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SUSCEPTIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIFÚNGICOS DE LEVADURAS AISLADAS DE EXUDADOS VAGINALES
M.J. Linares, F. Solís, F.C. Rodríguez y M. Casal
Departamento de Microbiología. Facultad de Medicina. H.U. Reina Sofía. Córdoba.
Objetivo: Determinar las especies de organismos levaduriformes más frecuentemente aislados a partir de exudados vaginales y su susceptibilidad in vitro a cinco antifúngicos.
Material y métodos: Se incluyeron en el estudio todas las especies aisladas a partir de exudados vaginales, desde enero a octubre del 2001. La identificación se llevó a cabo mediante la determinación del color de la colonia tras el aislamiento y/o cultivo en el medio de CHROMagar Candida y métodos bioquímicos convencionales. El estudio de sensibilidad se realizó utilizando un test de microdilución en placa, que detecta la CMI de fluconazol (FL), itraconazol (IT), ketoconazol (KT), anfotericina B (AB) y 5-fluorcitosina (5F).
Resultados: Se identificaron un total de 529 cepas de organismos levaduriformes. El orden de frecuencia de estas especies fue: C. albicans (425/80%), C. glabrata (63/12%), C. parapsilosis (18/3%), C. krusei (6/1%), C. tropicalis (6/1%), C. famata (3), C. guillermondii (2), C. lusiataniae (2), Rhodotorula glutinis (2), R. mucilaginosa (2), C. rugosa (1), Saccharomyces cerevisiae (1). El 12% de los cultivos fueron cultivos mixtos, en el 92% de ellos se aislaron C. albicans mas C. glabrata. Anfotericina B fue la droga mas activa frente a todas las cepas testadas con una CMI90 de 0,25 mg/L. Respecto a C. albicans el orden de actividad de los diferentes antifúngicos, basados en los resultados de la CMI fue: AB (CMI90, 0,25 mg/L) > 5F (CMI90 0,5 mg/L) > KT (CMI90, 1mg/L) > IT (CMI90, 2mg/L) > FL (CMI90, 32 mg/L). La CMI90, de los imidazoles frente a C. glabrata fueron: 256 (FL), 16 (IT) y 1 (KT).
Conclusiones:C. albicans y C. glabrata fueron las especies mas frecuentemente aisladas, a veces incluso asociadas. Un numero elevados de cepas de C. albicans se manifiestan resistente in vitro a itraconazol.
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ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE CANDIDA SPP. A VORICONAZOL: ETEST VERSUS MICRODILUCIÓN
M.C. Serrano, M. Chávez, A. Valverde, R. Claro, M. Ramírez, D. Morilla, S. Bernal y E. Martín-Mazuelos
Servicio Microbiología. H.U. Valme. Sevilla.
Objetivo: Comparar las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs) de voriconazol (V) obtenidas por el método del Etest y por el método de referencia (NCCLS, documento M27A) para Candida spp.
Material y métodos: Se ha estudiado la sensibilidad a V de 168 C. albicans: 101 S a fluconazol (F), 31 SDD y 36 R, 26 C. glabrata y 9 C. tropicalis, usando el método de microdilución (MD) y el método del Etest (AB Biodisk, Sweden). Las CMIs por el método del Etest fueron determinadas en RPMI 1.640 + 2% de glucosa (Izasa) a las 24 h y 48 h. La CMI para el método de MD fue definida como la menor concentración de antifúngico que produjo una inhibición del crecimiento del 80%, la lectura fue a las 24 h. El rango de concentraciones ensayadas de V por MD fue de 0,03-16 µg/ml, por Etest fue de 0,012-32 mg/l. Cepas QC ATCC: C. krusei 6258, y C. parapsilosis 22019.
Resultados: La MIC50/90 a las 24 h y 48 h por Etest para las diferentes especies fue: C. albicans: S a F (101) ¾ 0,03/¾ 0,03 y ¾ 0,03/0,06, SDD a F (31) 0,06/0,12 y 0,06/0,5, R a F (36) 0,06/1 y 0,12/2, Total (168) ¾ 0,03/0,12 y 0,03/0,5. C. glabrata (26) 0,12/0,25 y 0,5/2. C. tropicalis (9) 0,12/0,25. Total (203) ¾ 0,03/0,25 y 0,06/1. La MIC50/90 a las 24 h por MD para las diferentes especies fue: C. albicans: S a F (101) ¾ 0,03/0,06, SDD a F (31) 0,06/0,5, R a F (36) ¾ 0,03/0,5, Total (168) ¾ 0,03/0,12. C. glabrata (26) 0,12/0,25. C. tropicalis (9) ¾ 0,03/0,12. Total (203) ¾ 0,03/0,12. Los % de correlación Etest/MD ± 2 diluciones 24 h/24 h y 48 h/24 h fueron: C. albicans S a F 98 y 94, SDD a F (31) 96,7 y 90, R a F (36) 91,6 y 88,8, total 96,4 y 92,2. C. glabrata 84,4 y 46. C. tropicalis 88,8 y 66,6. Total (203) 95 y 85,2.
Conclusiones: 1) Los resultados sugieren la utilidad del Etest como método alternativo para el estudio de la sensibilidad de Candida spp. a voriconazol. 2) Por ambos métodos se observan valores mayores de CMI90 para C. albicans SDD y resistente a fluconazol. 3) El valor clínico de estos resultados in vitro deben ser estudiados en ensayos clínicos.
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ACTIVIDAD IN VITRO DE VORICONAZOL Y FLUCONAZOL SOBRE LEVADURAS PROCEDENTES DE HEMOCULTIVO
J. Pemán, E. Cantón, A. Orero, A. Molina, A. Viudes y M. Gobernado
Servicio de Microbiología, Hospital Universitario La Fe, Valencia.
Objetivos: Determinar la actividad antifúngica de voriconazol (VZ) y fluconazol (FZ) en diferentes especies de levaduras aisladas en hemocultivo.
Métodos:Se analizaron un total de 143 cepas de levaduras (65 C. albicans, 52 C. parapsilosis, 9 C. tropicalis, 10 C. glabrata, 3 C. krusei, 2 C. famata, 1 C. guilliermondii y 1 Y. lipolytica) procedentes de hemocultivos. La CMI se determinó por el método M27-A, la lectura se realizó, a las 24 y 48 h de incubación, visual y espectofotométricamente. La CMI para ambas lecturas fue la menor concentración de antifúngico que inhibió el >= 50% de crecimiento respecto al control.
Resultados: Los intervalos de la CMI de VZ/FZ fueron: C. albicans 0,004-> 2/0,06-64; C. parapsilosis 0,004-> 2/0,12-64; C. tropicalis 0,06-> 2/1-64; C. glabrata 0,03-> 2/0,12-64; C. krusei 0,06/16-32; C. famata, 0,12-0,5/2-4; C. guilliermondii 0,016/1 y Y. lipolytica, 0,03-16. La CMI50/CMI90 de VZ para C. albicans fue: 0,5/> 2; C. parapsilosis 0,016/0,12; C. tropicalis 0,5/> 2; C. glabrata >2/> 2, C. krusei 0,06/0,06. La CMI50/CMI90 de FZ para C. albicans fue: 0,25/8; C. parapsilosis 1/2; C. tropicalis 2/64; C. glabrata 4/64 y C. krusei 16/32. Las especies más sensibles a VZ fueron C. parapsilosis y C. krusei. C. albicans presentó un crecimiento mantenido a concentraciones elevadas de VZ lo que dificultaba su lectura visual, precisando la lectura espectofotométrica para la determinar el punto de corte. La CMI50/CMI90 de VZ para C. albicans fue: 0,5/> 2; C. parapsilosis 0,016/0,12; C. tropicalis 0,5/> 2; C. glabrata > 2/> 2 y C. krusei 0,06/0,06. Las cepas C. albicans resistentes a FZ también lo fueron a VZ; por el contrario, las cepas de C. parapsilosis resistentes a FZ, fueron sensibles a VZ.
Conclusiones:VZ presenta muy buena actividad sobre C. parapsilosis y C. krusei. Para determinar la sensibilidad de C. albicans a VZ se recomienda utilizar la lectura espectofotométrica previa agitación de los pocillos.
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RESISTENCIA A ANTIFÚNGICOS DE AISLADOS DE CANDIDA SPP DE HEMOCULTIVOS EN UN PERÍODO DE 5 AÑOS
D. Velasco, E. Gil, F. Molina, R. Villanueva, R. Moure y M.T. Durán
Servicio de Microbiología. C.H. Juan Canalejo. A Coruña.
Objetivo: Estudiar la sensibilidad a antifúngicos de los aislados de Candida spp de hemocultivos en el período enero de 1997 a octubre de 2001 en nuestro hospital.
Métodos:Se consideró un aislado/episodio de candidemia/ paciente. En total se aislaron 54 Candida spp: 22 C. parapsilosis, 20 C. albicans, 5 C. glabrata, 3 C. krusei, 2 C. tropicalis y 2 C. guilliermondii.
Las CMIs de anfotericina B (AB), fluconazol (FLU), itraconazol (ITRA) y 5-flucitosina (5FC) se determinaron por el método de microdilución en caldo Sensititre/Alamar Yeast One (IZASA), siguiendo la metodología NCCLS (M27 A) para los 54 aislados.
Resultados: No hubo ningún aislado resistente a AB. La resistencia a FLU fue 5,5%. Sólo los tres aislados de C. krusei fueron resistentes a FLU, aunque cuatro de los cinco aislados de C. glabrata fueron sensibles dependiendo de la dosis (S-DD) con CMI > 8 µg/ml. La resistencia a ITRA fue 7,5% y se dio en cuatro de las cinco C. glabrata. Estos cuatro aislados fueron S-DD a FLU, presentando por tanto esta especie de Candida resistencia cruzada entre ITRA y FLU. Seis aislados (2 C. krusei, 2 C. guilliermondii, 1 C. parapsilosis y 1 C. tropicalis) fueron S-DD a ITRA. La resistencia global a 5FC fue 1,8%. Sólo 1 C. parapsilosis fue resistente. Dos aislados (1 C. guilliermondii y 1 C. krusei) presentaron resistencia intermedia.
Conclusiones:La resistencia a antifúngicos de especies de Candida aisladas de hemocultivos en nuestro hospital es baja. No hubo ningún aislado resistente a AB. La resistencia o sensibilidad disminuida a FLU (CMI > 8 µg/ml), principal azol utilizado en terapia antifúngica de la candidemia, se presentó en 13% de los aislados estudiados, y afectó a 100% de C. krusei y 80% de C. glabata.
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CRIBADO DE CANDIDA SPP CON SENSIBILIDAD DISMINUIDA A FLUCONAZOL MEDIANTE CHROMAGAR-CANDIDA CON FLUCONAZOL
D. Canle, D. Velasco, M. Tomás, F. Molina, R. Villanueva y M.T. Durán
Servicio de Microbiología. C.H. Juan Canalejo. A Coruña.
Objetivo: Estudiar la validez del método CHROMagarCandida con fluconazol (Patterson) en la detección de Candida spp con sensibilidad disminuida a fluconazol. Correlación con el método de microdilución (SENSITITRE/ALAMAR YEAST ONE, IZASA) utilizado en nuestro laboratorio.
Métodos: Se estudiaron 59 aislados clínicos y dos cepas control de Candida spp: 23 C. albicans, 23 C. parapsilosis, 6 C. glabrata, 3 C. krusei, 2 C. tropicalis, 2 C. guillermondi, C. krusei ATCC6258 y C. parapsilosis ATCC22019. Se prepararon placas de CHROMagarCandida con 8 µg/ml de fluconazol. Se sembraron en paralelo placas de CHROMagar con y sin fluconazol con una suspensión 0,5 de McFarland de cada aislado. La lectura de crecimiento se realizó después de 48 h de incubación a 37 ºC.
Se consideraron sensibles a fluconazol los aislados que no crecían en la placa o que formaban colonias diminutas en relación con la placa control libre de fluconazol. Cuando las colonias en ambas placas eran de semejante tamaño los aislados se clasificaron como no sensibles. Los resultados se compararon con las CMI obtenidas en los paneles SENSITITRE.
Resultados: Los aislados dieron un rango de CMI entre ¾ 0,125 y 32 µg/ml. Los 10 aislados con CMI >= 8 µg/ml fueron clasificados como no sensibles mediante la placa de CROMagar con fluconazol. (Sensibilidad = 100%). De los 51 aislados con CMI < 8 µg/ml 49 fueron clasificados como sensibles mediante la placa de CHROMagar con fluconazol. (Especificidad = 96,0%). Correlación entre métodos = 96,7%.
Conclusiones:El método de CHROMagar-Candida con 8 µg/ml de fluconazol puede ser adecuado en el cribado de cepas de Candida con sensibilidad disminuida a fluconazol. Con las especies más frecuentes en nuestro hospital, (C. albicans y C. parapsilosis), el método presentó concordancia absoluta. Son necesarios estudios con mayor número de cepas especialmente con especies menos frecuentes.
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SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA DE LEVADURAS AISLADAS EN INFECCIONES SISTÉMICAS
M. Soler, S. Hernáez, M. Lamata, M. Fernández, J.L. Del Pozo y M. Rubio
Servicio de Microbiología Clínica. Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona.
Objetivo: Analizar el patrón de sensibilidad de diferentes levaduras por dos métodos: Difusión en placa y sistema YEAST ONE (Sensititre).
Material y métodos: Se emplearon 25 levaduras aisladas de muestras clínicas de pacientes con infección sistémica, que correspondían a hemocultivo (11), biopsia pleural (4), líquido ascítico (3), bilis (2), catéter (2), absceso hepático (2) y absceso pancreático (1). Las levaduras fueron identificadas mediante estudio de la morfología y pruebas de asimilación y fermentación, sensibilidad a cycloheximida e hidrólisis de la urea. Las especies identificadas fueron: Candida albicans (10), C. parapsilosis (4), Saccharomyces cerevisiae (3), C. glabrata (2), C. famata (1), C. pseudotropicalis (1), C. lusitaniae (1), C. tropicalis (1), C. krusei (1) y Cryptococcus uniguttulatus (1). Se estudió la sensibilidad in vitro de las citadas levaduras frente a: Anfotericina B, Fuconazol, Itraconazol, Ketoconazol y 5-Fluorocitosina, por los métodos de difusión en placa y YEAST ONE (Sensititre).
Resultados: La lectura de las pruebas del método de difusión se realizó midiendo el diámetro del halo de inhibición y la de las placas "Sensititre" según los criterios NCCLS M27-A. El intervalo de la CMI de Anfotericina B fue 0,03-0,125 µg/ml (CMI modal: 0,06 µg/ml), por lo que todas resultaron sensibles. El intervalo de la CMI del Fluconazol fue 0,125-64 µg/ml (CMI modal: 0,5 µg/ml), 5 cepas presentaron CMI dosis dependiente), y una fue resistente. El intervalo de la CMI del Itraconazol fue 0,008-2 µg/ml (CMI modal: 0,06 µg/ml), dos cepas fueron resistentes y 4 presentaron CMI dosis dependiente. El intervalo de la CMI del Ketoconazol fue 0,008-2 µg/ml (CMI modal: 0,008 µg/ml), una cepa fue resistente y otra intermedia. El intervalo de la CMI de la 5-Flurocitosina fue 0,03-16 µg/ml (CMI modal: 0,03 µg/ml), dos cepas fueron intermedias. Por el método de difusión en placa, todas las cepas resultaron sensibles a Anfotericina B y a 5-Fluorocitosina, 4 fueron resistentes y 2 intermedias a Fluconazol, 4 intermedias y una resistente a Itraconazol y 3 intermedias a Ketoconazol.
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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE ANFOTERICINA B EN LEVADURAS
E. Cantón, J. Pemán, J. Frasquet, J. Cano, A. Viudes y M. Gobernado
Servicio de Microbiología, Hospital Universitario La Fe Valencia.
Objetivos: Determinar la actividad fungicida de anfotericina B en diferentes especies de Candida aisladas en hemocultivo.
Métodos:Se analizaron un total de 173 cepas de levaduras (27 C. albicans, 104 C. parapsilosis, 13 C. tropicalis, 14 C. glabrata y 15 C. krusei) procedentes de hemocultivos de pacientes ingresados en el hospital La Fe. La CMI fue determinada según las indicaciones del NCCLS (M27-A) utilizando dos inóculos: 0,5-5 x 103 y 0,5-5 x 104 UFC/ml. Para determinar la concentración mínima fungicida (CMF) se sembró todo el volumen de los pocillos sin crecimiento visible de la CMI, determinada con el inóculo más elevado, en placas de agar glucosado de Sabouraud. La CMF se define como la concentración más baja que inhibe al 99,9% del inóculo.
Resultados. Las CMIs no variaron significativamente (± 1 dilución) con los dos inóculos empleados. Los intervalos de la CMI/CMF fueron: C. albicans, 0,12-0,5/0,25-2; C. parapsilosis, 0,5-2/0,5-64; C. tropicalis, 1-4/1-16; C. glabrata, 2-4/2-32 y C. krusei, 0,5-1/0,5-16. La media geométrica de la CMI/CMF fue: C. albicans, 0,35/0,5; C. parapsilosis, 1,02/3,18; C. tropicalis, 2,47/7,58; C. glabrata, 2,97/6,24 y C. krusei, 1,0/2,75. Las especies más resistentes fueron C. glabrata y C. tropicalis. El porcentaje de cepas en las cuales la CMF fue ¾ 2 x CMI fue: C. albicans, 96,3%; C. parapsilosis, 60,6%; C. tropicalis, 61,5; C. glabrata, 71,4% y C. krusei, 40,0%.
Conclusiones:Debido al elevado porcentaje de cepas no-albicans con CMF > 4 µg/ml, en aquellas infecciones producidas por estas especies que requieran la eliminación completa del agente infeccioso (p.e. endocarditis) se debería determinar la CMF, en lugar de la CMI.
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COMPARACIÓN DE TRES MÉTODOS DE SUSCEPTIBILIDAD DE LEVADURAS FRENTE AL ÁCIDO BÓRICO
L. Otero, V. Palacio, F.J. Méndez y F. Vázquez
Servicios de Microbiología de los Hospitales de Cabueñes, Gijón. Monte Naranco, Oviedo.
Objetivos: El ácido bórico es un compuesto fungiestático que se emplea en el tratamiento de las candidiasis vulvovaginales recurrentes y que ha sido propuesto en las vulvovaginitis producidas por especies no albicans. No existe metodología estandarizada para la realización de pruebas de susceptibilidad al ácido bórico. En este trabajo comparamos tres metodologías para determinar cual es la mas apropiada.
Métodos:Se estudiaron 37 Saccharomyces cerevisiae, 25 Candida glabrata, 8 C. parapsilosis, 2 C. guilliermondii, y 1 C. famata, C. tropicalis, C. krusei y Trichosporon sp. procedentes de mujeres prostitutas con vulvovaginitis que acudieron a la consulta de ETS del Hospital Monte Naranco de Oviedo. En cada aislamiento se determinó la CMI al ácido bórico mediante: 1) dilución en agar con alta densidad de inóculo (DAAD). 2) Dilución en agar con baja densidad de inóculo (DABD). 3) Microdilución en caldo (MDC) siguiendo las recomendaciones del NCCLS M27-A. En los tres casos el inóculo fue ajustado mediante espectofotómetro. Se consideró concordancia cuando la diferencia de CMI obtenida por diferentes métodos es menor o igual a dos diluciones.
Resultados: La concordancia entre DAAD y DABD fue del 100%. Entre ADBD y MDC fue igualmente del 100%. Entre DAAD y MDC la concordancia fue del 83%, presentando discrepancias 12 cepas (92%) de C. glabrata y 1 cepa de S. cerevisiae. En todos estos casos la mayor CMI siempre se obtuvo con DAAD. La lectura de los métodos de dilución en agar se ve dificultada por la presencia de microcolonias, siendo más sencilla en el caso de MDC.
Conclusiones: Existe una elevada concordancia entre los tres métodos estudiados, pero debido a la más fácil lectura de los resultados y a su extendida implantación en los laboratorios de microbiología clínica, la microdilución en caldo es el método mas apropiado para determinar la susceptibilidad de levaduras al ácido bórico.
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CORRELACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DIFUSIÓN EN AGAR Y MICRODILUCIÓN EN EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS A FLUCONAZOL
R.M. Claro, M.C. Serrano, M. Ramírez, M.D. Morilla, O. Montero y E. Martín Mazuelos
Hospital Universitario Valme. Dpto. Microbiología. Sevilla.
Objetivo: Valorar un método de difusión en agar frente al de microdilución en caldo (MDM) para el estudio de sensibilidad de C. neoformans.
Materiales y método: Se estudiaron 43 cepas de C. neoformans, 41 de ellas procedentes de muestras clínicas y 2 cepas de control de calidad (ATCC 90112 y ATCC 90113). El test de difusión en agar se realizó con discos caseros de 25 µg en placas de Mueller-Hinton suplementado con 2% de glucosa y 5 µg/ml de azul de metileno. El MDM se realizó en YNB con 2% de glucosa según las normas del documento M27-A de la NCCLS. La lectura de ambos métodos se llevó a cabo a las 48 y 72 h. Un análisis de regresión definió como resistentes las cepas cuyo halo era < 18 mm en el test de difusión en agar. Por otra parte, se consideraron resistentes las cepas con CMI >= 16 µg/ml según el trabajo de Aller et al (Antimicrobial Agents Chemotherapy 2000;44:1544-1548).
Resultados: 5 cepas no crecieron en Mueller-Hinton a las 48 h y sólo una más lo hizo a las 72 h.
Conclusiones: 1) La mejor correlación para cepas sensibles es MDM a las 48 o 72 h y difusión en agar a las 48 h (100%). 2) La mejor para las resistentes es MDM a las 48 h y difusión en agar a las 72 h (50%). 3) El método de difusión en agar es útil para la detección de cepas sensibles pero no para la de resistentes.
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SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS EN ESPECIES DE CRYPTOCOCCUS
J. Ruiz, P. García-Martos, A. Saldarreaga, A. Sepúlveda, A. García-Tapia y J. Mira
Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz.
Objetivos: Determinar la sensibilidad in vitro a antifúngicos de diversas especies del género Cryptococcus, pues aunque las infecciones por especies distintas a C. neoformans son raras, se han descrito ocasionalmente en los últimos años.
Material y métodos: Se ensayaron un total de 34 cepas de Crytotococcus pertenecientes a 7 especies diferentes: 12 C. neoformans, 9 C. albidus, 5 C. uniguttulatus, 3 C. humicolus, 2 C. laurentii, 2 C. luteolus y 1 C. infirmo-miniatus, procedentes de muestras clínicas y ambientales, identificadas por métodos convencionales y el sistema comercial ID 32C (BioMérieux, France). La sensibilidad a 5 antifúngicos (anfotericina B, fluconazol, itraconazol, ketoconazol y 5-fluorocitosina) se determinó mediante el sistema Sensititre YeastOne (AccuMed International, UK) y el método de referencia de microdilución recomendado por el NCCLS (M27-A), utilizando como control las cepas Candida albicans ATCC 90028 y Cryptococcus neoformans ATCC 2344.
Resultados: Todas las cepas fueron sensibles a anfotericina B. Frente a fluconazol hubo 19 cepas (55,9%) con CMI >= 64 µg/ml (4 C. neoformans, 9 C. albidus, 5 C. uniguttulatus y 1 C. infirmo-miniatus). Frente a itraconazol se detectaron únicamente 9 cepas (26,5%) con CMI >= 1 µg/ml (5 C. albidus y 4 C. uniguttulatus). Frente a ketoconazol sólo 6 cepas (17,6%) mostraron CMI >= 2 µg/ml (5 C. albidus y 1 C. infirmo-miniatus). Con respecto a 5-fluorocitosina se encontraron 20 (58,8%) cepas con una CMI >= 32 µg/ml (4 C. neoformans, 9 C. albidus, 5 C. uniguttulatus y 2 C. luteolus).
Conclusiones:La resistencia a derivados azólicos es elevada en las diferentes especies del género Cryptococcus, especialmente en C. albidus y C. uniguttulatus. La resistencia a 5-fluorocitosina engloba a un tercio de las cepas de C. neoformans y a todas las cepas de C. albidus, C. uniguttulatus y C. luteolus ensayadas en nuestro estudio.
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CUANTIFICACIÓN DE QUITINA (CQ) PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD IN VITRO DE COMBINACIONES DE ANTIFÚNGICOS FRENTE A A. FUMIGATUS (AF)
J. Gavaldà, P. López, M.T. Martín, M. Cuenca-Estrella*, X. Gomis, J.L. Ramírez, J.L. Rodríguez-Tudela* y A. Pahissa
*ISCIII, Madrid. Hosp. Vall d'Hebron. Barcelona.
No existe una técnica cuantitativa que evalúe la actividad in vitro de combinaciones de antifúngicos frente a AF.
Objetivo: Evaluar la utilidad de la CQ en el estudio de la actividad de antifúngicos en combinación.
Métodos:Se estudiaron las combinaciones de anfotericina B (Ab) y Voriconazol (V) o Terbinafina (T) y de V + T frente a 2 cepas de AF (91 y JJ) mediante checkerboard, según recomendación del NCCLS para estudio de CIM, y CQ. CQ: Se prepararon tubos con 4 mL de YNB tamponado + 2% de glucosa con Ab (0,5-1 mg/L), V (0,125-0,25 mg/L) y T (1-2 mg/L) solos o combinados y se inocularon con 5 x 105 conidias/mL. Tras 24 y 48 h de incubación se procesaron para CQ mediante extracción alcalina y cuantificación fotocolorimétrica. La CQ se expresó como µg de glucosamina (GC). Para las combinaciones se calculó el índice de actividad (IA) como 1-(GC combinación/GC antifúngico más activo). Se consideró sinergia si IA 3 > 0,5 indiferencia entre 0,5 y 0,5 y antagonismo ¾ -0,5.
Resultados: El checkerboard no evidenció interacción. A 48 h el IA fue >= 0,5 en las combinaciones de V 0,5 y 1 mg/L con T 1 y 2 mg/L para las dos cepas de AF. Para el resto de combinaciones el IA fue < 0,5.
Conclusiones:La CQ puede ser una técnica cuantitativa útil y reproducible para evaluar la actividad de las combinaciones de antifúngicos. Nuestros resultados indican un posible antagonismo entre Ab + V o T, y una posible sinergia entre V + T.
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UTILIDAD DE LA CUANTIFICACIÓN DE QUITINA (CQ) PARA EL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD IN VITRO DE ANFOTERICINA B (Ab) FRENTE A ASPERGILLUS SPP. (Asp)
J. Gavaldà*, M.T. Martín*, P. López*, M. Cuenca-Estrella**, X. Gomis*, J.L. Ramírez*, J.L. Rodríguez-Tudela** y A. Pahissa*
*Hospital Vall d'Hebron, Barcelona. **Instituto de Salud Carlos III, Madrid.
No hay clara correlación entre la CIM de Ab y su actividad in vivo frente Asp.
Objetivo: Estudiar la utilidad de la cuantificación del desarrollo de quitina para evaluar la actividad in vitro de Ab frente a Asp.
Métodos:Se estudiaron 5 cepas de A. fumigatus (AF) y 3 de A. terreus (AT). Se determinó la CIM según recomendación del NCCLS (M38-P) modificada, en RPMI + 2% glucosa con un inóculo de 2-5 x 105 esporas/mL. La CQ se determinó en tubos que contenían Ab en 4 mL de caldo YNB + 2% glucosa (pH 7) e inoculados con 5 x 105 conidias/mL. Tras 24 y 48 h de incubación, la CQ se realizó por extracción alcalina, derivación a glucosamina y cuantificación fotocolorimétrica. Los resultados de CQ se expresaron como la concentración de Ab que produjo el 50 o 90% de inhibición de síntesis de quitina (SQ) respecto al control de crecimiento.
Resultados: La CIM fue = 1 mg/L en 4 de las cepas de AF y de 2 en una cepa, y de 4 mg/L en las 3 cepas de AT. En AF a 24 h se redujo la SQ > 50% a concentraciones de Ab ¾ 0,25 mg/L, la reducción del 90% se obtuvo con 0,25 mg/L en las cepas con CIM = 1 mg/L y no se inhibió la SQ al 90% con 2 mg/L en la cepa con CIM = 2 mg/L. A 48 h, en las cepas con CIM = 1 mg/L se redujo al 50% la SQ con 0,125-0,5 mg/L de Ab y al 90% con 0,25-0,5 mg/L. La cepa con CIM = 2 mg/L redujo la SQ al 50% con 0,5 mg/L, sin detectarse reducción del 90% a concentraciones de Ab ¾ 2 mg/L. En AT la reducción del 50% a 24 h se consiguió con 2-4 mg/L de Ab y el 90% solo en una cepa con 8 mg/L. A 48 h concentraciones de Ab ¾ 8 mg/L no inhibieron el 90% de la SQ.
Conclusiones:El % de inhibición de SQ no se correlaciona con la CIM de Ab. En las cepas de AT, se necesitan concentraciones > 8 µg/mL de Ab para conseguir el 90% de inhibición de la SQ. La cuantificación de la biomasa fúngica mediante determinación del % de inhibición de SQ puede ser más discriminativo que la CIM para evaluar la actividad de Ab frente a Asp.
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UNA MUTACIÓN PUNTUAL DEL GEN cyp51A DE LA 14*-DESMETILASA CONTRIBUYE A LA RESISTENCIA AL ITRACONAZOL (ITC) EN ASPERGILLUS FUMIGATUS
T.M. Díaz-Guerra, E. Mellado, M. Cuenca-Estrella y J.L. Rodríguez-Tudela
Instituto de Salud Carlos III. Madrid.
Objetivos: Uno de los mecanismos propuestos para la resistencia de A. fumigatus al ITC es la alteración de la enzima diana del ITC y de los demás derivados azólicos, la enzima 14*-desmetilasa. Recientemente, se han descrito los dos genes que codifican esta enzima en A. fumigatus, cyp51A y cyp51B. En este trabajo, se han comparado las secuencias de estos dos genes en cepas con diferente sensibilidad frente al ITC para identificar posibles mutaciones en los genes de cepas resistentes.
Métodos: Se eligieron 6 cepas de A. fumigatus con CMIs de ITC > 16 µg/ml y dos cepas con CMIs ¾ 0,5 µg/ml. Para confirmar estos valores se realizaron pruebas de sensibilidad in vitro, usando medio RPMI suplementado con un 2% de glucosa y un inóculo de 1-5 x 105 UFC/ml. Se amplificaron por PCR los genes cyp51A y cyp51B de cada una de las cepas, usando iniciadores específicos y, a continuación, se secuenciaron. Las secuencias cyp51A y cyp51B de la cepa AF-237, que es la cepa que se utilizó para la descripción de estos dos genes, y que, además, es sensible al ITC, se utilizaron como secuencias de referencia.
Resultados: En tres de las seis cepas resistentes a ITC analizadas, se encontró un cambio de base en el triplete que codifica el aminoácido 54 de la secuencia Cyp51A. Este cambio fue distinto en cada una de las tres cepas mutadas: la cepa AF-796 presentó una sustitución de guanina por timina en la posición 161 (G161T); en la cepa AF-72 se encontró la sustitución G161A y en la cepa AF-1237, la mutación detectada fue G160A. El aminoácido sustituido en estas tres cepas es una glicina, y se trata de un residuo altamente conservado en las secuencias Cyp51 de un amplio rango de organismos. La cepa resistente a ITC, AF-1237, portadora de la mutación G160A es genéticamente indistinguible de otra cepa aislada del mismo paciente, la cepa AF-1119. Esta cepa AF-1119 fue sensible al ITC y no presentó la mutación.
Conclusiones: La mutación detectada en las secuencias Cyp51A de 3 cepas resistentes al ITC (sustitución de la glicina 54), parece estar relacionada con la resistencia al ITC.
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ACTIVIDAD IN VITRO DE TERBINAFINA SOLA Y COMBINADA CON OTROS ANTIFÚNGICOS FRENTE A 15 AISLADOS CLÍNICOS DE ZYMGOMYCOTA
A. Gómez-López, M. Cuenca-Estrella y J.L. Rodríguez-Tudela
Dpto. Micología. CNM. ISCIII. Majadahonda, Madrid.
La combinación de antifúngicos supone una nueva estrategia de tratamiento para ciertas infecciones fúngicas.
Objetivo: Evaluar la interacción entre TB, ITZ y AMB como posible alternativa de tratamiento.
Método: Se analizó la actividad in vitro de los tres antifúngicos empleando una modificación del método M38-P (NCCLS) frente a 15 aislados de la división Zygomycota. El efecto sinérgico se valoró mediante el método del tablero de ajedrez, considerando sinérgicas las combinaciones con índice FIC ¾ 0,5 antagónicas si > 4 e indiferentes cuando varió entre 0,5 y 4.
Resultados: Se reflejan en la tabla adjunta:
Conclusiones: 1) TB y/o ITZ se mostraron inactivos para muchas de las cepas estudiadas (CMI >16 y > 64 µg/mL respectivamente), sin embargo la combinación de ambos antifúngicos resultó sinérgica en la mayoría (8/9). 2) AMB tuvo buena actividad in vitro, con valores de CMI que variaron entre 0,12 y 2 µglmL. 3) La combinación de AMB/TB no mostró ninguna actividad sinérgica para este grupo de hongos.
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CONSECUENCIAS DEL TRATAMIENTO CON ANFOTERICINA B EN CONDICIONES DE PRÁCTICA CLÍNICA EN ESPAÑA
M. Sanz Alonso, F.J. López Jiménez, C. Rayón Suarez, V.G. García de Soria, R. Martínez Martínez, L. Vázquez-López, G. Nocea y C. López-Lavid
Merck & Comp. Investigación de Resultados. Whitehouse Station. New Jersey, EE.UU.
Objetivos: Estudiar la frecuencia e impacto de los efectos adversos (EA) de la anfotericina B (AnB) en la práctica clínica habitual en España.
Material y métodos: Se inició un estudio observacional multicéntrico para recoger datos prospectivamente sobre la estancia hospitalaria de adultos tratados con AnB convencional (c-AnB) o AnB lipídica (l-AnB). Los datos se introdujeron en una base de datos relacional a través de internet. El período de seguimiento por paciente comprendió desde el inicio del tratamiento con AnB hasta el alta hospitalaria. Se definió nefrotoxicidad (NT) como un aumento del 50% en creatinina sérica, con un pico de más 2,0 mg/dl sobre el valor basal. Se recogieron todos los demás EA documentados y relacionados a juicio clínico con AnB. Se realizó un análisis multivariante, y se agrupó a los pacientes en función del tipo de anfotericina inicialmente recibida, independientemente de los cambios de tratamiento posteriores.
Resultados: Se analizaron 91 pacientes con datos completos, tratados entre dic/00-sept/01 en las unidades de hematología de 6 hospitales españoles, de 49 años de edad media, siendo un 46% mujeres. Leucemia fue el diagnóstico más frecuente (77%). Un 78% presentó neutropenia (NP) al inicio del tratamiento con AnB. Un 91% recibió la AnB para tratar una infección sospechada o posible. Un 46% del total de pacientes recibió de inicio c-AnB, de los cuales un 55% tuvo que ser sustituirla por l-AnB. Un 60% y un 37% de los tratados de inicio con c-AnB y l-AnB respectivamente padeció algún EA (p = 0,03), con un porcentaje similar de NT en ambos grupos (14%). La NT se asoció a una mayor mortalidad hospitalaria (OR = 4,73, p = 0,02) tras ajustar por edad, NP y patología de base, y entre aquellos que sobrevivieron, a una mayor estancia hospitalaria (mediana 18 días sin NT vs. 34 con NT, p = 0,01).
Conclusión:Los pacientes tratados con c-AnB y l-AnB presentaron con frecuencia EAs, entre ellos NT. La NT puede contribuir a aumentar la mortalidad intrahospitalaria y la estancia media hospitalaria.
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EFICACIA DEL TRATAMIENTO CON DOSIS ALTAS INICIALES DE ANFOTERICINA B LIPOSOMAL (Ab-L) EN EL TRATAMIENTO DE LA ASPERGILOSIS PULMONAR EXPERIMENTAL (APE)
J. Gavaldà, P. López, M.T. Martín, X. Gomis, J.L. Ramírez, B. Almirante y A Pahissa
Hospital Vall d'Hebron. Barcelona.
La eficacia del tratamiento antifúngico de la aspergilosis pulmonar invasora resulta subóptima. Se ha demostrado que el incremento de las dosis de Ab-L comporta un aumento de anfotericina en tejido pulmonar o renal, pero no hepático, sugiriendo acumulación saturable por el sistema retículoendotelial hepático y probablemente esplénico.
Objetivo: Evaluar la eficacia de Ab-L a una dosis de carga de 10 mg/kg/d seguida por una dosis de 3 mg/kg/d en un modelo experimental de APE.
Métodos: Se trataron ratas Wistar con 3 dosis semanales de 125 mg/kg de acetato de cortisona el tiempo que duró el experimento, al 15º día del inicio de los corticoides se infectaron por vía transtraqueal con 0,3 mL de una suspensión de 1 x 107 conidias/mL de un aislamiento clínico de Aspergillus fumigatus. A las 24 h de la infección se inició el tratamiento por un catéter iv. Los grupos de tratamiento fueron: control (n = 28); AB 1 mg/kg/d 7 d (n = 22); Ab-L 5 mg/kg/d 7 d (n = 32) o Ab-L 10 mg/kg durante 2 (n = 33), 3 (n = 34) o 4 (n = 21) d seguida de Ab-L 3 mg/kg/d hasta completar 7 días. Se evaluó la eficacia en ratas tratadas >= 5 d mediante cuantificación de quitina como índice de masa fúngica pulmonar; el peso del pulmón y la supervivencia fueron registrados. La quitina se extrajo del tejido por digestión alcalina y analizada como glucosamina por fotocolorimetría. Los resultados se expresaron como la media (95% IC) de µg glucosamina/pulmón; análisis de ANOVA; análisis de Kaplan-Meier-Logrank para estudio de supervivencia.
Resultados: El 78,6% de las ratas de control murieron antes del 8º día. Todos los tratamientos aumentaron la supervivencia y disminuyeron el peso de los pulmones significativamente con respecto al grupo control. Sólo Ab-L 10 mg/kg durante 4 d seguida por 3 mg/kg prolongó significativamente la supervivencia (76,2 vs 45,4%) y redujo el contenido de quitina en pulmón en comparación con AB (P < 0,05).
Conclusiones: Dosis altas de carga de Ab-L superiores a 5 mg/kg mejoran la eficacia del tratamiento de la APE.
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EFICACIA COMPARATIVA DE FORMULACIONES LIPÍDICAS DE ANFOTERICINA B EN ASPERGILOSIS PULMONAR EXPERIMENTAL
J. Gavaldà, M.T. Martín, P. López, X. Gomis, J.L. Ramírez, M. Rosal, B. Almirante, C. Pigrau y A. Pahissa
Hospital Vall d'Hebron. Barcelona.
Las diferencias en eficacia de formulaciones lipídicas de anfotericina B entre sí y la de anfotericina B desoxicolato (Ab) en el tratamiento de la aspergilosis invasora no están resueltas.
Métodos:Ratas Wistar se trataron con 125 mg/kg acetato de cortisona tres veces a la semana durante el experimento. Al 15 día del inicio de los corticoides se infectaron por vía transtraqueal con 0,3 mL de una suspensión de 1 x 107 conidias/mL de un aislamiento clínico de Aspergillus fumigatus. A las 24 h de la infección se inició el tratamiento por un catéter iv con Ab 0,9 mg/kg; complejo lipídico de anfotericina B (ABC) 1, 3 o 5 mg/kg; o anfotericina B liposomal (AmB) 1, 3, 5 o 10 mg/kg durante 10 d. La eficacia se evaluó en ratas tratadas 5 d como mínimo mediante cuantificación de quitina, como índice del total de micelio en pulmones y peso de los pulmones. La quitina se extrajo por digestión alcalina del pulmón y analizada como glucosamina (GC) por colorimetría. Los resultados se expresaron como la media (95%IC) *g GC/pulmones y se analizaron por la prueba de Mann-Whitney U Wilcoxon. Se registró la supervivencia, pero no se consideró debido a detección de mortalidad relacionada con el tratamiento en ratas inmunosuprimidas pero no infectadas.
Resultados: El peso de los pulmones de las ratas tratadas con Ab, ABC5, AmB5 y AmB10 fue significativamente menor que el obtenido en los controles (P < ,05). El peso de los pulmones de las ratas tratadas con AmB5 fue significativamente menor al obtenido en el resto de grupos, excepto Ab y AmB10 (P < ,05). AmB10 resultó en una disminución del peso comparada con todos los grupos de tratamiento, excepto AmB 5. AmB 5 y 10 redujeron significativamente la GC con respecto al control (P < ,05). AmB10 redujo la GC comparada con todos los grupos excepto AmB 5 (P < ,05).
Conclusión: AmB 10 mg/kg fue más efectiva que Ab y ABC a diferentes dosis. AmB 5 mostró tendencia hacia una mejor eficacia con respecto a cualquier concentración de ABC y 1 mg/k/d de Ab.
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INTERACCIÓN ITRACONAZOL-TACROLIMUS EN PACIENTES CON TRANSPLANTE PULMONAR O HEPÁTICO
B. Sánchez-Santiago, M.A. de Cos, E. Fabrega, F. Casafont, F. Zurbano, J.M. Cifrian, A.B. González, C. Moro y G. Peralta
H. Universitario Marqués de Valdecilla. H. Sierrallana. Cantabria.
Objetivos: Debido al derrumbamiento parcial de nuestro hospital se ha incrementado el uso de itraconazol (ITRA) en pacientes trasplantados. Analizamos el efecto que supuso la suspensión del tratamiento con ITRA en los niveles plasmáticos y dosificación de tacrolimus en pacientes con trasplante hepático (TH) o de pulmón (TP).
Métodos: Se revisaron retrospectivamente todos los pacientes con TP o TH en nuestro hospital en tratamiento con tacrolimus, seleccionando aquellos tratados con ITRA. Los niveles de tacrolimus se determinaron de manera rutinaria, a criterio, mediante inmunoensayo en un analizador IMx (Abbot). Se definió índice nivel-dosis como concentración plasmática/dosis diaria. Para la comparación de las medias se utilizó el test de Wilcoxon.
Resultados: Analizamos 8 pacientes con TH y 5 con TP en tratamiento con tacrolimus a los que se les retiró ITRA. La suspensión tuvo lugar de octubre de 1998 a junio del 2001. En todos los pacientes se detectó un descenso de la concentración de tacrolimus al retirar el ITRA (caída media de 7,8 ng/ml, es decir de un 51% -rango 17-83%- del nivel prerretirada, p = 0,001) y un descenso del índice nivel-dosis (caída media del 70% -rango 46-86%- del índice nivel-dosis, p = 0,001). El descenso de la concentración plasmática de tacrolimus obligó en todos los casos, salvo en uno, a un incremento de su dosis diaria (incremento medio 2,6 mg/día, es decir del 98% de la dosis inicial, rango 0-250%, p = 0,002). El descenso del índice nivel-dosis se detectó ya en la 1ª semana tras retirar el ITRA, aunque se hizo máximo tras 4 semanas. No hubo diferencias en el descenso del índice nivel-dosis según el tipo de trasplante.
Conclusiones:la retirada del tratamiento con ITRA en pacientes en tratamiento con tacrolimus ocasiona un descenso en los niveles plasmáticos de éste último que obliga a incremento significativo de su dosis diaria.
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EXPERIENCIA CLÍNICA CON VORICONAZOL (VCZ) EN MICOSIS INVASIVAS POR HONGOS FILAMENTOSOS (HF)
J. Fortún, P. Martín-Dávila, M.A. Sánchez, V. Pintado, M.E. Álvarez, D. Hernández, A. Sánchez-Sousa y S. Moreno
Servicio de Enfermedades Infecciosas y Microbiología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Introducción:La mortalidad asociada a infecciones invasivas por HF en pacientes inmunodeprimidos es muy alta, a pesar de tratamiento con anfotericina B, incluidas las formas lipídicas. La experiencia clínica con VCZ es reducida pero los datos preliminares son prometedores.
Métodos: Presentamos la experiencia con VCZ, administrado de forma compasiva, en el tratamiento de micosis invasivas por HF en 4 pacientes con trasplante de órgano sólido y 1 paciente con tratamiento inmunosupresor por anemia autoinmune. Se siguieron los criterios de la EORT para micosis invasivas por HF. Las pruebas de sensibilidad se realizaron mediante microdilución (M38-P), siguiendo las recomendaciones de la NCCLS. Para cada aislado se probaron 3 antifúngicos: voriconazol (VCZ), itraconazol (ITZ) y anfotericina B (AnB).
Resultado: Cuatro pacientes presentaron infección por Aspergillus spp (3 pulmonar, 1 abdominal) y 1 paciente por Scedosporium spp (ocular). Todos los aislados presentaron CMI a VCZ < 1 ug/ml. Todos los pacientes habían presentado cultivos positivos a pesar de recibir de 1 a 5 g de anfotericina lipídicas, excepto el paciente con scedosporiasis, en que VCZ fue el tratamiento de inicio. VCZ se mantuvo entre 60 y 90 días (por vía intravenosa durante 0-30 días). En ningún paciente se observó toxicidad visual y en 1/5 se observó una elevación moderada (x3) de transaminasas. Por el contrario, en los 5 pacientes se confirmaron elevación de niveles séricos de tacrolimus o ciclosporina, provocando en 1 caso insuficiencia renal aguda grave. En todos los pacientes se confirmó mejoría total o parcial de los signos clínicos y en 4/5 se constató curación microbiológica.
Conclusión:VCZ es un tratamiento eficaz y seguro en el manejo de micosis invasivas por HF en pacientes inmunodeprimidos. Para evitar nefrotoxicidad es preciso reducir las dosis de tacrolimus o ciclosporina. Al menos en esta serie, se observa una buena correlación entre las pruebas de sensibilidad y la respuesta clínica.
