Introducción: El aumento en la incidencia de infecciones por hongos levaduriformes del género Candida y su repercusión en el ámbito hospitalario y comunitario (vaginitis recidivante), así como el conocimiento de los nuevos antifúngicos en el arsenal terapéutico, nos han motivado a identificar levaduras de este género de diverso origen y a estudiar su comportamiento frente a los antifúngicos utilizando métodos comerciales de fácil aplicación en el uso clínico.
Material y métodos: Se han identificado por métodos comerciales (CHROMagar Candida® y Auxacolor®), un total de 317 levaduras del género Candida: 108 vaginales, 138 de unidades de cuidados intensivos de neonatos y 71 de unidades de cuidados intensivos de adultos, realizándose el antifungigrama a 199 de los aislados utilizando un método comercial (Fungitest®).
Resultados y conclusiones: Candida albicans se identifica como el microorganismo más frecuente en ambos tipos de muestras, comunitarias y hospitalarias (el 78,7 y el 45,93%, respectivamente) seguida de Candida glabrata (el 19,44 y el 28,23%, respectivamente).
La sensibilidad a anfotericina B y 5-fluorocitosina ha sido muy elevada en todos los grupos estudiados, mientras que la sensibilidad a derivados imidazólicos depende de la procedencia de las muestras (menor sensibilidad en los aislados de unidades de cuidados intensivos de neonatos), así como de la especie (C. glabrata es menos sensible que C. albicans).
Introduction: The increasing incidence of Candida yeasts infections and its hospital and community repercussion (vaginal thrush), as well as the will to acquire the knowledge of the new antifungal that were launched to the therapeutic store, have motivated us to identify that type of yeasts from different sources, as well as to study their behaviour against the antifungal, using commercial procedures with easy clinical application.
Materials and methods: An amount of 317 Candida yeasts were identified through commercial procedures (CHROMagar Candida® and Auxacolor®): 108 vaginals, 138 from ICU newborn children and 71 from ICU adults, while the antifungal drug susceptibilities was done to 199 of the isolated ones using another commercial procedure (Fungitest®).
Results and conclusions: Candida albicans is identified as the most frequent in both hospital and community samples (78.7 and 45.93%, respectively), followed by Candida glabrata (19.44 and 28.23%, respectively).
The sensitivity to amphotericin B and to 5-flucytosine was very high in every studied group, while sensitivity to imidazole derivatives depends on the samples source (lower sensitivity in the ICU newborn isolated ones) and the species (C. glabrata is less sensitive than C. albicans).
Introducción
La incidencia de infecciones producidas por levaduras, en concreto del género Candida, ha aumentado sensiblemente en los últimos años1, tanto en el grupo de infecciones comunitarias, entre ellas las vaginitis2, como en lo referente a colonizaciones e infecciones nosocomiales en unidades de cuidados intensivos neonatales3 y de adultos4. Asimismo, aunque Candida albicans sigue siendo la especie aislada con más frecuencia, otras, principalmente Candida glabrata, son cada vez más habituales como colonizadoras o patógenos5. Como consecuencia, se está produciendo un aumento paralelo en el uso de antifúngicos1, con la consiguiente aparición de resistencias a estos productos6,7. Todo esto hace necesario encontrar técnicas sencillas que permitan identificar correctamente las diferentes especies implicadas en este tipo de infecciones, así como conocer su grado de sensibilidad a diversos antifúngicos de uso común en clínica.
Los objetivos de este trabajo son:
1. Identificar una serie de aislamientos de levaduras de origen comunitario y nosocomial, inicialmente con el medio de cultivo diferencial CHROMagar Candida® (Becton Dickinson), y en algunos casos dudosos, con el método comercial de identificación Auxacolor® (Sanofi-Pasteur).
2. Estudiar la sensibilidad in vitro de estas levaduras a diferentes antifúngicos, mediante el método comercial Fungitest® (Sanofi-Pasteur).
Material y métodos
Procedencia de las muestras
Se han estudiado un total de 317 muestras ginecológicas en las que se aislaron levaduras del género Candida, que se recibieron sembradas en placas de agar Sabouraud + cloramfenicol + gentamicina, procedentes de diversos Servicios del Hospital Universitario La Paz, en el período comprendido entre septiembre de 1998 y marzo de 1999. De estas muestras, 108 procedían de consultas externas de ginecología, donde fueron tomadas a mujeres con candidiasis vaginal, por lo que son representativas de infecciones de origen comunitario. Otras 138 muestras fueron remitidas desde la unidad de cuidados intensivos (UCI) neonatales, y las 71 muestras restantes procedían de las unidades de cuidados intensivos, reanimación y quemados de adultos. Todas estas muestras nosocomiales fueron tomadas de frotis faríngeos y rectales, que se recogen de modo sistemático con el fin de detectar precozmente la colonización del tracto digestivo por levaduras y prevenir así la aparición de futuras infecciones en estos pacientes.
Identificación de las levaduras
Para la identificación de las distintas especies, todas las muestras se sembraron inicialmente en el medio de cultivo diferencial CHROMagar Candida®8, que se compone de agar, peptona, glucosa, cloramfenicol y una mezcla de sustratos cromogénicos, de modo que tras 48 h de incubación a 37 °C, según el sustrato que sea metabolizado, las colonias adquieren un color que resulta característico para cada especie (verde para C. albicans, morado para C. glabrata, azul para C. tropicalis y rosa pálido para C. krusei).
En 59 aislamientos (3 vaginales, 20 de UCI de adultos y 36 de UCI neonatal), de los 72 en los que el medio CHROMagar Candida® no aclaró de qué especie se trataba, se realizó una nueva identificación con el método Auxacolor®9, consistente en unas microplacas, cada una con 16 celdillas que contienen diferentes sustratos bioquímicos y un indicador de pH, de forma que cuando un determinado sustrato es metabolizado, cambia el color de la celdilla correspondiente. Según los cambios de color observados se asigna un código, que permite la identificación de la especie a través de una lista de códigos facilitada con el producto.
Sensibilidad in vitro a antifúngicos
Se realizó en 199 muestras (84 muestras vaginales, 67 de UCI de adultos y 48 de UCI neonatal) mediante el método Fungitest®10, que permite realizar el antifungigrama en una microplaca con 16 celdillas, cuatro de ellas correspondientes a controles positivo y negativo y el resto con los siguientes antifúngicos: 5-fluorocitosina, anfotericina B, fluconazol, itraconazol, ketoconazol y miconazol, cada uno de ellos a dos concentraciones diferentes, lo que permite clasificar a la levadura como sensible, resistente o con sensibilidad intermedia a cada uno de estos fármacos.
Análisis estadístico
Los resultados se introdujeron en una base de datos creada en el programa Access 97. El análisis estadístico ( * 2) se realizó con el Statcalc del programa Epi Info 6.
Resultados
Identificación de levaduras
Los resultados de la identificación con CHROMagar Candida® y Auxacolor® se recogen en las tablas 1 y 2, respectivamente. En la tabla 3 se exponen los resultados globales de identificación en la serie de levaduras estudiada.
En todos los grupos analizados la prevalencia más alta corresponde a C. albicans, siendo mayor en las muestras vaginales (78,7%) que en las nosocomiales (45,93%) (p < 0,00000001; * 2 = 31,12), y dentro de este segundo grupo, la prevalencia es superior en el grupo de adultos (53,52%) que en el de neonatos (42,03%), aunque la diferencia no es estadísticamente significativa.
En relación con las muestras vaginales, la prevalencia de C. albicans (78,7%) es significativamente más elevada que la de C. glabrata (19,44%) (p < 0,00000001; * 2 = 75,53), observándose también esta mayor prevalencia en las muestras hospitalarias (el 45,93 y el 28,23%, respectivamente), (p < 0,00018; * 2 = 14).
Un grupo de 13 aislamientos (12 de UCI neonatos y una vaginal) no fueron identificados con CHROMagar Candida®, y no fue posible realizar una identificación con Auxacolor®. Estos aislamientos, junto con uno procedente de la UCI de adultos que no pudo ser identificada por ninguno de los dos métodos utilizados, suponen un total de 14 aislamientos (4,41%) que han quedado sin identificar.
Sensibilidad in vitro a antifúngicos
De los 199 aislamientos a los que se realizó antifungigrama, 10 no fueron valorables por fallos en el control positivo, por lo que no se han incluido en los resultados. Igualmente, al calcular los porcentajes que aparecen en las tablas, no se han considerado una serie de fallos de la técnica que se encontraron con fluconazol (una muestra), itraconazol (3 muestras) y ketoconazol (25 muestras).
Las tablas 4 y 5 recogen los resultados de los antifungigramas realizados a las dos especies aisladas con más frecuencia, C. albicans y C. glabrata, respectivamente.
Con respecto a los aislados de C. albicans, se observa que globalmente los vaginales son más sensibles que los nosocomiales (p < 0,001; * 2 = 10,01), y dentro del marco hospitalario, los aislamientos de C. albicans procedentes de UCI adultos son más sensibles que las de UCI de neonatos (p < 0,0000001; * 2 = 25,10). La sensibilidad de C. albicans a anfotericina B es prácticamente del 100% en los tres grupos estudiados (del 100% en las vaginales y las de UCI de adultos, y del 94,87 en las UCI neonatales). Lo mismo ocurre con la sensibilidad a 5-fluorocitosina (94,64, 100 y 100%, respectivamente). En cambio, la sensibilidad a derivados imidazólicos de los aislamientos vaginales de C. albicans es superior a la de los nosocomiales (p < 0,000004; * 2 = 21,01). Dentro de este segundo grupo, se observa una mayor sensibilidad a derivados imidazólicos entre los aislados procedentes de UCI de adultos con respecto a los de UCI de neonatos (p < 0,00000001; * 2 = 37,67). Asimismo, se ha encontrado una mayor resistencia de los aislados de C. albicans procedentes de la UCI de neonatos a derivados imidazólicos en comparación con los otros dos antifúngicos (5-fluorocitosina y anfotericina B) (p < 0,0000005; * 2 = 25,42).
En relación con los aislados de C. glabrata se ha encontrado una sensibilidad a anfotericina B del 100% en los tres grupos estudiados. Los aislados procedentes de UCI de adultos son globalmente menos sensibles que los obtenidos en la UCI de neonatos (p < 0,024; * 2 = 5,03); esta menor sensibilidad está condicionada por una mayor resistencia a derivados imidazólicos (p < 0,021; * 2 = 5,33). Por otro lado, se observa que los aislados de C. glabrata son más resistentes a imidazólicos que a los otros dos antifúngicos, tanto en los aislados vaginales (p < 0,0001; * 2 = 14,03) como en los procedentes de UCI de adultos (p < 0,0000005; * 2 = 25,34) y UCI de neonatos (p < 0,0092; * 2 = 6,78).
Comparando la sensibilidad a antifúngicos de C. albicans con la de C. glabrata se observa, en el caso de los aislados vaginales, que la sensibilidad de C. albicans a derivados imidazólicos es superior a la de C. glabrata (p < 0,00000001; * 2 = 74,48). Lo mismo ocurre en el grupo de UCI de adultos (p < 0,00000001; * 2 = 66,14), pero no así en los aislados procedentes de UCI de neonatos, en los que no se han encontrado diferencias significativas entre estas dos especies.
Además, se realizó antifungigrama a un aislamiento de C. parapsilosis vaginal y en el grupo de adultos, a siete de C. tropicalis, dos de C. parapsilosis, uno de Candida lusitaniae, así como al aislamiento que no logró ser identificado.
Los aislamientos de C. tropicalis fueron sensibles a todos los fármacos (salvo uno que presentó sensibilidad intermedia a itraconazol y miconazol). Los tres aislados de C. parapsilosis, así como el de C. lusitaniae, fueron sensibles a todos los fármacos salvo a miconazol, frente al que demostraron sensibilidad intermedia. Por último, el aislamiento no identificado presentó resistencia a fluconazol e itraconazol, sensibilidad intermedia a ketoconazol y miconazol, y sólo fue sensible a 5-fluorocitosina y anfotericina B.
Discusión y conclusiones
Identificación de levaduras
Los resultados de este trabajo corroboran las tendencias que se planteaban al comienzo del mismo. En cuanto a resultados globales, C. albicans sigue siendo la especie más frecuentemente aislada, constituyendo más del 50% del total. Sin embargo, se ha producido un aumento muy notable en la frecuencia de C. glabrata (24,92%), de modo que incluso se ha duplicado con respecto a los resultados de una serie relativamente reciente de otro hospital de Madrid (el 12,5% en una serie de 200 levaduras)7. El tercer puesto de esta serie lo comparten C. parapsilosis y C. tropicalis, mientras que el resto de especies identificadas (C. lusitaniae, C. guillermondi y C. famata) resultan menos prevalentes.
Los resultados referentes a candidiasis vaginales se han comparado con una serie italiana de 38 aislados fúngicos2. C. albicans es la especie más frecuente en los dos trabajos, aunque en el nuestro el porcentaje es bastante superior (el 78,7 frente al 50%). El segundo lugar lo ocupa C. glabrata también en ambos trabajos, pero con un porcentaje algo más elevado en la serie italiana (el 31,58 frente al 19,44%). La aparición de C. parapsilosis resulta excepcional.
En cuanto al conjunto de muestras procedentes de la UCI de adultos, sólo disponemos de datos de otros hospitales españoles desde hace menos de 10 años4. Con respecto a este estudio, en el que se analizaron 47 aislados de levaduras, nuestros datos reflejan una ligera disminución en la prevalencia de C. albicans (el 60 frente al 53,52%), así como un notable incremento de C. glabrata (el 2 frente al 29,58%). C. tropicalis tiene una frecuencia similar (el 8 y el 9,86%, respectivamente), mientras que C. parapsilosis es menos frecuente en nuestra serie (17 frente al 22%). Sin embargo, al comparar las prevalencias de C. albicans y C. glabrata de nuestro trabajo con las de una serie norteamericana de 435 aislados fúngicos5, comprobamos que los resultados son muy similares (el 53,52 y el 56,6%, respectivamente, en el caso de C. albicans, y el 29,58 y el 26%, respectivamente, para C. glabrata), aunque resultan algo diferentes para el resto de especies aisladas.
En el grupo de levaduras procedentes de la UCI neonatal, llama la atención un descenso muy marcado de la frecuencia de C. albicans (42,03%) con respecto a una serie de tamaño más reducido (60 aislados fúngicos) del mismo servicio hace menos de 10 años, en la que se encontró una prevalencia del 95% para esta especie3. Paralelamente se ha producido un incremento en la prevalencia de otras especies, destacando C. glabrata (de un 2% en el citado estudio a un 27,54%), y C. parapsilosis (de un 3 a un 11,59%).
Respecto a los métodos utilizados para la identificación, cabe comentar que el agar Sabouraud es el medio más empleado en la práctica clínica para el cultivo de levaduras. Lleva incorporados varios antibióticos que inhiben el crecimiento de bacterias, pero tiene el inconveniente de no permitir distinguir unas especies de otras, ya que las características de las colonias pueden ser comunes a diferentes especies, e incluso una misma especie puede presentar colonias de diferente morfología. Por esta razón se utilizó el medio de cultivo diferencial CHROMagar Candida®8, que permitió discriminar C. albicans del resto de especies con mucha facilidad por el característico color verde de sus colonias, así como un elevado número de aislados de C. glabrata. Sin embargo, a pesar de los buenos resultados que se atribuyen a este medio para la identificación de otras especies, en especial C. tropicalis, en este estudio no se consiguieron identificar con un mínimo de seguridad, lo que atribuimos a la subjetividad que acompaña a la interpretación de colores cuando se utilizan este tipo de medios cromogénicos11. En cuanto al método Auxacolor®, es un sistema algo más laborioso, pero supone una óptima alternativa para la identificación de casos dudosos, ya que resulta más rápido, simple y fácil de interpretar que otros métodos comerciales de identificación. Además, la fiabilidad de este método es elevada9. No obstante, hay que tener en cuenta que ninguno de los dos métodos de identificación utilizados supera en fiabilidad a las laboriosas pruebas bioquímicas que permiten una identificación totalmente segura de las levaduras, pero los resultados obtenidos, aunque presuntivos, se pueden considerar muy aproximados a la realidad.
Sensibilidad in vitro a antifúngicos
La sensibilidad a anfotericina B y 5-fluorocitosina ha sido muy elevada en todos los grupos estudiados. No ha ocurrido lo mismo con los derivados imidazólicos, para los que se han encontrado resultados diferentes según la procedencia de las muestras y la especie de que se tratara. Así, en las muestras vaginales, C. albicans ha presentado una sensibilidad superior al 90% a estos fármacos, como era de esperar, al ser representativas de infecciones comunitarias. No obstante, la sensibilidad a itraconazol y ketoconazol no ha sido tan alta como en una serie de 40 aislamientos de C. albicans vaginales analizadas en otro hospital español12, en la que todas las cepas resultaron sensibles a estos dos fármacos, mientras que en nuestro trabajo el porcentaje de sensibilidad ha sido del 92,86% para los dos fármacos. Por el contrario, la sensibilidad a fluconazol sí ha sido superior en nuestro trabajo (98,21%), frente a un 90% en el estudio mencionado12.
Por otro lado, al comparar los porcentajes de sensibilidad a derivados imidazólicos de los aislados vaginales de C. albicans y C. glabrata de nuestra serie, se observa una sensibilidad significativamente inferior en las cepas de C. glabrata, diferencia que también se ha descrito en población italiana2.
Con respecto a las muestras nosocomiales, se han encontrado unos resultados cuanto menos llamativos en relación a C. albicans, ya que los aislamientos procedentes de la UCI de adultos han presentado una sensibilidad muy elevada a los cuatro derivados imidazólicos, comparable a los de origen comunitario, que contrasta claramente con los resultados obtenidos en el grupo de la UCI neonatal. Además, en este último grupo predominan las levaduras resistentes con respecto a las de sensibilidad intermedia, mientras que en el grupo de adultos no se ha encontrado ningún aislamiento resistente a los antifúngicos probados.
El conjunto de muestras de C. glabrata de la UCI de adultos también ha resultado ser significativamente menos sensible a derivados imidazólicos que los aislados de C. albicans de esta misma procedencia, pero esta diferencia no se ha podido demostrar en la UCI de neonatos.
El resto de especies a las que se realizó antifungigrama no parecen ser muy resistentes, salvo el aislamiento de la UCI de adultos que no se logró identificar y que únicamente resultó sensible a anfotericina B y 5-fluorocitosina.
En cuanto al método Fungitest®, consideramos que supone una gran ventaja frente a otros métodos tradicionales para la realización de antifungigramas, ya que resulta menos laborioso, más rápido y fácil de interpretar. Sin embargo, al compararlo con otros métodos de referencia, como la microdilución, presenta importantes discrepancias a la hora de clasificar las levaduras, con una tendencia a infravalorar casos resistentes10, por lo que sería recomendable una revisión del método con el fin de ajustar las concentraciones utilizadas a las concentraciones de referencia (NCCLS). Los resultados obtenidos, por tanto, deben ser interpretados con cautela, considerando las limitaciones del método, así como el tamaño reducido de alguno de los grupos analizados. Además, no hay que olvidar que se trata de un test de sensibilidad in vitro y, por tanto, sus resultados son únicamente orientativos para predecir la respuesta a los fármacos probados en la práctica clínica4.
Por tanto, las conclusiones que se pueden extraer de este trabajo son las siguientes:
1. La especie más frecuentemente aislada es C. albicans, seguida de C. glabrata en los tres grupos estudiados.
2. La sensibilidad a anfotericina B y 5-fluorocitosina es muy elevada en todos los aislamientos estudiados.
3. La sensibilidad a derivados imidazólicos es variable según la procedencia de la muestra (las de UCI de neonatos son menos sensibles), y la especie que se estudie (C. glabrata presenta menor sensibilidad que C. albicans).
Agradecimiento
Deseamos agradecer especialmente a Sebastián Muriel Herrero su inestimable ayuda en la creación de la base de datos, así como en su manejo, que ha facilitado enormemente la realización de todo el trabajo. Igualmente, a Juan José de la Cruz por su ayuda en todo lo referente al análisis estadístico de los datos. Finalmente, a mi todas aquellas personas que nos han apoyado durante todo este tiempo.
