333
UTILIDAD DE LA TÉCNICA DE DISCOS PRÓXIMOS EN LA DETECCIÓN DE BLEA ASOCIADAS A OTRAS RESISTENCIAS
E. Varela, M.V. Martino, P. Ordóñez, D. Peñalver, M. Treviño y C. García-Riestra
Servicio de Microbiología. C.H.U. de Santiago de Compostela.
Introducción:El incremento de enterobacterias productoras de Bleas obliga a su detección por los laboratorios de Microbiología, tanto por sus implicaciones epidemiológicas como terapéuticas. En los últimos años, se ha tratado de poner a punto técnicas fáciles y asequibles. Sistemas automáticos, como el Vitek2 y su programa experto alertan ante un perfil de resistencias inusual. Un problema, observado con cierta frecuencia en nuestro hospital, surge cuando se asocian otros mecanismos de resistencias que enmascaran la Blea, como por ejemplo la impermeabilidad, alterando el patrón típico esperado.
Material y métodos: Aquellas cepas que presentaban CMI disminuidas o un patrón de resistencia típico, se sometieron a la prueba de sinergia de doble disco, con discos de cefotaxima, ceftazidima, cefepime, cepodoxima y aztreonan próximos a un disco de amoxi/clavulánico (AC). Esta técnica se realiza por duplicado, con una única diferencia, la distancia entre los discos fue 3 cm en una prueba y 1,5 cm en la otra. En total se estudiaron 142 E. coli y 23 Klebsiella spp. productoras de Bleas.
Resultados y conclusiones: E. coli (2,6%) y Klebsiella spp (3,14%) eran productoras de Blea, de las que 38 E. coli y 13 Klebsiella spp. se asociaban con resistencias a clavulánico. En estas últimas cepas, el incremento del halo en los discos de cefalosporinas no se detectó cuando la distancia entre ellos era 3 cm. Mientras que se encontraban signos de sinergia cuando los discos estaban situados a 1,5 cm. De no haber hecho por duplicado este test, en 51 cepas (28,3%) habría pasado desapercibida la presencia de BLEA.
334
PROYECTO GEIH-BLEE 2000: RELACIÓN CLONAL Y ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS DE INTERÉS CLÍNICO EN E. COLI PRODUCTOR DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) EN HOSPITALES ESPAÑOLES
J.R. Hernández, L. Martínez Martínez, R. Cantón, L. Romero, A. Pascual y GEIH (Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria)
HUV Macarena. Sevilla.
Objetivos: Estudiar la relación clonal y determinar la sensibilidad a antimicrobianos de interés clínico de 170 cepas de E. coli productores de BLEEs, aisladas en el estudio BLEE-GEIH.
Material y métodos: Se estudiaron 170 cepas de E. coli productoras de BLEE, aisladas de muestras clínicas entre marzo y junio de 2000, procedentes de 40 hospitales españoles.
Se realizó REP-PCR de todas las cepas utilizando el cebador REP-1. Las bandas obtenidas se analizaron en geles de agarosa al 2%. Se consideraron patrones distintos aquellos que tuvieran dos o más bandas diferentes. La producción de BLEE se consideró positiva cuando las CMIs de cefotaxima, ceftazidima y/o aztreonam disminuyeron 8 o más veces en presencia de ácido clavulánico (4 µg/ml).
Se determinó la CMI mediante microdilución en caldo (normas NCCLS) de los siguientes antibióticos: amikacina (AK), gentamicina (GN), ciprofloxacino (CIP), cotrimoxazol (SxT), imipenema (IMP), meropenema (MPM), cefoxitina (FOX), piperacilina-tazobactam (PTZ) y amoxicilina-clavulánico (AMC).
Resultados: Se obtuvieron 114 patrones diferentes de REP-PCR. Las CMI50 y CMI90 fueron las siguientes: AK: 2 y 16; GN: 1 y 128; CIP: 8 y 128; SxT: 304 y > 608; IMP: 0,125 y 0,25; MPM: ¾ 0,06 y ¾ 0,06; PTZ: 2 y 256; FOX: 4 y 32; AMC: 16 y 64. Los porcentajes de cepas sensibles a estos antimicrobianos fueron: AK: 92%; GN: 65%; CIP: 37%; SxT: 38%; IMP: 100%; MPM: 100%; FOX: 75%; PTZ: 77% y AMC: 40%.
Conclusiones:Existe una gran variabilidad genética en nuestro país entre los E. coli productores de BLEE.
Las mayores frecuencias de cepas sensibles se obtuvieron con las carbapenemas (100%) seguidas de AK, PTZ, FOX, GN, AMC, SxT y CIP.
335
PROYECTO GEIH-BLEE 2000: RELACIÓN CLONAL Y ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS DE INTERÉS CLÍNICO EN K. PNEUMONIAE PRODUCTORA DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) EN HOSPITALES ESPAÑOLES
J.R. Hernández, L. Martínez Martínez, R. Cantón, L. Romero, A. Pascual y GEIH (Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria)
HUV Macarena. Sevilla.
Objetivos: Estudiar la relación clonal y determinar la sensibilidad a antimicrobianos de interés clínico de 70 cepas de K. pneumoniae productoras de BLEEs, aisladas en el estudio BLEE-GEIH.
Material y métodos: Se estudiaron 70 cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, aisladas de muestras clínicas entre marzo y junio de 2000, procedentes de 40 hospitales españoles.
Se realizó REP-PCR de todas las cepas utilizando el cebador REP-1. Las bandas obtenidas se analizaron en geles de agarosa al 2%. Se consideraron patrones distintos aquellos que tuvieran dos o más bandas diferentes. La producción de BLEE se consideró positiva cuando las CMIs de cefotaxima, ceftazidima y/o aztreonam disminuyeron 8 o más veces en presencia de ácido clavulánico (4 µg/ml).
Se determinó la CMI mediante microdilución en caldo (normas NCCLS) de los siguientes antimicrobianos: amikacina (AK), gentamicina (GN), ciprofloxacino (CIP), cotrimoxazol (SxT), imipenem (IMP), meropenem (MPM), cefoxitina (FOX), piperacilina-tazobactam (PTZ) y amoxicilina-clavulánico (AMC).
Resultados: Se obtuvieron 19 patrones diferentes de REP-PCR.
Las CMI50 y CMI90 fueron las siguientes: AK: 1 y 8; GN: 32 y > 128; CIP: 0,25 y 2; SxT: 19 y 608; IMP: 0,25 y 0,5; MPM: <=0,6 y <=0,6; PTZ: 4 y > 1024; FOX: 4 y 16; AMC: 16 y 64. Los porcentajes de cepas sensibles a estos antimicrobianos fueron: AK: 90%; GN: 33%; CIP: 86%; SxT: 51%; IMP: 100%; MPM: 100%; FOX: 87%; PTZ: 64% y AMC: 24%.
Conclusiones:Existe una moderada variabilidad genética en nuestro país entre las K. pneumoniae productoras de BLEE.
Las mayores frecuencias de cepas sensibles se obtuvieron con las carbapenemas (100%) seguidas de AK, FOX, CIP, PTZ, SxT, GN y AMC.
336
EVOLUCIÓN DE LOS AISLAMIENTOS DE E. COLI PRODUCTOR DE ß-LACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO EN LOS HH.UU. V. DEL ROCÍO
M. Ruiz, A.C. Llanos, L. A. Arroyo y J. Aznar
Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla.
Objetivo: determinar el número de aislamientos de Escherichia coli productor de ß-lactamasas de espectro ampliado (BLEA) y su distribución en los H.H.U.U. Virgen del Rocío en los últimos cuatro años (1998-15 noviembre 2001).
Métodos: la identificación y pruebas de sensibilidad se realizó mediante el sistema automatizado MicroScan® (Dade-Berhring); la comprobación de resultados mediante el cociente entre las CMI de ceftazidima y ceftazidima/ácido clavulánico obtenidas con el método de difusión E-test® (valor >= 8).
Resultados: De un total de 8.562 aislamientos de E. coli, 134 (1,5%) fueron productores de BLEA. La distribución por hospitales y años se muestra en la tabla 1. Asimismo, se estudió la distribución por servicios, encontrándose la mayor tasa de aislamientos en el servicio de cirugía (9,7%) y la U.C.I. (7,4%) del Hospital General.
Conclusiones: a) El número de cepas aisladas en el Hospital General está aumentando de forma significativa (p < 0,01) en los 2 últimos años; b) Hay diferencia significativa (p < 0,01) entre los aislamientos de la población adulta y de la población infantil durante el año 2001; c) La tasa máxima de aislamientos fue en el año 2000.
337
RELACIÓN CLONAL Y DEMOGRAFÍA DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI Y KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE EXPECTRO EXTENDIDO (BLEE) EN EL PERÍODO 1995-2001 EN EL ÁREA NORTE DE SEVILLA
L. Romero, A. Pascual, L. Martínez Martínez, J.R. Hernández, M.D. Navarro y J. Rodríguez Baño
Hospital Universitario Virgen Macarena.
Objetivos: Estudiar la variabilidad en los patrones genotípicos de cepas de E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEE, aisladas en el área hospitalaria Virgen Macarena (Sevilla), y analizar los datos demográficos correspondientes a estas cepas.
Material: Se han evaluado 224 cepas aisladas de muestras clínicas. Se realizó REP-PCR a 120 cepas de E. coli y a 104 cepas de K. pneumoniae. Se utilizó el cebador REP-1 y se analizó el patrón de bandas de ADN en un gel de agarosa al 1,5%.
Resultados: Se obtuvieron 94 patrones distintos de REP-PCR en las cepas de E. coli y 3 patrones en las cepas de K. pneumoniae. Las frecuencias de E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEE (cepas BLEE (+)/cepas totales) en nuestra área hospitalaria fue: 0,04% y 5,17% (1996), 0,15% y 6,49% (1997), 0,05% y 2,54% (1998), 0,39% y 0,20% (1999), 1,48% y 1,66% (2000) y 2,16% y 1,93% (2001). El 69% de las cepas eran intrahospitalarias y el 31% extrahospitalarias. No hubo diferencias en la distribución de cepas por sexos. La edad media fue de 67 años (rango < 1 año-99 años). Las muestras clínicas de donde se aislaron cepas BLEE (+) con más frecuencia fueron orina (55%) y exudado de herida (19%). El 31% de las muestras eran extrahospitalarias, el 42% de Medicina Interna (MI), el 11% de UCI y el 16% de especialidades médico quirúrgicas.
Conclusión:Existe gran variabilidad genotípica en las cepas de E. coli y gran uniformidad en las de K. pneumoniae.
La frecuencia de E. coli con BLEE ha ido aumentando en los años de estudio mientras que ha disminuido la de K. pneumoniae. La mayoría de las cepas BLEE (+) se aíslan en orina y proceden de Medicina Interna. Un 30% de las cepas fueron de origen extrahospitalario.
338
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASA DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE)
J. Romero, F.J. Escabias, E. Manrique, M. García, M.L. García, J. Rodríguez Granger, C. Miranda y M. de la Rosa
Servicio de Microbiología. H.U. Virgen de las Nieves. Granada.
Objetivos: Conocer la procedencia de enterobacterias productoras de BLEE así como la importancia de su identificación para la modificación del informe de susceptibilidad antimicrobiana.
Métodos:La identificación y la susceptibilidad se realizó por sistema comercial (WIDER). La presencia de BLEE se sospechó (según las recomendaciones del NCCLS) en los casos de CMI de Cefotaxima o Ceftazidima >= 2 y se comprobó con las tiras de E-test ESBL y mediante difusión en agar con doble disco.
Resultados: Desde julio 2000 a octubre de 2001, se han aislado 18 cepas de enterobacterias productoras de BLEE. Todas se identificaron como E. coli. Las muestras de las que se aislaron fueron: sangre 4, exudado de herida 6, líquido peritoneal 3, aspirado traqueal 2, exudado vaginal 1, orina 1 y catéter arterial 1. Los servicios de los que procedían fueron: Cirugía 5, UCI 3, Digestivo 2, Medicina Interna 2, Nefrología 2, Hematología 1, Urología 1, Obstetricia 1 y 1 Consulta externa. Según los puntos de corte del NCCLS (Sensible: CMI ¾ 8) 5/18 cepas (27,7%) se categorizaron como sensibles a cefotaxima, 10/18 (55,5%) como sensibles a ceftazidima, y 8/16 (50,0%) como sensibles a Cefepime. Tuvimos acceso a las historias clínicas de 7 pacientes, 6 de ellos, habían sido sometidos a intervenciones quirúrgicas y habían sido tratados, previamente al aislamiento, con múltiples antibióticos entre los que se incluían cefalosporinas de 2ª y 3ª generación. Cinco pacientes estaban tratados en el momento del aislamiento con este grupo de antimicrobianos.
Conclusiones: Un alto porcentaje de aislamientos de E. coli productores de BLEE se hubieran considerado sensibles a alguna cefalosporina de 3ª generación de no haber realizado estudios de detección de BLEE. Los aislamientos de E. coli productor de BLEE en nuestro hospital corresponden principalmente a pacientes multitratados, sobre todo con cefalosporinas de 2ª y 3ª generación.
339
DETECCIÓN DE B-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO EN E. COLI Y K. PNEUMONIAE DE ORIGEN HOSPITALARIO Y AMBULATORIO
A. Fleites, P. Venero, I. Cahue, G. Sierra, M. del Castillo y M.J. Santos
Servicio de Microbiología y Enfermedades Infecciosas. Hospital Central de Asturias (Hospital General). Oviedo.
Objetivos: Determinar la frecuencia de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en E. coli y K. pneumoniae de muestras clínicas procedentes de un hospital general (H) y 31 centros de atención primaria (A).
Métodos: De enero-2000 a octubre-2001 se estudió la sensibilidad, por microdilución (Sensititre), de 2.752 cepas consecutivas de E. coli (1820 H y 932 A) y 219 de K. pneumoniae (136 H y 83 A) aisladas en 2057 y 196 pacientes respectivamente. Se usaron, como métodos de cribado inicial sistemático, valores de CMI > 1 µg/ml para cefotaxima y ceftazidima y el test de sinergia de doble difusión con discos. La confirmación fenotípica se realizó por difusión con discos de cefotaxima y ceftazidima con y sin clavulánico (NCCLS M100-S9) y tiras de Etest ESBL con los mismos antimicrobianos.
Resultados: No se determinó ninguna cepa de K. pneumoniae productora de BLEE y se detectaron 25 cepas de E. coli en 25 pacientes adultos (19 mujeres y 6 varones). En A, se obtuvieron 8 cepas que representaron el 0,85% de los aislados, 0,87% de los urocultivos por E. coli y 0,99% de los pacientes. En H, se detectaron 17, siendo el 0,93% de los aislados y el 1,3% de los pacientes; las muestras fueron: 11 (0,79%) en orinas, 2 en sangre y 4 en otras; los servicios: urología 4, nefrología 3, UVI 3, medicina interna 2, oncología 2 y 3 en otros. El rango de CMI para cefotaxima fue de 4->16 µg/ml y para ceftazidima ¾ 0,5->32. Se obtuvieron 2 patrones fenotípicos: a) 20 cepas con afectación de cefotaxima y sensibilidad a ceftazidima (rango ¾ 0,5-2 µg/ml) b) 5 cepas que presentaron resistencia elevada (CMI ¾ 16 µg/ml) a cefotaxima, ceftazidima, cefepima y aztreonam . Todos los aislados fueron sensibles a cefoxitina (CMI ¾ 8 µ/ml).
Conclusiones: La frecuencia de E. coli productor de BLEE es baja. Las cepas están distribuidas en el ámbito hospitalario y en la comunidad. Debe mantenerse la vigilancia y determinar la relevancia clínica-terapéutica de estos casos.
340
INCIDENCIA DE ß-LACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO EN ENTEROBACTERIAS AISLADAS DE HECES
B. Mirelis, E. Miró, L. Gómez, A. García, F. Navarro y G. Prats
Servei de Microbiologia. Hospital de Sant Pau. Barcelona.
Objetivos: Conocer la incidencia y tipo de ß-lactamasas de espectro ampliado (BLEA) en las cepas de enterobacterias aisladas de las heces de pacientes de procedencia intrahospitalaria y extrahospitalaria.
Métodos: En el período comprendido entre febrero y mayo de 2001 se procesaron 1183 muestras de heces de pacientes con gastroenteritis para detección de enteropatógenos; 707 muestras procedían de pacientes extrahospitalarios y 476 de intrahospitalarios. Toda enterobacteria crecida en el medio CCDA (charcoal-cefoperazone-deoxicholate agar) selectivo para Campylobacter, fue seleccionada mediante el test de sinergia para estudiar si era portadora de una BLEA. Se estudió la sensibilidad a 24 antimicrobianos por técnica de difusión. Las ß-lactamasas se caracterizaron mediente isoelectroenfoque, PCR para la amplificación del gen implicado y secuenciación. Asimismo, se determinó el biotipo de las cepas.
Resultados: De las 1183 muestras procesadas se aisló un total de 28 cepas (2,4%) portadoras de BLEA, 27 de E. coli y una de P. mirabilis. El 2,1% (15/707) pertenecían a pacientes de la comunidad y el 2,7% (13/476) a pacientes intrahospitalarios. Las ß-lactamasas detectadas fueron: CTX-M-9: 10 (35,7%), SHV-12: 3 (10,7%), CTX-M-1: 1 (3,6%), CTX-M-3: 1 (3,6%), CTX-M-9 + TEM-1: 8 (28,6%), CTX-M-15 + TEM-1: 1 (3,6%), CTX-M + TEM-1: 1 (3,6%), 2 cepas de pI de 7,6 y 8,4 respectivamente pendientes de caracterizar y 1 cepa de P. mirabilis con una BLEA de pI 5,4.
Conclusión:La presencia de cepas con BLEA en el tubo digestivo de pacientes con enteritis es, a pesar de las limitaciones del medio utilizado, significativamente superior a la detectada en muestras clínicas (2,4% vs 0,6%; p < 0,05); no mostrando diferencias significativas entre las cepas intrahospitalarias y extrahospitalarias (p > 0,4). Así pues, la incidencia de BLEA en los pacientes extrahospitalarios es sin duda un reflejo de lo que ocurre en la comunidad, siendo la ß-lactamasa más frecuentemente detectada la CTX-M-9.
341
INCIDENCIA DE CEPAS PORTADORAS DE ß-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEEs) EN LOS HOSPITALES COMARCALES DE CATALAUNYA (1996-1998)
M. Sierra1, J. Lite2, A. Gasós3, C. Ardanuy4 y Grupo de Microbiólogos de Hospitales Comarcales de Cataluña
1Hospital de Barcelona SCIAS, 2Hospital Mutua de Terrassa, 3Hospital de Sant Joan de Déu, 4Hospital de Bellvitge.
Objetivos: Conocer la incidencia de BLEEs en las cepas Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Salmonella spp aisladas en 13 hospitales comarcales de Catalunya. Caracterización de las BLEEs.
Material y método: Se estudiaron prospectivamente todas las cepas de E. coli, K. pneumoniae y Salmonella spp. aisladas en 13 hospitales durante un periodo de tres años (1996-1998). En todas ellas se efectuó un cribado para la detección de BLEEs (método del doble disco o patrón de resistencia compatible). Las cepas con cribado positivo se remitieron a un laboratorio de referencia donde se realizó el doble disco y/o E-test-ESBL para confirmación. A las cepas consideradas BLEE positiva se efectuó el estudio de las ß-lactamasas por determinación del punto isoeléctrico (una por paciente).
Resultados: Durante el periodo de estudio se aislaron 98.857 cepas de enterobacterias de las cuales 57.547 (58%) corresponden la cepas de E. coli, 4.744 (4,8%) a K. pneumoniae y 3.601 (3,6%) a Salmonella spp. El 92,2% de las cepas enviadas al laboratorio de referencia se confirmaron como BLEE. El número de cepas portadoras de BLEEs fue de (No cepas/No pacientes): E. coli (81/74), K. pneumoniae (7/6) y Salmonella spp. (16/13), con una incidencia de 0,14%, 0,15% y 0,44% respectivamente. En el 85,4% de las cepas de E. coli y el 100% de las de Salmonella spp. se detectaron dos ß-lactamasas, una de pI 5.4 compatible con TEM-1 y otra de pI ~ 7,9 compatible con una CTX-M. En K. pneumoniae todas las cepas presentaron ß-lactamasas compatibles con la familia SHV.
Conclusiones:Se ha encontrado una baja incidencia de BLEEs en las especies de enterobacterias estudiadas. La técnica del doble disco se muestra como un método sencillo y fiable para su detección. Las BLEEs de E. coli y Salmonella spp son preferentemente tipo CTX-M, mientras que en K. pneumoniae son SHV.
342
COLONIZACIÓN PERSISTENTE POR KLEBSIELLA PNEUMONIAE (Kp) PRODUCTORA DE ß-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
C. Ardanuy, M.A. Domínguez, S. Merino, L. Izquierdo, J. Liñares y J.M. Tomas
Microbiología. Hospital de Bellvitge. Universidad Barcelona.
Durante un brote nosocomial causado por Kp productora de ß-lactamasa de espectro extendido (BLEE), un paciente adquirió colonización urinaria por la cepa epidémica (dic 93). Dos meses después desarrolló infección urinaria y bacteriemia. Al alta, los cultivos de orina y sangre fueron negativos (mar 94). Desde entonces se ha detectado Kp-BLEE en 22 cultivos de orina de control durante un periodo de 4 años. Se seleccionaron 7 aislamientos: uno de sangre (feb 94) y 6 de orina (dic 93, may 95, oct 95, mar 96, dic 96 y mar 98).
Objetivos y métodos: 1) Establecer la relación clonal de los aislamientos por electroforesis en campo pulsátil (ECP) del DNA cromosómico. 2) Estudiar las BLEE por isoelectroenfoque, conjugación y caracterización de la familia (TEM o SHV) por PCR. 3) Estudiar las diferentes moléculas de superficie implicadas en la colonización persistente por Kp-BLEE.).
Resultados: Se encontró el mismo patrón de resistencia antibiótica en todos los aislamientos. Todas las cepas producían una BLEE de pI 8.2 transferible por conjugación, clasificada como SHV por PCR. Todas presentaron el mismo ECP, idéntico al de la cepa epidémica. El aislamiento de sangre mostró el antígeno O2a del lipopolisacárido (LPS) y el K81 de polisacárido capsular. En 2 aislamientos urinarios posteriores no se detectó el antígeno O2a LPS ni por geles ni por Western blott usando anticuerpos específicos anti-O2a. Sin embargo, se detectó la presencia del gen wb, que codifica la biosíntesis del antígeno O2a LPS por sonda de DNA; también se recuperó el antígeno O2a LPS de estos aislamientos cuando se hicieron crecer en suero no inmune. Los aislamientos de orina eran mucho más capsulados que el de sangre.
Conclusión:Este estudio sugiere que la colonización urinaria persistente por Kp-BLEE se relaciona con la ausencia del antígeno O2a LPS y con un incremento en la capsulación. Los aislamientos de Kp-BLEE pertenecen a un clon altamente estable durante un período de 4 años, con una producción de BLEE estable pero con disminución de la capacidad invasiva.
343
MULTIRRESISTENCIA ANTIBIÓTICA EN CEPAS DE E. COLI PRODUCTORAS DE BLEAs EN EL ÁREA SANITARIA DE SANTIAGO
M.V. Martino, C. García-Riestra, P. Ordoñez, E. Varela, A. Aguilera, A. G.-Zabarte y B. Regueiro
Servicio Microbiología. C.H.U. de Santiago.
Introducción:Las Bleas son enzimas codificadas por plásmidos, estos pueden además transportar otros genes que confieren resistencia a distintos grupos de antimicrobianos. También pueden confluir resistencias mediadas cromosómicamente a agentes como las quinolonas. Por último, la resistencia a ß-láctamicos puede deberse a la producción de Blea simultáneamente con la hiperproducción de cefalosporinasas o la disminución de la permeabilidad. Nuestro objetivo fue evaluar la asociación de resistencias que presenta E. coli BLEA+ en nuestra Área Sanitaria.
Material y métodos: Se estudiaron 5500 cepas de E. coli aisladas en los últimos 22 meses. La detección de BLEA se realizó utilizando los criterios de la NCCLS para cefalosporinas de 3ª generación y aztreonam y posterior confirmación con la técnica de sinergia con doble disco descrita por Jarlier o su modificación en el caso resistencia concomitante a ácido clavulánico. Las resistencias a los otros antimicrobianos se detectaron por la CMI en Vitek2 aplicando los criterios de la NCCLS.
Resultados y conclusiones: Del total de las 5.500 cepas estudiadas 142 (2,5%) producían BLEAs (B).
En 32 (22,5%) no apareció ninguna otra resistencia. En las restantes se encontraron resistencias a fluorquinolonas (F), cotrimoxazol (C), aminglicósidos (A) y amoxi/clavulánico (X), distribuidas como sigue: B+F = 24, B+C = 19, B+X = 6, B+F+C = 12, B+F+X = 7, B+F+A = 3, B+C+A = 2, B+X+A = 2, B+F+C+X = 16, B+F+C+A = 5, B+F+X+A = 4, B+C+X+A = 1, B+F+C+X+A = 9. F total fue de 56,3% para BLEA+(B+) y del 16,4% para todos los E. coli (TC), C 36,6% en B+ y 25,5% en TC, X 26,8% en B+ y 12,3% en TC y A 18,3% en B+ y 6,6% en TC. Existe un porcentaje significativamente mayor de resistencias en aislamientos productores de BLEAs, lo que añade aún mayor interés epidemiológico a estas cepas.
344
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE BETALACTAMASA DE ESPECTRO AMPLIADO (ESBL)
M. L. López-Yeste*, M. Navía**, J. Ruiz**, J. Vila**, J. Lite* y E. Martínez*
*Servei de Microbiologia, Hospital Mútua de Terrassa; **Servei de Microbiologia, Hospital Clínic de Barcelona.
Objetivo: Caracterizar las cepas de Escherichia coli productoras de betalactama de espectro ampliado (ESBL) aisladas en el Servicio de Microbiología del Hospital Mutua de Terrassa de enero de 2000 a marzo de 2001.
Material y métodos: La identificación al nivel de especie se realizó por técnicas convencionales. La sensibilidad a los antibióticos se estudió mediante microdilución con la tarjeta AST-N010 (VITEK-TWO, bioMérieux). La presencia de ESBL se detectó por la técnica de doble disco con amoxicilina/ácido clavulánico, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima y aztreonam y por E-test de ceftazidima y ceftazidima/ácido clavulánico. Las ESBL se confirmaron y caracterizaron mediante PCR, estudio del punto isoeléctrico (pI) y secuenciación. Para determinar si las cepas tenían o no un origen clonal, se realizó REP-PCR.
Resultados: Se aislaron 17 cepas de Escherichia coli productoras de ESBL (0.47% del total de cepas de Escherichia coli aisladas y 0.32% de las enterobacterias), seis de ellas en muestras de pacientes hospitalizados. Las cepas se aislaron en 13 muestras de orina, 3 de sangre y 1 de biopsia pleural. Diez cepas producían TEM-70, dos TEM-54, tres SHV5a y dos producían dos tipos de betalactamasa: la primera TEM-70 más SHV5a y la segunda SHV5a y una betalactamasa del grupo TEM con pI 5.2 pero que no se pudo afiliar por secuenciación.
Conclusiones: En nuestro centro la incidencia de cepas de Escherichia coli productoras de betalactamasa de espectro ampliado es baja (0,47% de E. coli), no habiéndose producido ningún brote epidémico. Si bien la mayoría son del tipo TEM-70 (58,8%), el estudio molecular determinó que no tenían un origen clonal.
345
PREVALENCIA Y SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE KLEBSIELLA SPP. Y E. COLI PORTADORES DE ß-LACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO
M.M.O. Pérez, M. Pérez, M. Carulla, C. Rubio, A. Jardí y J. Zaragoza
Servicio Análisis Clínicos. Hospital de Tortosa Verge de la Cinta.
Objetivo: Estimar la prevalencia de ß-lactamasas plasmídicas de espectro ampliado (ßLPEA) de clase A en las cepas de E. coli y Klebsiella spp. aisladas en nuestro laboratorio y estudiar su perfil de sensibilidad antimicrobiana.
Material y métodos: Se analizaron los 3800 aislados de E. coli, 281 de K. pneumoniae y 173 de K. oxytoca recuperados en nuestro laboratorio entre junio de 1998 y septiembre de 2001. La identificación y pruebas de sensibilidad in vitro se realizaron mediante los paneles WIDER 6W, que incluyen cefotaxima (CTX) y ceftazidima (CTZ) como ß-lactámicos (ßL) de amplio espectro y dos pocillos de CTZ + clavulánico (1/4 y 8/4 µg/ml) destinados al cribado de ßLPEA. En aquellas cepas con CMI a CTX y/o CTZ superior a 1 µg/ml y cuya CMI a cefoxitina fue ¾ 8 µg/ml, se efectuó la prueba de doble difusión con discos para detección de ßLPEA inhibidas por clavulánico.
Resultados:a) E. coli: La prueba de doble difusión con discos fue positiva en 38 aislados (0,84%), que correspondían a 24 cepas, sin relación epidemiológica aparente, procedentes de otros tantos pacientes (10 de ellos hospitalizados y el resto ambulatorios). Se obtuvieron CMI > 1 para CTX y CTZ en 12 cepas, sólo para CTX en 10 cepas y sólo para CTZ en otras dos. En 3 cepas la CMI de CTX y CTZ fue ¾ 8. Las resistencias a ciprofloxacino (CIP), gentamicina (GEN), tobramicina (TOB) y clotrimoxazol (CLO) fueron del 75, 17, 25 y 75%. En 19 casos (79,2%) la resistencia a ßL se acompañó de resistencia a otros antimicrobianos, siendo las asociaciones más frecuentes ßL+CIP+CLO y ßL+CIP+CLO+ GEN+TOB. b) Klebsiella spp: Se detectó la presencia de ßLPEA en dos cepas de K. oxytoca (1,15%) y una de K. pneumoniae (0,36%), una de ellas resistente a CIP, procedentes de un paciente hospitalizado y de dos ambulatorios. Las CMI a CTX y CTZ de las tres cepas fue > 8 y 2 µg/ml, < 0,12 y 4 µg/ml y 8 y 4 µg/ml respectivamente.
Conclusiones: La prevalencia de ßLPEA en nuestro medio es muy baja. La producción de ßLPEA se asocia con frecuencia a resistencia a otros antimicrobianos. El 18,5% (5/27) de las cepas con ßLPEA se mostraron sensibles a CTX y CTZ según los criterios NCCLS (CMI ¾ 8). En nuestra serie, el cribado con CTZ+clavulánico resultó de limitada utilidad, ya que no aportó ninguna información en el 41,7% de las cepas de E. coli que albergaban ßLPEA, al tratarse de enzimas con escasa actividad frente a CTZ (CMI ¾ 1).
346
CAMBIO EPIDEMIOLÓGICO EN LAS ß-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO. HOSP. RAMÓN Y CAJAL (1988-2000): DE SHV A CTX-M
T.M. Coque, M.C. Varela, A. Oliver, M. Morosini, F. Baquero y R. Cantón
Servicio de Microbiología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Introducción:Desde el hallazgo de las BLEE en 1983 se han descrito diferentes familias de estas enzimas. En Europa, las de tipo SVH han sido predominantes, si bien en la actualidad comienzan a ser frecuentas nuevas variantes de tipo TEM y CTX-M.
Objetivo: Investigar la prevalencia y evolución de todos los microorganismos productores de BLEE aislados en nuestro hospital desde su aparición en 1988.
Métodos:Entre 1988 y 2000 se aislaron 150 K. Pneumoniae (Kp), 104 E. coli (Ec), 24 Salmonella s. Othmarschen (Sa) y 15 Enterobacter spp. (Ent) procedentes de 58, 67, 8 y 14 pacientes, respectivamente. Para estudios de clonalidad (PFGE o AP-PCR) se seleccionó un aislado por paciente o más de uno cuando se observaron diferentes pls. La caracterización de las BLEE se realizó por pl, PCR y/o secuenciación.
Resultados: Se detectaron 97 clones (31 Kp, 57 Ec, 8 Ent y 1 Sa) correspondientes a 147 pacientes. La distribución de BLEE por clones fue: TEM-4 (5 Kp), TEM-27 (1 Ec, 1 Sa, 1 Ent), TEM-24 (1 Ent), TEM-pl = 5,9 (11 Ec), SHV-2 (12 Kp), SHV-5 (1 Kp), SHV-pl = 7,6 (8 Ec), SVH-pl 8,2 (3 Ec); CTX-M-9 (1 Kp, 23 Ec), CTX-M-10 (12 Kp, 5 Ec, 6 Ent), BLEE-pl 6,5 (1 Ec) y no determinadas (5 Ec). La prevalencia de los tipos TEM, SHV y CTX-M fue del 30%, 46% y 24% de 1987 a 1995; 28%, 18% y 53% de 1996 a 1998 y del 13%, 13% y 76% de 1999 a 2000. 72% de los clones se detectaron en un solo paciente, (n = 57/79); 13% (n = 10/79) en 2 pacientes; 6% (n = 5/79) en 3 pacientes y sólo un 9% (n = 7/79) en más de 4 pacientes. Los microorganismos productores de SHV y TEM fueron aislados frecuentemente en pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos a diferencia de los productores de CTX-M.
Conclusiones:La distribución de BLEE ha cambiado drásticamente durante el período de estudio, siendo las de tipo CTX-M las BLEE predominante en nuestra institución. Su aislamiento en pacientes no ingresados en áreas de alto riesgo sugiere la existencia de un reservorio ambiental muy extendido responsable de múltiples introducciones en el ámbito hospitalario.
347
IDENTIFICACIÓN Y DISEMINACIÓN DE UNA ß-LACTAMASA DEL TIPO CTX-M-14 EN EL NOROESTE DE ESPAÑA
G. Bou, M. Cartelle, M. Tomás, E. Gil, D. Velasco, A. Beceiro, D. Canle y A. Guerrero
Servicio de Microbiología. Complejo Hospitalario Juan Canalejo. A Coruña.
Objetivos: Caracterizar molecularmente el mecanismo de resistencia de una cepa clínica de Escherichia coli con alto nivel de resistencia a cefotaxima (CTX) y determinar el grado de dispersión del gen en otras cepas de enterobacterias en un área sanitaria de 516.000 habitantes.
Métodos:25 cepas de Escherichia coli y 3 de Klebsiella pneumoniae aisladas en el 2001 portadoras de beta-lactamasas de espectro extendido (BLEA) causantes de patología infecciosa fueron seleccionadas. De entre ellas, 13 Escherichia coli presentaban un fenotipo de actividad cefotaximasa. La clonación del gen tipo CTX-M-14 se efectuó por técnicas de restricción-selección positiva. La detección del gen CTX-M-14 se realizó por PCR con los oligonucleótidos 5´- AACACGGATTGACCGTATTG y 5´- TTACAGCCCTTCGGCGAT, de la zona promotora y 3´ del gen, respectivamente. Análisis de RFLPs plasmídicos, tipación por REP-PCR y determinación de pI se efectuaron por métodos convencionales. CMIs se efectuaron por E- test.
Resultados: Se clonó un gen del tipo CTX-M-14 en un plásmido de una cepa de Escherichia coli causante de infección urinaria. CMIs (mg/L) de un Escherichia coli sensible transformado con el gen CTX-M-14, Ceftazidima, 4; CTX >= 128; y Aztreonam, 64. Por técnicas de PCR, secuenciación de ADN y análisis de pI se demuestra la presencia del mismo gen en otras 12 cepas de Escherichia coli sin relación genética (REP-PCR). Estas cepas causaron infección en 13 pacientes procedentes de diferentes zonas geográficas de la provincia sin aparente conexión entre ellos. Casi todos ellos tuvieron ingreso hospitalario en distintas áreas y sólo 2 recibieron cefalosporinas de tercera generación previamente al aislamiento.
Conclusiones: Se ha aislado e identificado por primera vez en España un gen BLEA del tipo CTX-M-14. Este gen está ampliamente diseminado en distintas cepas clínicas de Escherichia coli procedentes del noroeste de España, siendo probable que sea el mecanismo de resistencia tipo BLEA más prevalente en la provincia de A Coruña.
348
CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO INTEGRON In60, PORTADOR DE UNA ß-LACTAMASA DE ESPECTRO AMPLIADO (blaCTX-M-9)
M. Sabaté, E. Miró, F. Navarro, B. Mirelis, J. Barbé y G. Prats
Servei de Microbiologia. Hospital de Sant Pau y Dept. Genètica i Microbiologia. UAB.
Objetivos: Caracterización de un nuevo integrón compuesto de la clase 1 portador de una ß-lactamasa de espectro ampliado (blaCTX-M-9).
Métodos:A partir del plásmido pMSP071 y utilizando iniciadores correspondientes a regiones internas de In7 y de blaCTX-M-9 se han obtenido diferentes fragmentos solapados de PCR. Estos fragmentos se han clonado en el plásmido pGEM-T y se han secuenciado.
Resultados: La secuencia nucleotídica obtenida ha confirmado que blaCTX-M-9 se halla formando parte de un integrón compuesto de la clase 1, denominado In60 (número de acceso AF174129). Dicha secuencia consta de dos secuencias conservadas 5'-CS y 3'-CS entre las que se hallan dos genes casete: aadA2 y dfrA16; a continuación se encuentra una región que contiene el orf513, blaCTX-M-9 y una nueva secuencia de inserción IS3000. Finalmente hay una repetición de la secuencia conservada 3'-CS. Tanto blaCTX-M-9 como una región de 394 pb en su extremo 3', muestra una elevada homología con los genes cromosómicos blaKluA-1 y orf3 de Kluyvera ascorbata (81% y 78%, respectivamente).
Se estudió la presencia de In60 en un total de 34 enterobacterias no clonales (30 E. coli y cuatro Salmonella) portadoras de una ß-lactamasa compatible con CTX-M-9, aisladas entre 1996-1999. Utilizando técnicas de PCR con iniciadores específicos pertenecientes a regiones internas de In60 se demostró que 33 de las 34 cepas presentaba el entorno de In60. La cepa restante presentaba una delección de 1.5Kb en una región interna de In60.
Conclusiones:El alto grado de identidad entre la región que incluye blaCTX-M-9 y una secuencia a 3' de éste con blaKluA-1 y orf3 de K. ascorbata, es indicativo de que esta región pueda proceder del genoma de K. ascorbata. Por otro lado, In60 comparte una organización genética similar con los otros tres integrones compuestos descritos, lo que sugiere un origen común.
El hecho de detectar el entorno de In60 en 33 de 34 enterobacterias no clonales, muestra una gran difusión de In60.
349
RESISTENCIA A CEFALOSPORINAS DE TERCERA GENERACIÓN (C3G) EN CEPAS DE SALMONELLA ENTERICA SUB. ENTERICA SEROVAR INFANTIS
L.A. Merino, M.M. Navia, J. Ruiz y J. Vila
Instituto de Medicina Regional (Argentina) y Hospital Clínic. Barcelona.
Objetivo: Estudiar la resistencia a antibióticos betalactámicos y los mecanismos involucrados en cepas de Salmonella Infantis aisladas de pacientes pediátricos.
Materiales y métodos: Se estudiaron 29 cepas de Salmonella Infantis aisladas a partir de heces de niños hospitalizados en Presidencia Roque Sáenz Peña (Argentina). La susceptibilidad antimicrobiana fue determinada mediante difusión con discos y la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) mediante la técnica de dilución en agar frente a Ampicilina (AMP), Ampicilina/sulbactama (AMS), Cefalotina (CEF), Cefoxitina (CFX), Cefotaxima (CTX) y Ceftazidima (CAZ). Adicionalmente se probó la susceptibilidad frente a Gentamicina (GEN) y Sulfisoxazol (SUL). La detección de ß-lactamasas (Blasa) se llevó a cabo mediante isoelectroenfoque (IE) y la presencia de genes codificantes de Blasa se realizó por PCR.
Resultados: Todas las cepas estudiadas fueron resistentes a AMP, CEF y AMS, y sensibles a CFX. El 73% de las cepas fueron resistentes a CTX con CIM >= 512 µg/ml aunque solo el 33% presentó CIMs frente a CAZ >= 32 µg/ml. Por medio de PCR se amplificaron en todas las cepas genes codificantes de tipo TEM mas no para SHV, OXA, CARB o PER. Mediante IE se detectó en todas las cepas una enzima con punto isoeléctrico (pI) de 5,4 compatible con TEM-1, y sólo en las resistentes a CTX se detectó una enzima con pI de aproximadamente 8,7 compatible con una Blasa tipo CTX-M. Los aislamientos resistentes a CTX también lo fueron a GEN y SUL.
Conclusión:La mayor actividad de las cepas frente a CTX, la resistencia acompañante frente a GEN y SUL y la presencia de una enzima con elevado pI hace pensar en la expresión, además de una TEM-like, de una Blasa con actividad de cefotaximasa del tipo CTX-M, descripta previamente en otras cepas de Salmonella infantis. Este hecho constituye un problema para la Salud Pública ya que las C3G constituyen drogas de elección en el tratamiento de infecciones complicadas por especies de Salmonella.
350
DIFUSIÓN DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI MULTIRRESISTENTES MEDIADA POR ALIMENTOS
G. Prats, T Llovet, B. Mirelis, I. Barrabeig*, N. Camps*, S. Minguell*, A. Dominguez* y L. Salleras*
Servei de Microbiologia. Hospital de Sant Pau, Barcelona. *Direcció General de Salut Pública. Dept. de Sanitat i Seguretat Social.
Objetivos: En junio del 2001 se detectó un brote alimentario por Salmonella enterica en una casa de colonias que afecto a 109 personas.
Durante el estudio etiológico, en los coprocultivos se observó el crecimiento de E. coli multirresistente (ECMR).
Métodos:En nuestro laboratorio estudiamos 22 de los pacientes con gastroenteritis, 3 manipuladores de alimentos relacionados con el brote y 10 familiares de 4 pacientes. A todos ellos se determinó la presencia de ECMR en las heces mediante preselección en caldo de MacConkey con cefotaxima (2 mg/L) (MacC+CTX) y posterior siembra en agar MacC+CTX. La sensibilidad a los antimicrobianos se determinó por técnicas de disco difusión y microdilución. Las ß-lactamasas implicadas se caracterizaron mediante determinación del pI, PCR y secuenciación. La posible relación clonal de las cepas se estableció mediante biotipado, serotipado y patrón de macrorestricción genómica por PFGE con XbaI
Resultados: Se detectó la presencia de ECMR, portador de la ß-lactamasa de espectro ampliado, CTX-M-9, en 10 pacientes y en un manipulador. La correlación entre el biotipo, serotipo y PFGE fue total detectándose 3 bioseropulsotipos distintos. Por otro lado se detectaron cepas de ECMR portador de la ß-lactamasa plasmídica de tipo AmpC, CMY-2, en un manipulador y la presencia de dos cepas distintas portadoras de CTX-M-9 y CMY-2 en 2 pacientes. En 9 pacientes se aisló simultáneamente la salmonela y ECMR.
Conclusiones:El progresivo aumento de cepas con este tipo de ß-lactamasas (CTX-M-9 y CMY-2) en nuestro ámbito, puede deberse además de la transmisión horizontal de los genes de resistencia, a su transmisión a través de los alimentos y del agua, que podrían constituir un vector de difusión de bacterias multirresistentes muy eficaz.
351
INCIDENCIA DE ß-LACTAMASAS PLASMÍDICAS RESISTENTES A LOS INHIBIDORES EN CEPAS DE ESCHERICHIA COLI (1996-1998)
E. Miró, L. Gómez, M. Sabate, B. Mirelis y F. Navarro
Servei de Microbiologia, Hospital de Sant Pau, Barcelona.
Objetivo: Estudiar la incidencia de las ß-lactamasas implicadas en la resistencia a las asociaciones ß-lactámico-inhibidor en 7252 cepas de Escherichia coli aisladas entre 1996 y 1998 en el Hospital de Sant Pau.
Métodos: Estudio de la sensibilidad a ß-lactámicos e inhibidores mediante disco-difusión y dilución en agar. Isoelectroenfoque y cálculo de la constante I50 para la caracterización del enzima y PCR para la amplificación del gen implicado. Secuenciación de las posibles IRTs (ß-lactamasas derivadas de TEM resistentes a los inhibidores) y estudio epidemiológico mediante biotipado y PFGE.
Resultados: El 1,8% (130 cepas) de las 7252 cepas aisladas presentaron sensibilidad reducida a la asociación amoxicilina-ác. clavulánico (AMC) y sensibilidad a cefoxitina (FOX). De las 130 cepas, el 20,7% (27 cepas) producían IRTs: cinco TEM-30 (IRT-2), dos TEM-31 (IRT-1), dos TEM-33 (IRT-5), una TEM-34 (IRT-6), tres TEM-37 (IRT-8), cuatro TEM-40 (IRT-11), dos TEM-51 (IRT-15) y dos TEM-54. Además, seis cepas fueron productoras de dos enzimas, de pI 5,2 y 5,4, cinco de ellas producían TEM-30 (IRT-2) y la otra TEM-31 (IRT-1), junto con TEM-1. También presentaban este fenotipo el 46,2% (60 cepas), las cuales hiperproducían la ß-lactamasa TEM-1 y el 12,3% (16 cepas) que resultaron hiperproductoras de la ß-lactamasa cromosómica. Finalmente, el 10% expresaban el enzima OXA-1, el 8,4% hiperproducían SHV-1 y el 2,3% producían PSE-1 o PSE-4. El estudio epidemiológico no muestra relación clonal entre las cepas productoras de IRTs. La única excepción fueron dos cepas idénticas (biotipo y pulsotipo) aisladas de un mismo paciente, productoras de TEM-51 y TEM-54 respectivamente, enzimas que solo difieren en un nucleótido: His244 (CAC) a Leu244 (CTC).
Conclusión.El 0,4% de las 7252 cepas de E. coli aisladas durante este trienio son productoras de IRTs, no existiendo relación clonal entre ellas.
352
SECUENCIACIÓN DE UN PLÁSMIDO DE ß-LACTAMASA EN N. MENINGITIDIS
M.J. Uría1,3, B. Alcalá1, C. La Torre2, C. Salcedo1, L. Arreaza1 y J.A. Vazquez1
1Centro Nacional de Microbiología-ISCIII, Majadahonda (Madrid). 2Hospital San Joan de Deu (Barcelona). 3Hospital La Paz (Madrid).
La reducción en la sensibilidad a Penicilina (CMI 0,125-1 mg/L) en cepas de N. meningitidis se relaciona con alteraciones en la estructura de la PBP2. La producción de ß-lactamasa plasmídica es responsable del alto nivel de resistencia a Penicilina. Hasta el momento, se han descrito 5 cepas de meningococo productoras de ß-lactamasa: dos de ellas en Sudáfrica, una en Canadá y dos en España. En una revisión en nuestro laboratorio de cepas con CMIs de 0.5-1 mg/L en las que no se había realizado determinación de ß-lactamasa, se encontró una cepa aislada en LCR en el año 91 (CMI = 1 mg/L) productora de ß-lactamasa. El serotipado y suptipado permitió caracterizarla como B:4:P1.15, al igual que las dos ya descritas en España. El análisis del contenido plasmídico mostró un plásmido de aproximadamente 5500 pb. El propósito del estudio fue analizar la presencia del gen TEM-1, que codifica la producción de ß-lactamasa en ese plásmido, así como secuenciarlo y compararlo con el plásmido pAB6 descrito ya para N. meningitidis. El estudio se realizó con el secuenciador automático Prism 377 (Applied Biosystems) utilizando terminadores (dNTPs) con marcaje Big Dye (DNA sequencing kit, PE Biosystems). Se completó la secuenciación, encontrando un bajo número de cambios en los pares de bases con respecto al pAB6, no afectando ninguno de los cambios al gen TEM-1. La secuenciación del plásmido y la caracterización fenotípica de la cepa nos hace pensar que la cepa pueda ser la misma que las otras dos aisladas también en España en los años 89 y 96. Teniendo en cuenta que las tres cepas con importancia clínica se aislaron en un periodo de 7 años, podríamos pensar en una baja circulación de la cepa o bien en una pérdida "in vitro" del plásmido con la consiguiente sub-detección de estos aislamientos. Por todo esto es aconsejable determinar la producción de ß-lactamasa en todas las cepas de N. meningitidis con sensibilidad intermedia a Penicilina en niveles cercanos a la resistencia clínica (CMIs = 0,5-1 mg/l).
353
RESISTENCIA A AMOXICILINA/CLAVULÁNICO EN E. COLI: AUMENTO DE ß-LACTAMASAS IRT Y CEFALOSPORINASAS DE CLASE C
O. Cuevas, E. Cercenado, J. Guinea, M. Marín, J. Martín-Pedroviejo, F. García-Garrote y E. Bouza
Hospital Gregorio Marañón. Madrid.
Objetivo: Durante los últimos 4 años hemos observado un aumento de la resistencia a amoxicilina/ác. clavulánico (A/C) (CMI > 16/8 mg/L, halo de inhibición < 14 mm) en aislados de E. coli que ha alcanzado el 18% en 2000. Estudiamos la prevalencia de diferentes mecanismos de resistencia de E. coli a A/C en nuestra institución: producción de cefalosporinasa de clase C (CFC), hiperprodución de penicilinasa (HP), oxacillinasa (OXA), beta-lactamasa de espectro extendido -no cefamicinasa- (BLEE), y beta-lactamasa de tipo TEM resistente a los inhibidores (IRT).
Métodos: Desde 1997 a 2000 a todos los E. coli aislados en nuestro laboratorio con resistencia a A/C se les realizaron pruebas de sensibilidad adicionales siguiendo las normas del NCCLS que incluían la determinación de las CMIs y los halos de inhibición de A/C, ampicilina, ticarcilina, ticarcilina/ácido clavulánico, mecilinam, cefalotina, cefazolina, cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima, y cefepima. Se realizó isoelectroenfoque en aislados seleccionados.
Resultados: Se estudiaron 13.727 aislados de E. coli. De ellos, 12% eran resistentes a A/C. El mecanismo de resistencia más frecuente fue HP (80%), seguido de BLEE (13,5%), CFC (4,3%), IRT (1,3%), y OXA (0,8%). El número de aislados que presentaban CFC aumentó de 7 (1997) a 42 (2000), así como el de productores de IRT (de 2 a 8). El 80% de los productores de IRT procedían de pacientes ambulatorios.
Conclusiones: Aunque en nuestra institución el principal mecanismo de resistencia de E. coli a A/C es la hiperproducción de penicilinasa, existe un creciente aumento de cepas productoras de cefalosporinasas de clase C, de BLEE y de beta-lactamasas de tipo IRT. Son necesarios estudios de vigilancia para determinar la prevalencia actual de estas beta-lactamasas en E. coli.
354
BETA-LACTAMASAS GRUPO 1 EN AEROMONAS CAVIAE, Y RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS BETA-LACTÁMICOS
Z. González-Lama, P. Lupiola, J.L. Martín, M. González y M.T. Tejedor
Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.
Objetivos: Estudiar la resistencia a antibióticos ß-lactámicos y la producción de ß-lactamasas de una cepa de Aeromonas caviae (AC7), aislada de aguas residuales, y una mutante (AC7m) seleccionada "in vitro" con cefotaxima.
Métodos: Las CMIs de los antibióticos ß-lactámicos (AM,MZ,CR,MA,CFZ,CTX,FOX,IPM,TIC,PIP,CAZ,CRO,CX, ATM) se determinaron por dilución en tubo. Para la detección de ß-lactamasas se usó nitrocefin. En los perfiles de sustrato e inhibidores utilizamos una modificación del método espectro-fotométrico. Como inductor usamos cefoxitina y el isoelectroenfoque se llevó a cabo en un gradiente de pH:3,5-9,5.
Resultados:A. caviae (AC7) fue sensible a todos los antibióticos utilizados, excepto a AM y CFZ , no era inhibida por el Ac. Clavulánico(CA) y aumentaba su resistencia en presencia de FOX. La cepa mutante (AC7m) era resistente a la mayoria de los antibióticos utilizados, excepto a CAZ, ATM e IPM. Ambas cepas eran productoras de ß-lactamasas. AC7 aumentaba su producción de ß-lactamasas cuando crecía en presencia de FOX; mientras que AC7m no. Ambas cepas mostraban el mismo perfil de sustrato, pero la actividad hidrolítica de AC7m fue siempre mas alta. La hidrólisis fue inhibida por CLOX y CARB, pero no por CA, p-CMB, EDTA. Por IEF en AC7 se detecta una banda de pI: 6,5 y después de la inducción, bandas satélites de pIs: 5,9-6,5. En CA7m se detectan bandas similares a las de AC7 inducida.
Conclusiones: Basándonos en los perfiles de sustratos e inhibidores, y el pI: 6,5 de las ß-lactamasas de ambas cepas, podemos concluir que AC7 presenta una ß-lactamasa cromosómica inducible del grupo 1; y AC7m es una mutante hiperproductora estable que posee una ß-lactamasa cromosómica constitutiva perteneciente al grupo 1.
355
SENSIBILIDAD A ß-LACTÁMICOS DE AMPLIO ESPECTRO EN UNA COLECCIÓN DEFINIDA DE ENTEROBACTERIACEAE Y P. AERUGINOSA. ESTUDIO MULTICÉNTRICO MENSURA
R. Canton, E. Loza, M.C. Conejo, F. Baquero, L. Martínez-Martínez y grupo de estudio MENSURA
Servicios de Microbiología de los Hospitales Ramón y Cajal (Madrid) y Virgen Macarena (Sevilla).
Objetivo: Determinar la capacidad en el estudio de sensibilidad a ß-lactámicos de amplio espectro en una colección de aislamientos con fenotipos complejos y mecanismos de resistencia caracterizados.
Métodos:Se enviaron 18 cepas a 52 laboratorios en los que se estudió e interpretó rutinariamente la actividad de 8 ß-lactámicos. Los resultados se compararon con los obtenidos (microdilución e interpretación NCCLS) en los dos laboratorios que coordinaron el estudio.
Resultados: El 88% de los participantes utilizó un sistema automático, el 10% difusión con disco y un 2% dilución en agar. En todos los casos se aplicaron criterios NCCLS, corregidos en un 15% por los de MENSURA. Los porcentajes de discrepancias en la interpretación fueron: 30% cefepima, 21% aztreonam, 21% piper-.tazobactam, 19% ceftriaxona, 17% cefotaxima, 12% ceftazidima, 6% meropenem y 2% imipenem. El mayor número de errores, graves (ME) + muy graves (MVE) (> 30%), se observó en las cepas de E. coli con cTX-M-9, K. Oxytoca con K1, E. cloacae con AmpC inducible + CTX-M-10 y P. aeruginosa AmpC hiperproductora + OprD-. El menor número de errores, ME+ VME (< 5%), se observó con E. coli ATCC 25922 o con OXA-1, K. Pneumoniae y SHV-1 o SHV-5+OprK35-, E. cloacae AmpC hiperproductor + CTX-M-10 y P. aeurigonosa ATCC 27853 o hiperproductora de AmpC o con eflujo (MexAB-OprM). Más del 90% de los VME se detectaron en las cepas con ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE). La capacidad de detección de estas cepas osciló entre el 70% para E. coli con TEM-27 y el 10% para E. cloacae hiperproductor de AmpC + CTX-M-10.
Conclusiones:La utilización de una colección de cepas con fenotipos complejos y mecanismos de resistencia caracterizados permitió detectar problemas específicos en el estudio e interpretación de su sensibilidad concentrándose la mayoría en los aislamientos productores de BLEE.
356
FIABILIDAD DEL SISTEMA VITEK 2 PARA LA DETECCIÓN DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI CON RESISTENCIA A CEFOXITINA (FOX) Y AMOXICILINA-ÁCIDO CLAVULÁNICO (AMC)
G. Amblar, L. Martínez Martínez, A. Pascual y E.J. Perea
Facultad de Medicina y Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Virgen de la Macarena. Sevilla.
Objetivo: Durante los últimos meses hemos observado un incremento en la frecuencia de aislamientos de cepas de Escherichia coli con resistencia simultánea a FOX y a AMC, pero sensibles a cefepima (FEP). El objetivo de este estudio es evaluar la fiabilidad del sistema automatizado Vitek 2 (bioMérieux) para detectar la resistencia a FOX y/o AMC.
Material y métodos: Se han evaluado 100 aislamientos consecutivos de Escherichia coli (marzo a diciembre del 2000) con resistencia aislada o combinada a FOX y/o AMC, y sensibles a FEP. La inoculación y lectura de paneles V2 se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante. Como método de referencia se determinó la CMI de ampicilina (AMP), AMC, FOX y FEP mediante microdilución (normas del NCCLS). Se definieron los errores en la categoría clínica determinada por V2 en comparación con la definida por microdilución y se evaluaron los porcentajes de acuerdo esencial (valores de CMI obtenidos con V2 y con el método de referencia que no varían en más de una dilución en base 2).
Resultados: Los resultados de acuerdo en categoría clínica y de acuerdo esencial expresados en porcentaje fueron los siguientes: 99% y 100% (AMP), 82% y 98% (AMC), 81% y 93% (FOX), y 100% y 97% (FEP). Los errores menores correspondieron a: FOX (16%), AMC (18%) y AMP (1%). Para FOX se observaron errores mayores y errores máximos en el 1% y en el 2% de las cepas, respectivamente. Para los demás antimicrobianos no se observaron errores máximos o mayores.
Conclusiones:El sistema Vitek 2 permite obtener valores fiables de CMI de AMP, AMC, FOX y FEP frente a las cepas de E. coli resistentes a cefoxitina y/o amoxicilina-ácido clavulánico. Sin embargo, para estas cepas existe un porcentaje elevado de errores menores en la categoría clínica para cefoxitina y amoxicilina-ácido clavulánico obtenidos con este sistema.
357
PROYECTO GEIH-BLEE 2000: DESCRIPCIÓN DEL PERFIL DE PORINAS DE CEPAS DE E. COLI PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) AISLADAS EN HOSPITALES ESPAÑOLES
J.R. Hernández, A. Pascual, V.J. Benedí, L. Martínez Martínez y GEIH, Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria.
HUV Macarena. Sevilla.
Introducción:E. coli K12 produce dos porinas, OmpC y OmpF, cuya expresión depende del medio de cultivo: OmpF se reprime en medios con alta osmolaridad. El objetivo del estudio fue evaluar la expresión de proteínas de membrana externa en 50 cepas clínicas de E. coli productores de BLEEs, aisladas en el estudio BLEE-GEIH.
Material y métodos: Se estudiaron 50 cepas de E. coli BLEE (+), aisladas de muestras clínicas entre marzo y junio de 2000, procedentes de 27 hospitales españoles participantes en el estudio BLEE-GEIH.
La expresión de porinas se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con urea 6M y SDS de proteínas de membrana externa purificadas. Se estudiaron bacterias crecidas en caldo Mueller-Hinton (MH- medio con alta osmolaridad) y en caldo nutritivo (NB- medio con baja osmolaridad). El patrón de expresión de porinas se comparó con el fenotipo de resistencia a betalactámicos, fluorquinolonas y aminoglucósidos, determinado mediante microdilución (normas NCCLS).
Resultados: De las 50 cepas, el 52% expresaban OmpC y OmpF en medio MH, el 28% expresaban sólo OmpC y el 20% expresaban sólo OmpF. En medio NB, el 66% de las cepas expresaban las dos porinas, el 10% sólo OmpC y el 24% sólo OmpF. No hubo ninguna cepa deficiente en OmpC y OmpF. Para cada uno de los grupos de cepas con igual perfil de porinas, los valores de CMI de los antimicrobianos evaluados presentaron un alto grado de variabilidad.
Conclusiones:Todas las cepas estudiadas expresaban OmpC, OmpF o ambas. El perfil de porinas no es un buen marcador epidemiológico. La expresión de porinas dependía del medio de cultivo empleado, aunque en muchos de los casos, dichos patrones no se correspondían con los descritos en la cepa de referencia E. coli K12. Dentro de los grupos de cepas con el mismo perfil de porinas existe una gran variabilidad en las CMIs de los antimicrobianos estudiados.
358
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA Y PAPEL DE LAS PORINAS OmpF Y OmpC DE E. CLOACAE (EC) EN LA RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS
F. Ballesteros, A. Doménech-Sánchez, L. Martínez Martínez, A. Pascual, M.C. Conejo y V.J. Benedí
IMEDEA (CSIC-UIB) y Universidad de Sevilla.
Objetivos: La literatura describe la existencia de tres porinas en EC (OmpF, OmpC y OmpD). Hasta ahora se dispone de datos fenotípicos, pero se carece de la correspondiente caracterización genotípica. El objetivo de este estudio fue clonar las porinas de EC, expresarlas en cepas sin porinas y estudiar directamente el papel de estas proteínas en la resistencia a los antimicrobianos.
Métodos.Hemos diseñado cebadores específicos para amplificar por PCR, y posteriormente clonar y secuenciar, los genes que codifican OmpF y OmpC de la cepa EC ATCC13047. Su papel en la resistencia se estudió mediante la expresión de las porinas clonadas en la cepa EC 201-RevM3, deficiente en porinas. Las CMIs se determinaron por microdilución y Etest.
Resultados. Hemos caracterizado la expresión fenotípica de las 3 porinas de EC ATCC 13047 mediante electroforesis en geles de 8% acrilamida-6M urea. Los genes de dos de estas porinas se clonaron y sus secuencias resultaron homólogas a las de los genes ompF y ompC de E. coli. Las CMIs (mg/l) de imipenema, cefoxitina y ceftazidima frente a la cepa Ec 201-RevM3 fueron de 16, > 256 y > 256, respectivamente. Las CMIs (mg/l) de imipenema frente a los transformantes derivados de Ec201-RevM3 que expresan los genes ompF (OmpF+C-) u ompC (OmpF-C+) se redujeron a 0,25 y 0, 38, respectivamente, mientras que las CMIs de cefoxitina y ceftazidima permanecieron inalteradas (> 256 en todos los casos). No se observaron diferencias en las CMIs de cefepima en los aislados con o sin porinas. Las CMIs de norfloxacino frente a las cepas que expresan una u otra de las porinas clonadas fueron cuatro (OmpF) o dos (ompC) veces menores que frente a la cepa inicial sin porinas.
Conclusiones. Hemos clonado y secuenciado los genes de las porinas OmpF y OmpC de E. cloacae (Nº. acceso: AJ316539 y AJ316540). La resistencia de E. cloacae a carbapenemas y a quinolonas está relacionada con la pérdida de estas porinas.
