Valoración de la utilidad de una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real (PCR-TR) para el diagnóstico de histoplasmosis en muestras clínicas.
MétodosPara el diseño de los iniciadores y de las sondas se analizaron las secuencias de las regiones ITS (internal transcriber spacers) del ADN ribosómico de 20 cepas de Histoplasma capsulatum. Se empleó la tecnología LightCycler (Roche Applied Science) y la sonda fue diseñada mediante el sistema Fluoresce Resonance Energy Transfer (FRET). Se realizaron estudios de reproducibilidad, sensibilidad y especificidad. Además, se incluyó un sistema de control interno para reconocer falsos negativos por inhibición de la reacción de PCR. Tras ello, se testó la técnica en 22 muestras clínicas procedentes de 14 pacientes diagnosticados de histoplasmosis probada. Además se analizaron 30 muestras de control, procedentes de enfermos con otras micosis, de pacientes con neutropenia febril y de voluntarios sanos.
ResultadosEl límite de detección de la técnica fue de 1 fg de ADN fúngico por μl de muestra. Así mismo fue reproducible y muy específica. La técnica fue positiva en 11 de los 14 enfermos (78,6%) y en 17 de las 22 muestras analizadas (77,3%). Por muestras, el 100% de las muestras respiratorias y de los aspirados de médula ósea fueron positivos, pero sólo el 70% de los sueros (p<0,01). La cantidad media de ADN detectado en suero fue de 23,1 fg/μl, mientras que en muestras respiratorias y aspirados medulares fue de 4,85 μ 103 fg/μl (p<0,01). La técnica de PCR-TR fue positiva en suero de 3 enfermos por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) positivos, en los que la detección de anticuerpos por inmunodifusión fue negativa. La especificidad fue del 100%, ya que ninguna de las muestras de control dio un resultado positivo.
ConclusiónEsta técnica de PCR-TR es un método sensible y específico para el diagnóstico rápido de histoplasmosis, sobre todo en muestras respiratorias y aspirados de médula ósea. La sensibilidad en suero es inferior, pero puede ser complementaria al cultivo y a la serología en enfermos VIH positivos.
Evaluation of the usefulness of a quantitative real-time polymerase chain reaction-based (RT-PCR) technique for clinical diagnosis of histoplasmosis.
MethodsPrimers and probes were designed on the basis of sequences from the ITS regions of ribosomal DNA of 20 clinical strains of Histoplasma capsulatum. LightCycler procedures (Roche Applied Science) were used with probes marked by fluorescence resonance energy transfer (FRET). Reproducibility, sensitivity, and specificity were analyzed. In addition, an internal control was designed to identify false negative results by PCR inhibition. The RT-PCR assay was tested in 22 clinical samples from 14 patients with proven histoplasmosis. In addition, 30 samples from patients with febrile neutropenia or mycoses other than histoplasmosis, and from healthy volunteers were analyzed as controls.
ResultsThe limit of detection of the assay was 1 fg of genomic DNA per μl of sample. The PCR-based technique was reproducible and highly specific. Positive results were obtained in 11/14 (78.6%) patients and in 17/22 (77.3%) clinical samples. RT-PCR was positive in 100% of respiratory secretions and bone marrow samples, but only 70% of sera (p<0.01). Mean fungal DNA value was 23.1 fg/μl in serum and 4.85 μ 103 fg/μl in respiratory and bone marrow samples. RT-PCR results were positive in serum from three HIV patients for which antibody detection by immunodiffusion was negative. Specificity was 100%, since PCR results were negative for all the control samples.
ConclusionThes RT-PCR technique is a sensitive, specific method for early diagnosis of histoplasmosis, particularly when respiratory secretions or bone marrow samples are analyzed. The reliability is lower in serum, but it can be used as an additional, complementary technique to culture and serology in HIV patients.
