El agente etiológico de la tosferina es B. pertussis, pero B. parapertussis y B. holmesii pueden causar cuadros clínicos muy similares1. La infección por B. bronchiseptica es infrecuente, clínicamente distinta y afecta a pacientes debilitados2. Las dianas más empleadas para el diagnóstico de Bordetella spp. mediante PCR han sido las secuencias IS481 e IS1001. La IS481 está presente en B. pertussis, B. holmesii y también puede estarlo en B. bronchiseptica. La IS1001 se encuentra en B. parapertussis y ocasionalmente en B. bronchiseptica3-5. Una estrategia para distinguir especies puede basarse en el uso de cebadores concretos para la zona del gen promotor de la toxina pertussis (ptxA-pr), que es específica de B. pertussis3,5,6. Otra alternativa es el gen de una porina de B. pertussis (BPTD_0837)4. El gen BP283 también ha sido empleado para identificar B. pertussis7. En la actualidad existen numerosos kits para el diagnóstico molecular de tosferina. No obstante, su interpretación puede resultar compleja debido a esa posibilidad de detectar mismas secuencias en diferentes especies. El objetivo de este estudio fue evaluar el rendimiento de dos métodos de PCR en tiempo real, RealCycler® BORD-T, Progenie Molecular y DiaSorin Molecular Simplexa™ Bordetella Direct, para el diagnóstico de tosferina.
Se estudiaron 50 muestras de exudado/lavado nasofaríngeo obtenidas de pacientes con sospecha clínica de tosferina entre julio de 2018 y enero de 2020, y como grupo control 44 muestras de exudado nasofaríngeo recibidas en febrero de 2022 para diagnóstico de SARS-CoV-2 mediante RT-PCR. Las muestras se conservaron congeladas a −80°C hasta su estudio. Todas las muestras procedían de estudios de vigilancia epidemiológica y se procesaron simultáneamente con los ensayos RealCycler® BORD-T previa extracción de ácidos nucleicos y Simplexa™ Bordetella Direct directamente a partir de muestra sin extracción previa. La interpretación de resultados de las 2 técnicas se realizó siguiendo las recomendaciones de los fabricantes.
Para las 50 muestras sospechosas de tosferina, los resultados con RealCycler® BORD-T fueron: 28 (56%) B. pertussis, 12 (24%) Bordetella spp., 6 (12%) B. parapertussis o B. bronchiseptica, 3 (6%) coinfección por diferentes Bordetella spp. y uno (2%) negativo. Con Simplexa™ Bordetella Direct 39 (78%) B. pertussis, 6 (12%) B. parapertussis, 2 (4%) coinfección por diferentes Bordetella spp. 2 (4%) negativas y una (2%) inválida por inhibición de la amplificación (tabla 1). En 47 muestras bajo sospecha de tosferina (94%) ambos métodos coincidieron en la identificación a nivel de género o coinfección por Bordetella spp. En 27 (54%) de estos casos las dos técnicas identificaron la especie como B. pertussis. En 11 (22%) casos que Simplexa™ Bordetella Direct clasificó el resultado como B. pertussis RealCycler® BORD-T lo catalogó como Bordetella spp. En los 6 (12%) casos identificados como B. parapertussis mediante Simplexa™ Bordetella Direct el resultado de RealCycler® BORD-T fue B. parapertussis o B. bronchiseptica. Las 44 muestras tomadas para la detección de SARS-CoV-2 fueron negativas para Bordetella spp. por ambas técnicas.
Distribución de los resultados de RealCycler® BORD-T y Simplexa™ Bordetella Direct sobre el total de muestras sospechosas de tosferina estudiadas
| RealCycler® BORD-T | Simplexa™ Bordetella Direct | Total | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| IS481 | IS1001 | BP283 | IS481 | IS1001 | N | % | ||
| B. pertussis | Positivo | Negativo | Positivo | B. pertussis | Positivoa | Negativoa | 27 | 54 |
| Bordetella spp. | Positivo | Negativo | Negativo | B. pertussis | Positivoa | Negativoa | 11 | 22 |
| B. parapertussis o B. bronchiseptica | Negativo | Positivo | Negativo | B. parapertussis | Negativob | Positivob | 6 | 12 |
| Coinfección por diferentes Bordetella spp. | Positivo | Positivo | Positivo | B. pertussis y B. parapertussis | Positivob | Positivob | 1 | 4 |
| Positivo | Positivo | Negativo | Positivob | Positivob | 1 | |||
| Coinfección por diferentes Bordetella spp. | Positivo | Positivo | Positivo | B. pertussis | Positivo | Negativo | 1 | 2 |
| Bordetella spp. | Positivo | Negativo | Negativo | Negativo | Negativo | Negativo | 1 | 2 |
| Negativo | Negativo | Negativo | Negativo | Negativo | Negativo | Negativo | 1 | 2 |
| B. pertussis | Positivo | Negativo | Positivo | No válidoc | No válido | No válido | 1 | 2 |
| 50 | 100 | |||||||
Los resultados de esta tabla solo son aplicables cuando se cumplen las especificaciones de calidad interna de cada una de las técnicas evaluadas (p. ej., amplificación de controles internos y/o Ct dentro de rango).
El kit RealCycler® BORD-T detecta tanto IS481 como la región BP283. Esta combinación aúna una alta sensibilidad y una elevada especificidad para el diagnóstico de tosferina. Este kit también incluye la IS1001 para detectar B. parapertussis.
Simplexa™ Bordetella incluye IS481 para detección de B. pertussis e IS1001 para B. parapertussis8 y, aunque la combinación de positividad y negatividad para cada una de estas dianas no excluye definitivamente a otras como B. holmesii o B. bronchiseptica, a efectos prácticos, en muestras con sospecha clínica de tosferina el resultado se podría considerar como «probable infección por» B. pertussis o B. parapertussis según el caso3. Este kit ha mostrado muy buena sensibilidad y especificidad9 y excelentes valores globales de porcentaje de acuerdo de resultados10.
En este estudio el número de muestras estudiadas es reducido. Además, no se contó con un «gold standard» para valorar la sensibilidad de las técnicas, no se dispuso de cepas control ni se confirmaron los casos discordantes con una tercera técnica alternativa. Sin embargo, ambas técnicas aportaron una buena coincidencia de resultados para la detección de Bordetella spp. Cada una de ellas muestra algún tipo de ventaja: RealCycler® BORD-T resultaría teóricamente muy específico para B. pertussis mientras que Simplexa™ Bordetella Direct no requiere extracción de ácidos nucleicos, convirtiéndolo en una alternativa sencilla y rápida.
Conflicto de interesesEn este estudio los reactivos de DiaSorin Molecular Simplexa™ Bordetella Direct fueron cedidos por DiaSorin Iberia S.A. Las autoras V.B. y E.M. son empleadas de DiaSorin Iberia S.A.
Este estudio ha sido parcialmente enviado y aceptado como comunicación al XXVI Congreso Nacional de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
