectivamente), por el contrario el test Monolisa HCV se mostró mucho más sensible (100%) en este grupo de pacientes que el test de Ortho HCV (70,8%).
Paneles de seroconversión
En la tabla 3 se muestran los resultados del estudio de los 7 paneles de seroconversión. Destacamos que sólo 18 muestras (24%) fueron detectadas mediante la técnica de anticuerpos Ortho HCV, mientras la técnica de detección simultánea Ag-Ac mostró 43 muestras (57,3%) como positivas. Mediante técnicas de ácidos nucleicos (TAN) se detectó ARN en 44 muestras (datos aportados por los proveedores de los paneles). En 38 de estas 44 muestras se detectó la infección mediante la técnica Monolisa. Cuando estudiamos el panel de seroconversión BBI-917, que constaba de 10 muestras, se detectó la positividad a VHC simultáneamente por Monolisa y TAN en la segunda muestra. La seroconversión para Ortho se produjo en la quinta muestra, coincidiendo con un descenso de carga viral VHC por debajo del límite de detección, esto hace que en este panel Monolisa detecte positivas 9 muestras frente a sólo 4 de las técnicas moleculares. En 3 de los 7 paneles fue más precoz la técnica de determinación de ARN-VHC para detectar la infección VHC que la técnica Monolisa Ag-Ab; en los restantes se detectó simultáneamente por ambas técnicas. La técnica de detección simultánea Ag-Ac reduce el período ventana hasta 72 días comparada con la detección de anticuerpos. El retraso de la técnica Monolisa VHC Ag-Ab respecto a las TAN es de cero a 19 días, aunque hemos de ser cautos al sacar conclusiones ya que este dato, en nuestro estudio, ha dependido de las características de un limitado número de paneles de seroconversión. En 6 muestras encontramos el patrón TAN(+)/Monolisa Ag-Ac(), 3 correspondieron a resultados Monolisa con índices (s/co) mayores de 0,5 (BBI-919-4, s/co = 0,84; BCP-9055-6, s/co = 0,16; BCP-6213-4, s/co = 0,09; BCP-6213-5, s/co = 0,24; BCP-6213-6, s/co = 0,58; BCP-6213-7, s/co = 0,65).
Discusión
El diagnóstico de la infección por VHC está basado en la demostración de anticuerpos frente a dicho virus mediante técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA) seguida de pruebas confirmatorias tipo inmunoblot, que confirman la especificidad de la respuesta inmunitaria. Por otro lado, la detección del ARN viral nos permite conocer la actividad o no de la infección 12,13. La detección de antígeno VHC también ha sido utilizada como alternativa para la detección directa del virus 14,15. Las técnicas directas (ARN y Ag) reducen el período ventana desde 4-8 semanas hasta 1-2 semanas, en el mejor de los casos.
Shah et al 16 describieron una técnica para la determinación simultánea de antígeno y anticuerpos frente al VHC, con la cual se reducía significativamente el período ventana respecto a los métodos que sólo utilizan la detección de anticuerpos, sin pérdida de especificidad ni sensibilidad. Recientemente ha aparecido en el mercado el test para la detección simultánea de antígeno y anticuerpos VHC (Monolisa Ag-Ab VHC ULTRA), como un gran avance para el diagnóstico precoz de la infección por VHC, y para el cribado en bancos de sangre. Nuestro objetivo fue valorarlo como técnica de rutina en dos subgrupos de población. En el primero, población general atendida en nuestra área sanitaria, se encontró una alta correlación con otros tests que sólo detectan anticuerpos. En el subgrupo de pacientes sometidos a hemodiálisis, población con especial importancia por desarrollar una respuesta inmunitaria anormal, se observó una alta especificidad, similar a nuestra técnica de rutina, y una sensibilidad superior a dicho test. Esta mayor sensibilidad no parece deberse a su capacidad para detectar antígeno, ya que las 3 muestras negativas por Ortho y positivas por PCR y Monolisa, también fueron positivas por la técnica de Abbott que sólo detecta anticuerpos frente al VHC; además 4 muestras no virémicas (PCR negativa) fueron positivas mediante la técnica Monolisa y negativas mediante Ortho. Actualmente, según el Documento de Consenso de la Sociedad Española de Nefrología 17 se aconseja la monitorización del paciente seronegativo mediante determinación de anticuerpos anti-VHC al menos una vez cada 6 meses. En nuestro laboratorio son atendidos un elevado número de pacientes hemodializados (aproximadamente 200), los cuales son monitorizados periódicamente en cuanto a su estado de infección por el VHC, suponiendo una importante carga de trabajo. No es raro encontrar en estos pacientes resultados fluctuantes en la detección de anticuerpos debido a que la respuesta inmunitaria no es buena (niveles bajos de anticuerpos) incluso puede ser incompleta o estar ausente 18,19. Los pacientes seronegativos, siguiendo un protocolo establecido, son monitorizados cada 2-3 meses para la detección de anticuerpos VHC. Los pacientes hemodializados tienen un elevado riesgo de adquirir la infección por VHC, independientemente de las transfusiones recibidas (actualmente menos frecuentes que antes), y además desarrollan una respuesta inmunitaria incompleta 19-21, por ello, parece lógico esperar que el rendimiento diagnóstico global de una técnica capaz de detectar simultáneamente antígeno y anticuerpo en este tipo de población sea superior al de una técnica que sólo detecte anticuerpos y, por supuesto superior al de una técnica de diagnóstico molecular (hasta un 15% pacientes infectados por VHC no presenta viremia) salvo que sean unidades de hemodiálisis de alto riesgo de infección por VHC, dónde se mostrarían más precoces estas últimas. Actualmente no está indicada la monitorización de los pacientes seronegativos para VHC, mediante técnicas directas (detección de antígeno o ARN), por lo que una técnica capaz de detectar simultáneamente antígeno y anticuerpos sin un coste excesivo y con una metodología simple facilitaría y mejoraría la monitorización continuada del paciente hemodializado, precisamente por su potencial para detectar con mayor precocidad una posible seroconversión y por su capacidad para detectar a pacientes virémicos crónicamente infectados con niveles bajos de anticuerpos.
En cuanto a la interpretación de resultados, destacamos la óptima discriminación de muestras negativas, ninguna en la zona gris, y prácticamente todos los resultados negativos (> 99,5%) alejados de la zona gris (datos no mostrados). Observamos que la mitad de los resultados discrepantes respecto a otras técnicas más sensibles (TAN) en fases tempranas de la infección ocurren con índices (s/co) entre 0,5 y 0,9, hecho ya descrito por otros autores 8,11 que proponen que a los pacientes con este tipo de resultados, se les debería hacer un estrecho seguimiento para confirmar si son reacciones inespecíficas o realmente corresponden a una fase temprana de la infección con baja concentración de antígeno circulante. Estos autores 8 sugieren que se podría bajar el umbral de la zona gris a 0,5 en lugar de 0,9 (s/co). La reducción del período ventana que se consigue con esta técnica la hace interesante también para otro grupo de pacientes que se estudian en los laboratorios hospitalarios, como son los donantes de órganos. Según nuestros datos, y de acuerdo con otros trabajos publicados 9,11, se reduce significativamente el período ventana, aunque no tanto como con la técnica de detección de AgVHC, que prácticamente iguala en sensibilidad a las técnicas de ácidos nucleicos 14,15. A pesar de ello, en determinados pacientes la técnica Monolisa Ag-Ac ULTRA detecta simultáneamente la infección por VHC a las técnicas de ácidos nucleicos.
Como conclusión destacamos la utilidad de este nuevo test en el seguimiento de pacientes donde la respuesta inmunitaria es incompleta o incluso puede estar ausente como son los pacientes hemodializados, en los que las técnicas de diagnóstico molecular no están aconsejados de forma rutinaria, ya que permitiría la detección de pacientes virémicos crónicamente infectados con bajas tasas de anticuerpos y pacientes recientemente infectados. Esto repercutiría en un mejor manejo de la infección y riesgos asociados. Por otro lado, su fácil ejecución técnica e interpretación de resultados permite su adaptación a cualquier tipo de laboratorio.
Correspondencia:
Dr. J.C. Alados-Arboledas.
Servicio de Microbiología. Hospital del SAS de Jerez de la Frontera.
Ctra. Circunvalación, s/n. 11407 Jerez de la Frontera. Cádiz. España.
Correo electrónico: juanc.alados.sspa@juntadeandalucia.es
Manuscrito recibido el 2-5-2006; aceptado el 28-8-2006.
