La diarrea es el problema de salud más habitual entre los viajeros procedentes de países desarrollados que visitan países en desarrollo y/o regiones tropicales y semitropicales, diarrea que por este motivo se conoce como diarrea del viajero (DV)1. Más del 60% de los casos de DV están causados por agentes bacterianos, entre los cuales Escherichia coli diarreagénico (DEC) desempeña un papel principal2. En concreto, E.coli enterotoxigénico (ETEC) y E.coli enteroagregativo (EAEC) se consideran actualmente las causas más comunes de DV, y se estima que conjuntamente ambos patotipos causan cerca de la mitad de los casos de DV procedentes de África y Latinoamérica y más de la tercera parte de los casos de DV procedentes del Sudeste asiático1. Si bien su importancia relativa como agentes de DV es menor, otros patotipos como E.coli verotoxigénico (VTEC), E.coli enteropatogénico (EPEC), tanto típico (tEPEC) como atípico (aEPEC), y E.coli enteroinvasivo (EIEC) deben considerarse asimismo como opción diagnóstica en este tipo de infecciones3-5.
En noviembre de 2015 se remitió al Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Río Hortega una muestra de heces de una niña de 2años con antecedentes de viaje a Cuba. A los 3días de regresar del viaje la niña había manifestado una disminución de la consistencia y aumento de frecuencia de sus deposiciones, sin otra clínica asociada. La exploración física fue normal y no se requirieron pruebas diagnósticas adicionales, aparte del coprocultivo. El cuadro persistió durante 15días y se resolvió espontáneamente, con administración de probióticos como única medida terapéutica. En el coprocultivo se descartó la presencia de norovirus, adenovirus, astrovirus y rotavirus mediante inmunocromatografía (CerTest Biotec), y la de los enteropatógenos bacterianos más habituales —Salmonella, Shigella, Yersinia, Hafnia, Aeromonas, Plesiomonas y Campylobacter— mediante métodos microbiológicos convencionales. Teniendo en cuenta los antecedentes de viaje reciente, la muestra se remitió al Centro Nacional de Microbiología para el diagnóstico de infección por DEC. La detección de los distintos patotipos se realizó mediante PCR para los genes que codifican las verotoxinas de VTEC (vtx1, vtx2), la intimina de EPEC y VTEC (eae), el plásmido de virulencia de EAEC (aatA), las enterotoxinas de ETEC (eltA, estA) y las proteínas de invasión de EIEC (ipaH), así como la adhesina BFP (bfpA), que diferencia entre tEPEC y aEPEC, a partir de un coprocultivo de la muestra en agar MacConkey (Becton-Dickinson), y se procedió al aislamiento de los patotipos detectados6. Los aislados obtenidos se secuenciaron en la plataforma NextSeq 500 (Illumina). Para la extracción del ADN genómico se empleó el kit QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) y se generaron librerías «paired-end» mediante el kit Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina). A partir de las lecturas obtenidas se determinó el serotipo, secuenciotipo, perfil de genes de virulencia y perfil de genes de resistencia de cada aislado con las herramientas SerotypeFinder, MLST, VirulenceFinder y ResFinder, respectivamente, disponibles en el servidor Center for Genomic Epidemiology (https://cge.cbs.dtu.dk//services). Adicionalmente se estudió la sensibilidad antibiótica de los aislados mediante el método de difusión con discos, según criterios EUCAST y CLSI. El panel de antibióticos empleado incluyó ampicilina, cefotaxima, ceftazidima, amoxicilina-ácido clavulánico, ertapenem, meropenem, ciprofloxacino, pefloxacino, gentamicina, cloranfenicol, trimetoprim, ácido nalidíxico, tetraciclina, estreptomicina, kanamicina y sulfametoxazol.
La muestra resultó positiva simultáneamente para los patotipos VTEC, EAEC, ETEC y aEPEC, y se consiguió el aislamiento de las cuatro cepas DEC presentes, cuya caracterización completa se muestra en la tabla 1. Aunque las infecciones mixtas por cepas DEC de diferente patotipo, así como las coinfecciones de cepas DEC con otros enteropatógenos tanto bacterianos como víricos o parasitarios, no son infrecuentes, especialmente en casos de DV5,7,8, hasta donde sabemos este es el primer caso de infección por DEC en el que se haya demostrado la presencia de cuatro patotipos distintos. No obstante, pese a su presencia frecuente en niños con diarrea, la implicación clínica de algunos de estos patotipos, como EAEC o aEPEC, no está claramente establecida, habiéndose descrito asimismo en niños asintomáticos. Sin embargo, ETEC es un grupo patogénico con una clara implicación clínica, considerado como una causa principal de DV en adultos de países desarrollados y la causa más importante de diarrea infantil en países en vías de desarrollo9. En este sentido, la producción de la enterotoxina termoestable ST-Ia por parte de las cepas ETEC O8:H8 y VTEC/ETEC O100:H20 detectadas en este caso sería la principal responsable de las manifestaciones clínicas de la paciente. La producción adicional de la verotoxina 2e por parte de la cepa de patotipo híbrido VTEC/ETEC O100:H20 no supondría una mayor implicación clínica de esta cepa, al tratarse de una variante de verotoxina de escasa o nula patogenicidad para el hombre10.
Caracterización de las cuatro cepas de Escherichia coli diarreagénico aisladas a partir de la muestra de una paciente con diarrea del viajero procedente de Cuba
| Patotipo | Serotipoa | MLST | Perfil de genes de virulenciab | Sensibilidad antibiótica. Fenotipoc/genotipod de resistencia |
|---|---|---|---|---|
| VTEC/ETECe | O100:H20 | ST-2514 | vtx2A (subtipo e), vtx2B (subtipo e), sta1, stb, sepA | TET/tetA |
| EAEC | ONT:H19f | ST-746 | aatA, aggR, agg3A, agg3B, agg3C, agg3D, agg5A, astA,pic, pet, aap, mchB, mchC, mchF, capU, iha, aar, senB | Sensible |
| ETEC | O8:H8 | ST-4577 | sta1,stb, iss, sepA, lpfA, gad | Sensible |
| aEPEC | O109:H21 | ST-40 | eae, tir, cif, iss, nleA, nleB, espA, espB, espJ, lpfA, efa1, gad | Sensible |
Determinado a partir de las lecturas obtenidas de cada aislado con SerotypeFinder (https://cge.cbs.dtu.dk//services) seleccionando un porcentaje de identidad mínimo del 90%.
Determinado a partir de las lecturas obtenidas de cada aislado con VirulenceFinder (https://cge.cbs.dtu.dk//services) seleccionando un porcentaje de identidad mínimo del 90%. En negrita, genes de virulencia que definen el patotipo. sta1: gen que codifica la enterotoxina termoestable ST-Ia de E.coli.
Se empleó el método de difusión con discos en agar Mueller-Hinton (Becton-Dickinson) y las tablas de puntos de corte de EUCAST y CLSI para la interpretación del diámetro de las zonas de inhibición (versión 7.0, 2017 y M100-S25, respectivamente). TET, tetraciclina.
Conviene destacar que la caracterización completa de las cuatro cepas implicadas en este caso, realizada mediante secuenciación del genoma completo, no habría sido posible mediante técnicas convencionales, ante la imposibilidad de mantener una colección completa de antisueros para determinar el serotipo ni de ensayar mediante PCR toda la batería de genes de virulencia —y sus respectivas variantes— descritos hasta el momento, además de suponer un considerable ahorro de tiempo y trabajo efectivo en el laboratorio. Por otro lado, el análisis de las secuencias obtenidas fue rápido y sencillo, al tratarse de herramientas bioinformáticas de acceso libre y fácil manejo para un usuario no experto.
FinanciaciónEste estudio ha sido financiado a través del Fondo de Investigaciones Sanitarias (proyectos MPY-1042/14 y PI14CIII/00051).
Conflicto de interesesNada que declarar.
Agradecemos a Cristina García su excelente labor en la preparación de librerías genómicas y al personal de las Unidades de Genómica y Bioinformática del Centro Nacional de Microbiología su apoyo en la secuenciación de genomas completos y en el manejo de las secuencias obtenidas. Sergio Sánchez agradece al programa Miguel Servet del Fondo de Investigaciones Sanitarias la financiación de su contrato (CP13/00237).
