022
VALOR CLÍNICO DE LAS MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS AISLADAS EN MUESTRAS CLÍNICAS
L. Iglesias, P. Idigoras, J.M. García-Arenzana, X. Beristain y A. Valiente
Servicio de Microbiología, Hospital Donostia, San Sebastián (Gipuzkoa).
Objetivo: Conocer la trascendencia clínica de las micobacterias no tuberculosas aisladas entre 1992 y 2000.
Material y métodos: Cultivo en agar Middlebrook 7H11, Löwenstein-Jensen y Coletsos (en los últimos 4 años también medio líquido MGIT). La identificación se realizó por métodos convencionales y genéticos. Se descartaron contaminaciones durante el procesamiento de las muestras.
Resultados: Se aislaron 1.462 Mycobacterium tuberculosis complex (65,8%) y 759 micobacterias no tuberculosas (34,2%): M. xenopi (309), M. gordonae (130), M. avium complex (98), M. fortuitum (38), M. chelonae (36), M. kansasii (18), M. scrofulaceum (11), M. aurum (9), M. marinum (6), M. lentiflavum (6), M. senegalense (4), M. simiae (3), M. noncromogenicum (3), M. peregrinum (3), M. chitae (1), M. abscesus (1), M. haemophilum (1), M. flavescens (1), M. smegmatis (1), M. mucogenicum (1) y micobacerias no tuberculosas sin identificación de especie (79). Sólo el 4,6% de los pacientes con micobacterias no tuberculosas tuvieron baciloscopia positiva (15 M. avium complex, 9 M. xenopi, 4 M. gordonae, 3 M. chelonae, 2 M. marinum, 1 M. haemophilum y 1 Mycobacterium sp.). Todas las cepas de M. marinum, M. smegmatis y M. haemophilum y más de la mitad de los aislamientos de M. avium complex y M. kansasii tuvieron valor clínico. Para el resto de las especies sólo 1 M. simiae, 6 M. chelonae, 1 M. fortuitum, 1 M. scrofulaceum, 1 Mycobacterium sp. y menos de 10 M. xenopi tuvieron valor clínico.
Conclusiones: 1) Se observa un incremento en el número de micobacterias no tuberculosas, debido probablemente a la incorporación del medio de cultivo líquido. 2) Es fundamental utilizar métodos rápidos para descartar precozmente que la especie aislada sea M. tuberculosis. 3) Debido a la infrecuente implicación clínica de algunas especies, para evitar tratamientos innecesarios, es importante que la información preliminar ofrecida al médico responsable del paciente oriente con respecto a la especie aislada.
023
RENDIMIENTO DEL ESPUTO FRENTE AL BAS Y EL BAL EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS
L. Navarro, A. Gimeno, I. Gascón, A. Sánchez, J. Plazas, M.J. Moll, M.A. Arroyo, M.C. Blesa y M. Andreu
H.G.U. Alicante.
Objetivos: Evaluar el rendimiento del tipo de muestra en los cultivos de Mycobacterium tuberculosis en medio líquido Middlebrook y en medio sólido de Löwenstein-Jensen.
Métodos: Se han estudiado 52 casos de tuberculosis pulmonar activa confirmados clínica y microbiológicamente, ocurridos durante el período enero de 1996 - octubre de 2001. Se recogió el tipo de muestra remitida, esputos, BAL y BAS y se valoró el rendimiento de cada tipo de muestra de manera independiente. Se categorizaron los esputos por la positividad de 1, 2 o 3 esputos de los tres que se remitieron al laboratorio frente a muestras de BAL (lavado broncoalveolar) y BAS (aspirado bronquial selectivo).
Resultados: El rendimiento del esputo cuando se remite una muestra es del 17,5%, con dos muestras del 78%, y con tres muestras es del 95%. El rendimiento del BAL fue del 69% y la del BAS del 83%. El rendimiento de tres muestras de esputo es superior con respecto al BAL (p < 0,05), y frente al BAS ligeramente superior (p = 0,08). El rendimiento de dos muestras de esputo respecto al BAS y al BAL es similar.
Conclusión: El rendimiento de tres muestras de esputo es lo suficientemente alto como para diagnosticar la infección sin necesidad de otras técnicas invasivas. El empleo de 2 esputos es comparable con el del BAL.
024
CULTIVO DE LÍQUIDO PLEURAL: NECESIDAD O COSTUMBRE
R. Sertal, M. García, M. Pascual y L. Anibarro
Complejo Hospitalario de Pontevedra.
Introducción:La enfermedad tuberculosa tuvo una tasa de incidencia del 58.16x105 habitantes en Galicia en el año 2000. La Tuberculosis pleural representa la 2ª localización anatómica más frecuente, con un total de 260 casos durante dicho período.
Objetivos: Análisis retrospectivo de 133 muestras de liquido pleural procesados durante el año 2000, en los que se valora:
Eficacia del ADA en el despistaje de pleuritis tuberculosa.
% recuperación de M. Tuberculosis en cultivo de líquido pleural.
Material y métodos: Determinación bioquímica de ADA. Tinción de líquido pleural. Para el aislamiento del microorganismo las muestras fueron sembradas, tras centrifugación en Medios sólido (Coletsos) y líquido (ESP), realizándose un frotis para tinción fluorescente y Zhiel. La identificación se realizó por hibridación con sonda específica de especie (Accuprobe®)
Resultados: De los 133 líquidos procesados, 14 (10,5%) cumplieron criterios bioquímicos de pleuresía tuberculosa.
Se obtuvieron 2 cultivos positivos (0,16%), porcentaje que se vería incrementado si únicamente se procesasen para cultivo aquellos con ADA > 45 y/o pleocitosis mononuclear.
Conclusiones: 1) Se refleja nuevamente el poder discriminante del ADA en el diagnóstico etiológico de la tuberculosis pleural. 2) El uso del clásico cutt-off de ADA permitiría optimizar los cultivos, con la consiguiente disminución de la carga de trabajo. 3) Se observa un escaso rendimiento en el cultivo del liquido pleural, explicable por: factores preanalíticos y carácter paucibacilar de la muestra.
025
VALORACIÓN DE LOS MEDIOS BACTEC 12B Y LÖWENSTEIN-JENSEN EN EL AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS
A.I. González, J.R. Sanchiz, M. Ojer, A. Ruz e I. Dorronsoro
Servicio de Microbiología, Hospital de Navarra, Pamplona.
Objetivo: Evaluación de las ventajas que ha supuesto para el diagnóstico de la tuberculosis, la incorporación del sistema BACTEC 460TB junto al medio tradicional de L-J en el cultivo rutinario de micobacterias y comparar el rendimiento de ambos medios.
Material y métodos: Se han estudiado 3894 muestras recibidas en 12 meses y que se sembraron simultáneamente en medio BACTEC 12B y L-J. La decontaminación se realizó con N-acetil-cisteina-NaOH, siguiendo procedimientos estandarizados. Para la identificación se utilizaron sondas genéticas (Gen -Probe, Inc.) y pruebas bioquímicas convencionales.
Resultados: De las 3.894 muestras procesadas, se aislaron micobacterias en 325 (8,3%). De ellas, 299 (92%) crecieron en BACTEC y 234 (72%) en L-J siendo la diferencia significativa (p < 0,01). Un 28% de los cultivos positivos, se obtuvieron exclusivamente en BACTEC y 8% exclusivamente en L-J. En cuanto al aislamiento de M. tuberculosis, el 18,6% de los 182 aislamientos, se obtuvieron exclusivamente en BACTEC y 7% exclusivamente en L-J.
El promedio de días para la obtención de cultivos positivos fue de 14,2 con BACTEC frente a 22,7 con L-J, esta diferencia se incrementó hasta 10,2 días en favor del BACTEC en los casos de tuberculosis con baciloscopias negativas. El porcentaje de cultivos que debieron ser desechados por contaminación fue de 1,9 en el caso de BACTEC y 4,8 en el de L-J.
Conclusiones: Con el sistema BACTEC 460TB, se ha conseguido una notable mejoría frente al cultivo tradicional en L-J en el número y velocidad de recuperación de micobacterias, estas diferencias han sido especialmente notables en el caso de tuberculosis con baciloscopias negativas, que son aquellas, en que realmente interesa una mayor sensibilidad y rapidez en el diagnóstico, sin embargo, dado que el 7% de los cultivos en que se aisló M. tuberculosis resultaron negativos en BACTEC, no podemos prescindir del medio sólido mientras no profundicemos en las causas de esta diferencia.
026
EL SISTEMA ESPII EN EL DIAGNOSTICO Y CONTROL DE TRATAMIENTO DE LA TUBERCULOSIS
J. Gutiérrez, P. Ruiz, M. Vaquero, F.J. Zerolo y M. Casal
Facultad de Medicina. Córdoba.
Objetivo: Demostrar la eficacia y validez del Sistema ESP II en el aislamiento y estudio de sensibilidad a antimicrobianos, en Micobacterias. Para ello se utilizó comparativamente como sistema de referencia el sistema Bactec 460 TB.
Material: Se han estudiado 10.401 muestras clínicas de enfermos con sospecha de tuberculosis, de las que 8580 fueron respiratorias. Todas las muestras tras su descontaminación y visualización microscópica se procesaron por el sistema ESP II y el sistema Bactec 460TB. Los cultivos positivos se identificaron por métodos genéticos y bioquímicos y en los casos solicitados se realizó el estudio de sensibilidad comparativamente. Todos los resultados fueron evaluados estadísticamente.
Resultados: Los promedios de tiempo necesarios para obtener crecimiento fueron por el sistema Bactec de 9 y 14 días según fueran baciloscopias positivas o negativas. Por el sistema ESP II fueron de 10 y 13 días respectivamente. La sensibilidad por Bactec fue de un 97,8% y para ESP un 98,1%. La especificidad con ambos sistemas fue de un 99,9%. En el estudio de sensibilidad se empleó una media de 4,83 días para Bactec y 4,55 días para ESP. La correlación para estreptomicina fue del 99,7%, 100% para rifampicina y etambutol y un 98,9% para isoniazida. En total, el estudio completo de una muestra con ESP II, necesita un promedio de 17,5-20,5 días en obtener resultados.
Conclusiones:Consideramos el sistema ESP II, como una alternativa válida a otros sistemas dad su sensibilidad y especificidad y la ventaja de ser un sistema rápido, automatizado y no radiométrico.
027
EVALUACIÓN DEL BDProbeTec ET PARA LA DETECCIÓN DIRECTA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX EN MUESTRAS RESPIRATORIAS
I. Jesús, M.A. Jesús y M. Rodríguez-Iglesias
Laboratorio de Microbiología, Hospital Universitario Puerto Real. Cádiz.
La Strand Displacement Amplification (SDA) es una técnica de amplificación isoterma de ácidos nucleicos que se realiza automáticamente en el sistema BD ProbeTec ET (Becton Dickinson).
Ha sido evaluado el sistema automático BDProbeTec ET para el diagnóstico molecular directo de Mycobacterium tuberculosis en muestras respiratorias de pacientes con sospecha clínica de tuberculosis.
Se procesaron 239 muestras, procedentes de 111 pacientes, que corresponden a 220 esputos, 9 líquidos pleurales, y 10 aspirados bronquiales. Todas las muestras fueron procesadas en el BD ProbeTec ET siguiendo las instrucciones del fabricante. A todas las muestras se les realizó una tinción de Ziehl-Neelsen y se cultivaron en medio líquido (BD BACTEC MGIT 960 SYSTEM, Becton Dickinson) y en medio sólido (Löwenstein-Jensen). La identificación se realizó mediante hibridación con sondas (GenProbe). El análisis de sensibilidad y especificidad utilizó el cultivo en medio líquido como referencia.
El BDProbeTec ET obtuvo resultados positivos en 23 muestras (todos esputos excepto un aspirado bronquial). El cultivo en medio líquido y sólido fue positivo en 19 y 15 muestras respectivamente y la tinción sólo fue positiva en 13 muestras. Cuatro muestras fueron PT(+) y MGIT(-), pertenecientes a pacientes en tratamiento activo. Una muestra fue PT(-) y MGIT(+), que se identificó como M. chelonae. La sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo del PT (excluyendo ésta última muestra), fue del 100%, 98,2%, 82,6 y 100 respectivamente. La utilidad en el diagnóstico de líquidos pleurales no ha podido ser establecida en este estudio por el bajo número de este tipo de muestras.
El BD ProbeTec ET es un sistema excelente, por su fiabilidad y rapidez, para el diagnóstico directo de tuberculosis en muestras respiratorias. Son necesarios estudios posteriores para establecer el tiempo en que la técnica da resultados positivos, con cultivo negativo, en pacientes tratados.
028
EVALUACIÓN DE LA DETECCIÓN DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS EN MUESTRA DIRECTA POR AMPLIFICACIÓN BDProbeTec
J. Sahagún, A. Vitoria, M.T. Llorente, S. Olivera, S. Julvez, B. Lobera, L. Santolaria, M. Oca y M.C. Rubio
H.C.U. Lozano Blesa. Zaragoza.
Objetivo: Evaluar el método de amplificación y detección por desplazamiento de cadenas de Mycobacterium tuberculosis, BDProbeTec, en comparación con la Auramina y el cultivo.
Método: Se seleccionan muestras de esputos y aspirados bronquiales de 19 pacientes con sospecha de TBC, que no han sido tratados con tuberculostáticos en el último año. Se analizan mediante BDProbeTec, tinción de Auramina y Löwestein-Jensen (L-J) utilizando como método de referencia el cultivo en medio líquido MB/BacTTM240.
Resultados: En el cultivo en medio líquido MB/BacTTM240, se aísla en 7 de los 19 casos M. tuberculosis, en 2 casos M. kansasii y en otros 2 M. fortuitum, en un tiempo que osciló entre 5 y 30 días.
En un tiempo de unas 4 horas, el sistema BDProbeTec amplifica M. tuberculosis en 8 casos y la tinción de Auramina es positiva en 6, de los cuales 2 correspondieron a M. kansansii.
Respecto al cultivo en medio sólido (L-J), el tiempo de crecimiento osciló entre 10 y 40 días, aislándose M. tuberculosis en 6 de los 7 casos, M. kansasii en 2 casos y M. fortuitum en otros 2 casos.
Conclusiones: Pese a que nuestra serie es pequeña y no es muy representativa estadísticamente, los resultados obtenidos sugieren una alta sensibilidad y especificidad, ya que no hubo ningún falso negativo y solo un falso positivo, que se valoró como tal por los resultados repetidamente negativos en cultivos de muestras posteriores.
Tras esta evaluación, creemos que el sistema BDProbeTec es útil en el diagnóstico de M. tuberculosis, dada la rapidez de la técnica (4 horas) y la mayor sensibilidad y especificidad respecto a la tinción de Auramina; aunque en ningún caso puede sustituir al cultivo, ya que éste sigue siendo imprescindible para confirmar la presencia de M. tuberculosis y para el estudio de su sensibilidad.
029
EVALUACIÓN DEL MÉTODO MTD GEN-PROBE PARA EL DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
M.A. Ruiz, M.A. Lezcano, P. Gavin, L. Torres y M.L. Marco
Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
Objetivos: Evaluar la utilidad en el diagnóstico rápido de infecciones producidas por Mycobacterium tuberculosis complex, mediante el test MTD Gen-Probe.
Material y métodos: Un total de 358 pacientes de los cuales se recogieron 640 muestras, 255 respiratorias y 385 no respiratorias, desde enero de 1999 hasta agosto de 2001, fueron evaluados por el método MTD (test Gen-Probe San Diego, CA, distribuido por bioMérieux s.a.) realizando la técnica según las instrucciones del fabricante. Así mismo se les realizó cultivo en medio de Löwestein-Jensen, MB-bact (bioMérieux) y tinción de Ziehl-Neelsen. El test MTD solo se realizó en muestras de pacientes con alta sospecha de tuberculosis con resultados microbiológicos (baciloscopia y/o cultivos) negativos en otras muestras anteriores y también en aquellos pacientes en los que se observaban escasos BAAR o con alteraciones en su morfología.
Resultados: Los resultados obtenidos por el test MTD se compararon con aquellos obtenidos por cultivo y se obtuvieron los siguientes resultados: sensibilidad 83,8%, especificidad 89,9%, valor predictivo positivo 65,5%, valor predictivo negativo 95,9%. Comparados con la baciloscopia los resultados fueron sensibilidad 59,4%, especificidad 90,5%, valor predictivo positivo 72,4%, valor predictivo negativo 87,8%.
Conclusiones:Existe buena sensibilidad y especificidad entre el test MTD el cultivo y la baciloscopia, estando las cifras en el rango de lo descrito por otros autores. El test MTD es una herramienta más en el diagnóstico de tuberculosis, proporcionando un diagnóstico rápido que permite la detección de Mycobacterium tuberculosis complex en muestras directas. La instauración más temprana del tratamiento, corta la cadena epidemiológica y evita la realización de pruebas innecesarias en todos los pacientes sobretodo en aquellos con factores de riesgo: inmunodeprimidos, transplantados, VIH, enfermos hematológicos.
030
EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS DE LISIS MICOBACTERIANA APLICADOS AL SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN LiPA MYCOBACTERIA
E. Padilla, V. González, J.M. Manterola, A. Pérez, J. Lonca, M.D. Quesada y V. Ausina
Servicio de Microbiología, H.U. Germans Trias i Pujol.
Objetivos: Evaluar dos métodos de lisis simple aplicados al sistema de identificación de micobacterias LiPA MYCOBACTERIA, Innogenetics, Belgium, con el objetivo de disminuir el tiempo requerido para la realización del procedimiento de extracción de DNA.
Métodos: 45 cepas de micobacterias de 17 especies diferentes fueron inoculadas en frascos de medio líquido MB-BacT (Organon Teknika, Durham, NC). Los métodos de lisis se aplicaron directamente sobre el medio de cultivo líquido una vez que el sistema detectara el crecimiento micobacteriano. Los sistemas de lisis a evaluar fueron: 1) Lisis por calentamiento (M1), y 2) sonicación (M2) con perlas de vidrio. Ambos sistemas fueron comparados con un método fundamentado en la lisis micobacteriana por congelación-calentamiento (M3) que es el actualmente recomendado por el fabricante.
Resultados: Con los tres sistemas de lisis obtuvimos idénticos resultados. El test LiPA Mycobacteria identificó correctamente los 37 (100%) de especies de micobacterias incluidas en la tira de nitrocelulosa. No se obtuvieron resultados de identificación para las restantes 8 micobacterias aisladas, y pertenecientes a especies no incluidas en la tira. La sensibilidad y especificidad de la técnica para los dos sistemas de lisis evaluados resultó del 100, y 100%, respectivamente. Los tiempos requeridos para la realización de los diferentes métodos de lisis fueron: M1: 30 min, M2: 45 min, M3: 120 min.
Conclusiones: 1) Para todos los sistemas de lisis ensayados, la sensibilidad y especificidad de la técnica LiPA MYCOBACTERIA en su aplicación directa sobre micobacterias aisladas en el sistema de cultivo MB-BacT resultó excelente. 2) Con los sistemas de lisis evaluados el tiempo global de realización de la técnica LiPA MYCOBACTERIA se reducen significativamente: 5 h. (M1), 5 h 15 min (M2), y 6 h 30 min (M3).
031
EVALUACION DE LA PRUEBA AMPLICOR MTB PARA DETECCION DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS EN MUESTRAS DE ORIGEN EXTRA-RESPIRATORIO
J.L. Del Pozo, A. Urdiain, M. Soler, M. Fernández y J. Leiva
Servicio Microbiología Clínica. Clínica Universitaria de Navarra.
Introducción y objetivos: Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para el diagnóstico de la tuberculosis son más sensibles y específicas que las técnicas de examen microscópico, y más rápidas que los cultivos. La prueba AMPLICOR MTB está validada solamente para muestras respiratorias humanos (esputos y broncoaspirados) licuados, descontaminados y concentrados. Sin embargo, hoy en día la presión asistencial se centra en el diagnóstico de la tuberculosis extrarrespiratoria. En este trabajo hemos querido estudiar el valor de esta prueba aplicada sobre muestras procedentes de tejidos.
Material y métodos: Se han estudiado 224 muestras consecutivas procedentes de tejidos. Dichas muestras fueron procesadas de forma rutinaria y siguiendo los protocolos existentes en nuestro Laboratorio. Además se realizó una PCR (MTB) sobre cada una de las muestras.
Resultados: Se obtuvo un resultado positivo en la técnica de PCR (detección del gen 16S RNAr) en 12 de las 227 muestras estudiadas, el resto de determinaciones fue negativo. En las 12 muestras PCR + se confirmo el diagnóstico de tuberculosis mediante el cultivo. Dentro del grupo de las muestras PCR se confirmó el diagnóstico de tuberculosis en 11 de ellas, presentando el resto (205) un cultivo negativo. La sensibilidad y especificidad de la prueba Amplicor MTB fue del 52,1% y del 100% respectivamente. El valor predictivo positivo de la prueba fue del 100% y el valor predictivo negativo del 94,9%. Se observaron bacilos ácido alcohol resistentes en las tinciones sobre la muestra en 10 de las 23 muestras positivas (sensibilidad total del 43,4%). En 3 de las muestras se aisló una micobacteria atípica, siendo las tinciones y la PCR negativas.
Conclusiones: La prueba Amplicor MTB es una prueba de utilidad para el diagnóstico de la tuberculosis extrarrespiratoria, con resultados de sensibilidad por encima de las técnicas de observación directa, con una especificidad del 100% y con la principal limitación de su sensibilidad frente a la misma prueba aplicada a muestras respiratorias.
032
DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE M. TUBERCULOSIS MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA EN TUBERCULOSIS GANGLIONAR
E. León, M.C. Rajo, E. Prieto, M.J. López, F. Pardo y M.L. Pérez del Molino
Servicio de Microbiología. Hospital Clínico Universitario Santiago de Compostela.
Objetivos: Evaluar el sistema LCx (Abbott), basado en la reacción en cadena de la ligasa, para la detección rápida de M. tuberculosis en adenopatías.
Métodos:Se analizaron 86 adenopatías procedentes de 82 pacientes, mediante el sistema LCx. El método seguido y la interpretación de resultados fue el descrito por el fabricante para muestras de origen respiratorio. Las muestras se descontaminaron con N-acetilcisteína-NaOH y se realizo en todos los casos tinción de auramina y cultivo en medio sólido (Coletsos) y líquido (Middlebrook 7H11). Como técnica de referencia se utilizó el cultivo. También se realizó revisión de historias clínicas.
Resultados: La tinción de auramina fue positiva en 13 casos de M. tuberculosis y en 2 de MAC. El cultivo lo fue en 22 casos, de ellos en 18 creció M. tuberculosis y en 4 MAC. El sistema evaluado dio resultado positivo en 24 adenopatías, uno de ellos se considero un falso positivo porque en cultivo creció un MAC. También obtuvimos un falso negativo que se diagnostico por la positividad del cultivo.
Conclusión:El LCx es una técnica de fácil manejo y útil para este tipo de muestras porque con ella hemos conseguido incrementar el porcentaje de diagnósticos confirmados en un 6%.
033
EVALUACIÓN DEL SISTEMA MB/BACT PARA DETERMINAR LA SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA DE M. TUBERCULOSIS
M.D. Tirado, R. Moreno, F. Pardo, M. Gil, B. Gomila y L. Amselem
Microbiología. Hospital General de Castellón. Castellón.
Objetivo: Evaluar el sistema MB/BacT (Organon Teknika) para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de aislados clínicos de M. tuberculosis.
Material y métodos: Realizamos tests de susceptibilidad antimicrobiana a 58 aislados clínicos. Comparamos el sistema en medio líquido MB/BacT con el método clásico de las proporciones de Canetti en medio Löwenstein-Jensen. Cada técnica se llevó a cabo por una persona distinta siguiéndose las instrucciones de los fabricantes. Las concentraciones de antibióticos ensayadas fueron en MB/BacT: estreptomicina 1 µg/ml; isoniacida 1 µg/ml; rifampicina 1 µg/ml y etambutol 2,5 µg/ml. Cuando había discrepancias en los resultados se repetía el antibiograma en medio líquido y se enviaba la cepa al Instituto de Salud Carlos III (Majadahonda).
Resultados: Se obtuvo una concordancia entre ambos métodos del 100% para isoniacida y rifampicina. En el caso del etambutol se observaron 3 falsas resistencias que no se confirmaron al repetirlos. También aparecieron 3 casos de falsas resistencias con estreptomicia que se mantuvieron como tales en un segundo antibiograma, con lo que la concordancia para estos tuberculostáticos fue de 94,74%.
El tiempo medio de obtención de resultados fue de 9,2 días (rango entre 3 y 13 días).
Conclusiones:MB/BacT es un método fácil de realizar, reduce el tiempo de obtención de resultados y presenta una buena correlación con el método de referencia. Creemos que las resistencias a etambutol y estreptomicina deben confirmarse por el método clásico mientras MB/BacT no se modifique.
034
ESTUDIO DE SENSIBILIDAD DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS A ANTITUBERCULOSTÁTICOS DE PRIMERA ELECCIÓN
D. Domingo, A. Perkins, T. Alarcón, M. Serrano, J. Díaz-Regañón y M. López-Brea
Servicio de Microbiología. Hospital U. de La Princesa. Madrid.
Objetivo: Estudiar la sensibilidad de M. tuberculosis a los antituberculostáticos de primera elección (estreptomicina, isoniazida, rifampicina y etambutol) en un hospital de 500 camas de Madrid.
Métodos:Se obtuvieron un total de 52 aislamientos de M. tuberculosis de diferentes pacientes, 46 de ellos procedentes de muestras respiratorias, correspondientes a un período de un año.
La identificación se realizó mediante sondas de hibridación Accuprobe (Gen Probe). La sensibilidad se realizó mediante el sistema SIRE (Becton Dickinson), en medio de Middlebrook 7H9. Como inóculo se utilizaron los aislamientos en medio líquido que habían sido reincubados durante 24 ó 48 horas tras haber sido detectados como positivos mediante el sistema MGIT 960 (Becton Dickinson). Se utilizaron las siguientes concentraciones de fármacos: estreptomicina (1 mg/L), isoniazida (0,1 mg/L), rifampicina (1 mg/L) y etambutol (5 mg/L).
Resultados: los resultados se obtuvieron a los 7 días de la inoculación (la media fue de 7,01 días, con un intervalo de 4 días 11 horas-10 días 5 horas).
El número de cepas resistentes fue el siguiente: 6 (11,5%), 2 (3,8%), 1 (1,9%) y 1 (1,9%) a estreptomicina, isoniazida, rifampicina y etambutol, respectivamente.
Se encontraron 2 cepas (3,8%) resistentes a isoniazida y estreptomicina y una cepa (1,9%) resistente a las cuatro drogas. Ninguna de las cepas resistente a dos o más fármacos procedía de un paciente VIH positivo.
Conclusiones:El método SIRE es un método rápido, fácil y eficaz para el estudio de sensibilidad a M. tuberculosis frente a estreptomicina, isoniazida, rifampicina y etambutol. Estreptomicina presentó la mayor tasa de resistencias con un 11,5%. Los índices de resistencia obtenidos en este trabajo frente a isoniazida, rifampicina y etambutol están en consonancia con los obtenidos en diferentes estudios en España.
035
ACTIVIDAD "IN VITRO" DE NUEVAS FLUOROQUINOLONAS Y DE LINEZOLID FRENTE A MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
J.C. Rodríguez, M. López, M. Ruiz y G. Royo
S. Microbiología. Hospital General Universitario de Elche. U. Miguel Hernández. Elche (Alicante).
Objetivo: Conocer la actividad "in vitro" de estos nuevos fármacos frente aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis
Métodos:Se estudiaron 243 cepas frente a moxifloxacino, levoflloxacino, gatifloxacino y linezolid mediante el método de las proporciones en medio Middlebrook 7H11, incubado a 37 ºC durante 21 días. La transmisión de las resistencias se estudió mediante RFLP de la secuencia de inserción IS6110.
Resultados: La CMI50 de las tres fluoroquinolonas ensayadas es de 0,25 ug/ml y la CMI90 es de 0,25 ug/ml para gatifloxacino y de 0,5 ug/ml para moxifloxacino y levofloxacino. Linezolid presenta una CMI50 y una CMI90 de 0,5 ug/ml. Detectamos 5 cepas resistentes a las tres fluoroquinolonas y de ellas, tres presentan concentraciones mínimas inhibitorias elevadas para linezolid. Una de las cepas resistentes está agrupada mediante RFLP con tres cepas sensibles. Dos de las cinco cepas resistentes a las fluoroquinolonas ensayadas se aíslan de tuberculosis renales.
Conclusiones: Moxifloxacino y gatifloxacino, debido a su estructura química, presentan mayor actividad que levofloxacino. Linezolid presenta buena actividad "in vitro" y a pesar de que es de una familia distinta a las fluoroquinolonas, algunos de los aislados resistentes a éstas lo son también a linezolid.
A pesar de que la patogénesis de esta enfermedad no nos permite conocer el momento de la infección, la asociación de cepas resistentes con otras sensibles, aisladas con meses de antelación. Puede significar que la aparición de resistencias ha sido reciente, probablemente asociada a tratamientos empíricos con fluoroquinolonas; además un elevado porcentaje de las cepas resistentes se aísla en orinas.
La buena actividad "in vitro" de estos nuevos fármacos ensayados plantea la posibilidad de que puedan ser buenas alternativas terapéuticas, pero deben ampliarse los estudios para conocer su verdadera utilidad clínica, sobre todo frente a cepas resistentes a los antituberculostáticos clásicos.
036
DETECCIÓN RÁPIDA DE LA SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE M. TUBERCULOSIS MEDIANTE EL MICOBACTERIÓFAGO D29
N. Galí, S. Blanco, J. Domínguez, J. Lonca, E. Martínez, M. Pérez, J.M. Manterola y V. Ausina
Servicio de Microbiología, HU. Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona.
Objetivos: Estandarizar una técnica rápida, simple y de bajo coste para el estudio de la susceptibilidad a isoniazida (INH), rifampicina (RIF) y estreptomicina (SM) de M. tuberculosis (MTB) utilizando el fago D29.
Métodos:La tecnología se basa en la capacidad del fago lítico D29 para infectar micobacterias viables tras exponer éstas a los antibióticos. Los fagos que infectan las micobacterias quedan protegidos en su interior y se replican, causando la lisis de los bacilos y la formación de una nueva progenie de fagos. Estos nuevos fagos se detectan por la formación de calvas de lisis sobre un cultivo confluente de M. smegmatis. Una cepa es considerada resistente en el caso que se formen calvas de lisis. Se evaluaron 44 cepas de MTB: 18 resistentes a INH, 9 resistentes a RIF e INH, 5 resistentes a SM e INH y 12 sensibles a todos los fármacos. Los resultados fueron comparados con una técnica de susceptibilidad estándar (BACTEC). La CMI fue también determinada en el caso de las 32 cepas resistentes a INH: 15 de bajo nivel de resistencia (CMI 0,25-1 µg/ml) y 17 resistencia elevada (CMI >= 2 µg/ml).
Resultados: En 43 de las 44 cepas testadas (97,7%) los resultados de la RIF concuerdan con el método de referencia, mientras que se detectaron 3 discordancias en el caso de la SM (concordancia 93,2%). Los resultados de INH no concordaron en 8 casos con el "gold-standard" (concodancia 84,1%): 1 cepa sensible fue clasificada como resistente por el método de los fagos; y 7 resistentes fueron determinados como sensibles. Estas 7 cepas resistentes discordantes presentaron una CMI para INH entre 0,25-1 µg/ml, mientras que todas las cepas con una CMI elevada (>= 2 µg/ml) fueron también determinadas como resistentes (17/17).
Conclusiones: El uso del fago D29 para detectar resistencias a RIF y SM ha presentado una buena concordancia con el método de referencia. Los resultados de la INH dependen del nivel de resistencia de las cepas. Esta metodología ofrece un test rápido, poco laborioso y económico.
037
EVALUACIÓN DEL E-TEST PARA EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
F. Santos, J.I. García Cía, F. Cabria, J. Esteban, M.V. Torres, I. Gadea, M.S Jiménez* y R. Fernández Roblas
Fundación Jiménez Díaz. *C.N.M. Madrid.
Objetivos: Evaluar la técnica de E-test para el estudio de sensibilidad del complejo M. tuberculosis en la rutina asistencial de un laboratorio de Microbiología.
Métodos:Se realizaron estudios de sensibilidad mediante E-test de acuerdo con la técnica recomendada por el fabricante en aquellos aislamientos con sospecha clínica y/o epidemiológica de resistencia a algún fármaco antituberculoso en el período abril 1996septiembre 2001. Todas las cepas fueron además estudiadas en el Centro Nacional de Microbiología (C.N.M.) mediante la técnica de las proporciones utilizando el sistema BACTEC 460.
Resultados: Durante el período analizado se estudiaron 35 aislamientos pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis (29 M. tuberculosis y 6 M. bovis). 8 aislamientos presentaban resistencia a uno o más antituberculosos mediante la técnica de referencia. 6 de estos eran cepas multirresistentes (4 M. tuberculosis y 2 M. bovis). De la comparación de los resultados obtenidos por ambas técnicas se objetivaron 2 errores menores y 2 errores mayores. Los dos casos de errores mayores se dieron en Isoniazida (CMI de 0,125 mg/L y 0,015 mg/L) en 2 cepas de M. bovis multirresistente. Se detectó una cepa de M. tuberculosis con una CMI a Isoniazida de 0,025 mg/L que fue resistente por la técnica de referencia.
Conclusiones: E-test es una técnica válida para el estudio de sensibilidad antimicrobiana en M. tuberculosis. Sin embargo, en el caso de M. bovis los resultados de estudio de Isoniazida deben interpretarse con precaución, en particular en el contexto de resistencia a otros antituberculosos.
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UTILIDAD DE LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DEL ANTIBIOGRAMA DIRECTO DE M. TUBERCULOSIS EN PACIENTES BACILÍFEROS
P. Idigoras, D. Vicente, M. Alkorta, X. Beristain y E. Pérez-Trallero
Servicio de Microbiología, Hospital Donostia, San Sebastián (Gipuzkoa).
Objetivo: Evaluar un método directo de susceptibilidad de M. tuberculosis en muestras clínicas con baciloscopia positiva.
Material y métodos: Método directo, basado en el descrito por T. Schaberg y col, utilizando el mismo medio de cultivo y discos que el método de referencia: agar Middlebrook 7H11 y discos de isoniazida (INH) de 1 µg y 5 µg, rifampicina (RA) de 5 µg, estreptomicina (STR) de 10 µg y 50 µg y etambutol (ETH) de 25 µg embebidos en el agar, en el centro de cada cuadrante de placas de Petri con 4 divisiones. Del sedimento obtenido tras la descontaminación de la muestra con n-acetil-cisteína/NaOH se inocularon 20 µl en cada cuadrante con drogas y en un cuadrante de control sin drogas. Las placas selladas con Micropore® se incubaron a 35 ºC, con CO2 al 5%. La lectura se realizó con ayuda del microscopio óptico (objetivo seco de 10 aumentos), con las placas colocadas de forma invertida, enfocando la superficie del agar, tres veces por semana a partir del 4º día. Se estudiaron 200 muestras (192 respiratorias, 5 orinas, 2 biopsias y 1 LCR).
Resultados: Por el método de referencia 14 cepas (7%) presentaron resistencia: 13 (6,5%), 6 (3%) y 6 (3%) fueron resistentes a INH, RA y STR respectivamente; 6 de ellas (3%) fueron multirresistentes. En 20 muestras (10%) el crecimiento insuficiente de la cepa por el método directo impidió obtener datos de susceptibilidad. Entre ellas sólo había una cepa resistente. En dos cepas observamos una falsa resistencia a ETH. No hubo contaminaciones. En el 85,7% (12/14) del total de cepas resistentes y en el 92,3% (12/13) de las cepas resistentes obtenidas en el antibiograma directo, la resistencia fue detectada antes del 10º día. El informe en las cepas sensibles se emitió a las 3 semanas de la siembra.
Conclusión:En pacientes bacilíferos, la observación, con un microscopio convencional, de la presencia de microcolonias en la placa con antibióticos, sembrada directamente a partir de la muestra descontaminada, permite detectar precozmente las cepas resistentes.
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BAJO NIVEL DE RESISTENCIA EN CEPAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AISLADAS EN GIPUZKOA (1993-2001)
P. Idigoras, L. Iglesias, A. Valiente, J. Larruskain y E. Pérez-Trallero
Servicio de Microbiología, Hospital Donostia, San Sebastián (Gipuzkoa).
Objetivo: Estudiar la evolución de la susceptibilidad a los principales fármacos antituberculosos de las cepas de Mycobacterium tuberculosis aisladas en pacientes de Gipuzkoa durante los años 1993-2001.
Material y métodos: Se estudiaron 1005 cepas no seleccionadas aisladas en pacientes de distintos centros de nuestro área. Se utilizó el método de las proporciones en placas de 4 divisiones con agar Middlebrook 7H11 y discos comerciales de isoniazida (INH), rifampicina (RA), estreptomicina (STR) y etambutol (ETH) embebidos en el agar. La concentración final de los antimicrobianos en el medio fue 0,2 µg/ml y 1 µg/ml de INH, 1 µg/ml de RA, 2 µg/ml y 10 µg/ml de STR y 5 µg/ml de ETH; un cuadrante sin drogas sirvió de control de crecimiento. Las placas, selladas con Micropore®, se incubaron a 35ºC con CO2 al 5%, realizando dos lecturas los días 12 y 21.
Resultados: De las 1005 cepas estudiadas, 57 (5,7%) presentaron algún tipo de resistencia: 48 (4,8%), 10 (1%), 16 (1,6%) y 2 (0,2%) fueron resistentes a INH, RA, STR y ETH respectivamente. La resistencia a dos o más drogas se detectó en 15 cepas, aunque sólo 9 (0,9%) cumplieron los criterios de multirresistencia (al menos resistentes a INH+RA). El 65,3% de los pacientes presentaron resistencia primaria y el 34,7% adquirida. En 8 pacientes este dato no pudo ser conocido. La proporción global de cepas con resistencia primaria a INH fue inferior al 3% (sólo en 1994 y 1995 se sobrepasó ligeramente el 4%). De las 9 cepas multirresistentes, 5 se aislaron en 1997, aunque ni en este ni en otros años detectamos brotes asociados a cepas resistentes.
Conclusiones: 1) A lo largo de estos años no ha habido un incremento en la proporción de cepas resistentes. 2) La resistencia de las cepas de M. tuberculosis aisladas en nuestro medio se mantiene por debajo del límite que permite la utilización empírica de tres fármacos en el tratamiento inicial de la tuberculosis. 3) Las cepas multirresistentes no constituyen, de momento, un problema grave en nuestro medio.
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MUTACIONES DE M. TUBERCULOSIS QUE CONFIEREN RESISTENCIA A RIFAMPICINA E ISONIAZIDA EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS
C. Llanos1, M. Ruiz1, A. Criado3, M.J. Torres3, P. Ruiz2, M. Casal2, J.C. Palomares3 y J. Aznar1
1HUV Rocío (Sevilla), 2HU Reina Sofía (Córdoba), 3Dpto. Microbiología. Universidad de Sevilla.
Objetivos: Realizar la identificación epidemiológica molecular de las cepas de M. tubeculosis aisladas en distintas ciudades andaluzas resistentes a rifampicina e isoniacida. Caracterizar las mutaciones de los genes implicados en la resistencia.
Material y métodos: Se estudiaron 113 cepas resistentes a rifampicina y/o isoniacida aisladas en Sevilla, Córdoba y Jerez entre los años 1993-1999. A estas cepas se les realizó la determinación de la sensibilidad, RFLP y análisis molecular mediante PCR en tiempo real y secuenciación de los genes rpoB, katG, inhA y ahpC.
Resultados: Durante el período de 1993-1999 se han caracterizado 113 cepas de M. tuberculosis: 27 resistentes a rifampicina, 56 resistentes a isoniacida y 30 resistentes a ambos fármacos. Encontramos 9 mutaciones distintas en el gen rpoB asociadas con resistencia a rifampicina siendo la más frecuente la sustitución Ser531*Leu (36 cepas [63,1%]). No encontramos ninguna mutación en 5 cepas (8,7%) resistentes a rifampicina. Con respecto a la resistencia a isoniacida la mutación más frecuente en el gen katG fue el cambio Ser315*Thr (46 cepas [53,5%]]) y la mutación C209T la única encontrada en el inhA (5 cepas [5,8%)]. No encontramos mutaciones en el gen ahpC. En 28 cepas resistentes a isoniacida (%) no se detectó ninguna mutación. Los análisis de los RFLP detectaron tres brotes de 7, 3 y 2 pacientes entre la distintas cepas estudiadas.
Conclusiones:El mapa epidemiológico molecular de las cepas resistentes de M. tuberculosis obtenido es similar al descrito en otro países europeos y de EEUU en cuanto a las mutaciones más frecuentes. Sin embargo la gran variedad de mutaciones encontradas sobre todo en el gen rpoB y el elevado número de cepas resistentes a isoniacida en las que no se encuentra ninguna mutación hacen evidente la necesidad de este tipo de estudios
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DETECCIÓN DE RESISTENCIA A ISONIACIDA EN M. TUBERCULOSIS (MTB) MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Y "MOLECULAR BEACON"
S. Hernando, A. González-Ruiz, D. García de Viedma* y F. Chaves
Servicio de Microbiología, Hospital Doce de Octubre y *Gregorio Marañón, Madrid.
Objetivos: Identificar mutaciones en el codón 315 del gen katG, donde con más frecuencia se describen mutaciones que confieren resistencia a isoniacida (INH), en aislados clínicos de MTB mediante PCR en tiempo real y sondas fluorescentes (MB).
Material y métodos: Se procesaron 39 muestras de ADN purificado obtenidas a partir de una colección de aislados clínicos de MTB. Se estudiaron de forma ciega 16 muestras constituidas por lisados de MTB obtenidos de otro centro. La resistencia a INH se determinó mediante el método de las proporciones. La caracterización molecular de las mutaciones en el codón 315 se realizó mediante la digestión con la enzima MspAI y/o la secuenciación del fragmento de ADN. La reacción de PCR incluía los primers para la amplificación de un fragmento de 191 pb, y una sonda fluorescente de ADN (MB), complementaria de la secuencia salvaje del gen katG. La presencia de mutación en el codón 315 impide la hibridación y no se detecta fluorescencia. Se utilizó el instrumento LightCycler (Roche).
Resultados: El método detectó mutación en katG 315 en 17 de los 29 aislados (58,6%) que mostraron una CMI > 1 µg/ml. En los 6 aislados con CMI entre 0,2 y 1 µg/ml y los 4 con CMI < 0,2 µg/ml no se detectó mutación con este método. De los 16 aislados clínicos analizados de forma ciega, se detectó mutación en el codón 315 en 4 de 5 muestras resistentes a INH. El resto de muestras eran sensibles. Los resultados en ambos casos fueron concordantes con los métodos de referencia.
Conclusiones: La PCR en tiempo real unida al uso de MB es un método simple y rápido para demostrar la presencia de mutaciones en el codón 315 del gen katG y predecir resistencia INH. No obstante debido a la complejidad de la resistencia a INH en la que se ven involucrados más de un gen, quizás sea necesario diseñar primers y sondas que detecten otro tipo de mutaciones.
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DETECCIÓN DE RESISTENCIA A RIFAMPICINA EN M. TUBERCULOSIS MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Y "MOLECULAR BEACON"
A. González-Ruiz, S. Hernando. D. García de Viedma*, M. Alonso-Sanz y F. Chaves
S. de Microbiología, H. Doce de Octubre, y S. de Microbiología y E. Infecciosas, H. Gregorio Marañón*. Madrid.
Objetivo: Más del 96% de cepas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) resistentes a rifampicina (RIFr) tienen mutaciones en un fragmento de 81 pb del gen rpoB. El objetivo de este estudio fue evaluar una técnica rápida para la detección genotípica de resistencia a rifampicina en aislados clínicos de Mtb.
Material y métodos: Se incluyeron 21 muestras de ADN de una colección de aislados clínicos de Mtb sensibles (3) y resistentes a RIF (18). Se estudiaron de forma ciega 16 muestras constituidas por lisados de Mtb obtenidos de otro centro. La sensibilidad a RIF se determinó mediante el método de las proporciones. La caracterización molecular de las mutaciones se realizó mediante secuenciación de un fragmento de 255 pb que incluía la región donde se han descrito las mutaciones. El método utilizado fue una PCR en tiempo real con 5 sondas fluorescentes específicas ("molecular beacon", MB). La presencia de alguna mutación en alguno de los codones impide la hibridación y no se detecta fluorescencia. La reacción fue monitorizada mediante el instrumento LightCycler (Roche).
Resultados: El método de PCR con MB detectó algún tipo de mutación en 17 de las 18 muestras RIFr. Las muestras RIFs no presentaron ningún tipo de mutación. La secuenciación demostró que las 18 muestras RIFr presentaban 11 mutaciones diferentes, incluyendo las descritas más frecuentemente en los codones 531, 526 y 516. La única discrepancia fue una mutación descrita muy raramente en el codón 533 (T*C), que no fue detectada. Las muestras RIFs presentaban la secuencia salvaje. De los 16 aislados clínicos analizados de forma ciega, se detectó algún tipo de mutación en 10 muestras de las 11 RIFr y en ningún caso en las 5 RIFs.
Conclusiones: Nuestros resultados sugieren que la técnica de PCR en tiempo real con MB es un método simple y rápido para detectar la presencia de mutaciones en el gen rpoB y predecir la resistencia a RIF.
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INFECCIONES PRODUCIDAS POR MYCOBACTERIUM BOVIS SENSIBLES Y MULTIRRESISTENTES
P. Robles, J. Esteban, R. García Delgado, M. Górgolas y M. Fernández Guerrero
Fundación Jiménez Díaz. Universidad Autónoma de Madrid.
Se han descrito en España brotes epidémicos producidos por M. bovis MR en pacientes con SIDA. Sin embargo, desde una óptica más general, las infecciones por M. bovis no han sido objeto reciente de revisión por lo que su frecuencia, espectro clínico y pronostico son solo parcialmente conocidos. Hemos estudiados 13 casos de infecciones por M. bovis durante un período de 20 años. Estos casos suponen el 1,1% de 1172 casos probados de tuberculosis vistos en ese período. Los aislamientos fueron diagnosticados mediante tests bioquímicos y sondas de DNA. La sensibilidad in vitro fue analizada mediante un sistema de producciones y E-test.
77% eran varones y la edad media fue de 50 años; 5 (38,4%) estaban previamente sanos, 4 (30,7%) tenían SIDA, 2 padecían enfermedades pulmonares crónicas y 2 malnutrición, diabetes y tratamiento corticosteroideo. La localización de la infección y sus manifestaciones fueron predominantemente pulmonares aunque un paciente presentó enf de Pott dorsaly los 4 enfermos con SIDA infección diseminada (media de linfocitos CD4 72 mcl). En 7 (53,8%) casos M. bovis eran MR. En comparación con los pacientes con infección por M. bovis sensible al los fármacos, los pacientes con infección por M. bovis MR eran más jóvenes (39,7 vs 62,6), presentaba fiebre persistente (p < 0,001), tenias VSG elevada e hiponatremia (p < 0,04), tenían infecciones diseminadas (57% vs 0), y mayor mortalidad (71% vs 16,6%). Solo una mujer inmunocompetente se curó se la infección por M. bovis MR. El resto fallecieron o desarrollaron infecciones crónicas intratables.
Las infecciones producidas por M. bovis son infrecuentes en nuestro medio. Los aislamientos MR son más frecuentes en personas con SIDA pero no exclusivos de ellas. El pronóstico depende, no solo se la resistencia, sino de la situación inmunológica del sujeto.
