La terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) con inhibidores de las proteasas ha alterado drásticamente el curso de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) debido a la supresión de la replicación viral1,2, aunque en los niños no es muy común alcanzar valores de carga viral plasmática (CV) indetectable durante un período de tiempo prolongado3. Normalmente, la respuesta a la TARGA va invariablemente acompañada por un aumento de células T CD4+ y la mejoría clínica4,5, incluso en los niños que no alcanzan CV indetectables. La recuperación completa del sistema inmune con TARGA en pacientes infectados por el VIH-1 y con sida hasta valores normales todavía no se ha descrito, posiblemente por el deterioro profundo del sistema inmune o por un período de seguimiento con TARGA insuficiente. Aunque la reconstitución inmunológica no tiene lugar en todos los pacientes infectados por el VIH-1, la TARGA induce una mejoría cualitativa y cuantitativa de las células T CD4+ en los pacientes con enfermedad avanzada6.
Los linfocitos T virgen (CD45RA+CD62L+) maduran en el timo y emigran a los órganos linfoides periféricos, donde se diferencian hasta células de memoria (CD45RO+) tras un proceso postímico en el que encuentran un antígeno extraño para el que tienen especificidad, activándose y proliferando hasta diferenciarse7,8. Las células T están recirculando entre sangre y tejidos linfoides en un proceso dependiente de la L-selectina (CD62L)9,10. Todo este proceso de diferenciación celular y recirculación de células T se encuentra frenado con la TARGA, al detener la replicación del VIH-1 y promover la recuperación del sistema inmunitario, que ocasiona una menor exposición a antígenos que puedan provocar la diferenciación a células T de memoria11.
Los pacientes infectados por el VIH-1 tienen una proporción alta de células que expresan CD38 y HLA-DR12-14, debido a un estímulo antigénico continuo. En los adultos, estos marcadores se asocian con mal pronóstico, disminución de células T CD4+ y CV elevada12,15. Por otro lado, las células T CD8+ activadas pueden ser una herramienta de gran utilidad para el seguimiento de la TARGA, ya que el control de la replicación viral implica una disminución de la activación del sistema inmunitario y un descenso de la expresión de CD38+ y HAL-DR en las células T CD8+16.
Nuestro objetivo ha sido determinar las características inmunológicas de un grupo de niños infectados verticalmente por el VIH-1 que al iniciar la TARGA estaban en categoría clínica C o sida e inmunológica 3 (< 15% T CD4+ o < 200 células T CD4+/ml) y tras un período de tratamiento con esta terapia antirretroviral superior a 24 meses tienen la capacidad de recuperar células T CD4+ hasta valores normales (> 25% T CD4+ y > 500 células T CD4+/ml).
Pacientes y método
Pacientes
Se realizó un estudio retrospectivo de una cohorte de niños infectados verticalmente por el VIH-1 en el que se incluyeron 17 niños con infección por el VIH-1 en categoría clínica C (sida) mayores de 5 años procedentes de la Sección de Inmuno-Pediatría del Hospital General Universitario Gregorio Marañón de Madrid, Servicio de Inmuno-Pediatría del Hospital 12 de Octubre y Servicio de Pediatría del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. Todos los niños se diagnosticaron como infectados por el VIH-1 utilizando métodos de detección directa del VIH-1 (ADN-PCR y cultivo viral, descritos previamente)17 . La clasificación clínica y los tratamientos antirretrovirales se realizaron de acuerdo con las guías de los Centers for Disease Control and Prevention (CDCP)18,19 . Los criterios de inclusión de los niños infectados por el VIH fueron: a) tener más de 5 años de edad para evitar el efecto de la edad en las distintas subpoblaciones linfocitarias T; b) estar en categoría clínica e inmunológica C3 antes de comenzar la TARGA; c) disponer de un estudio de subpoblaciones linfocitarias T, y d) disponer de un seguimiento de células T CD4+ y CV de al menos 2 años y que llegue hasta el momento del estudio de subpoblaciones linfocitarias T.
Los 17 niños infectados por el VIH-1 se clasificaron en dos grupos según la respuesta a TARGA:
1. Grupo Res (niños infectados por el VIH-1 respondedores a TARGA): 10 niños con infección por el VIH-1 en categoría clínica e inmunológica C3 (sida, con < 15% T CD4+ o 200 células T CD4+/ml) a la entrada en el estudio y que tras un período de seguimiento superior a 24 meses con TARGA recuperan células T CD4+ hasta valores normales (> 25% T CD4+ o 500 células T CD4+/ml) en las dos ultimas visitas (datos no expuestos).
2. Grupo no-Res (niños infectados por el VIH-1 no respondedores a TARGA): 7 niños con infección por el VIH-1 en categoría clínica e inmunológica C3 a la entrada en el estudio y que tras un período de seguimiento superior a 24 meses con terapia combinada o TARGA (por no tolerar la TARGA) no recuperan células T CD4+ a valores normales (> 25% T CD4+ o 500 células T CD4+/ml) durante todo el período de seguimiento (datos no expuestos).
Como grupo control se incluyó a 12 niños sanos no infectados por el VIH-1 de edades similares. El seguimiento retrospectivo de esta cohorte de niños finalizó con un estudio transversal en el que se determinaron las subpoblaciones linfocitarias T en sangre periférica en los dos grupos de niños infectados por el VIH-1 y el grupo control.
Cuantificación de subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+
El análisis de las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y T CD8+ virgen, memoria, activadas y efectoras se realizó por citometría de flujo en tres colores en un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) usando el programa de adquisición Lysis II (Becton-Dickinson)20,21 y con anticuerpos monoclonales específicos conjugados con Per-CP (CD4 y CD8), PE (CD45RO, CD62L y HLA-DR) y FITC (HLA-DR, CD45RA y CD38).
Análisis estadístico
Los valores de CV se transformaron en su logaritmo (base 10) para normalizar su distribución. Los linfocitos T CD4+ y CD8+ se expresaron en porcentaje y número absoluto. Dado el tamaño de las muestras y la falta de normalidad de los datos, las diferencias entre los grupos se calcularon mediante pruebas no paramétricas, a partir de la prueba de la U de Mann-Whitney.
Resultados
Características de los niños infectados por el VIH-1
Los 10 niños del grupo Res fueron incluidos en un estudio retrospectivo cuyo punto de inicio coincidió con la instauración de la TARGA. El grupo de 7 niños infectados por el VIH que no respondieron al tratamiento antirretroviral (grupo no-Res) se utilizó como grupo de referencia. Las características inmunológicas y virológicas basales y finales se describen en la tabla 1. En esta tabla se puede observar como los niños del grupo Res aumentan el porcentaje y número absoluto de células T CD4+ y células T CD8+, y disminuyen la CV.
Respuesta al TARGA de los niños infectados por el VIH-1
Los niños infectados por el VIH-1 del grupo Res tuvieron valores de células T CD4+ y CD8+ virgen (CD45RA+CD62L+) tras el período de TARGA similares a los niños del grupo control no infectados por el VIH-1, excepto para el porcentaje de células T CD8+CD45RA+CD62L+. El grupo no-Res tuvo valores más bajos de células T CD4+ y CD8+ virgen que los de los grupos Res y control (figs. 1A y B).
Fig. 1. Resumen de las diferencias en las subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y T CD8+ de memoria, virgen y activadas de los niños infectados por el VIH-1 que tienen reconstitución inmunológica en respuesta al tratamiento. No-Res: niños infectados por el VIH-1 que no tienen reconstitución inmunológica con TARGA. Como grupo control se incluyó a 13 niños sanos. Diferencias con el grupo control (*p < 0,05; **p < 0,01). Diferencias con el grupo Res (ap < 0,05; bp < 0,01). Las barras de error representan dos errores estándar.
Asimismo, los niños del grupo Res tuvieron valores similares de células T CD4+ de memoria (CD45RO+) que el grupo control. El grupo no-Res tuvo valores de células T CD4+ de memoria más altos en porcentaje y en número absoluto más bajo que los niños de los grupos Res y control (figs. 1C y D). Sin embargo, los niños infectados por el VIH-1, independientemente del grupo en que se encontraran, tuvieron valores más elevados en porcentaje y número absoluto de células T CD8+CD45RO+ que el grupo control (figs. 1C y D).
Todos los niños infectados por el VIH-1 tuvieron valores significativamente más altos del porcentaje de células T CD4+ y CD8+ activadas (HLA-DR+CD38+) que el grupo control (fig. 1E). Además, los niños del grupo no-Res tuvieron valores más altos de células CD8+HLA-DR+CD38+ que el grupo Res (figs. 1E y F). Sin embargo, el grupo Res tuvo valores más altos en número absoluto de células T CD4+HLA-DR+CD38+ que el grupo no-Res (fig. 1F).
Discusión
La TARGA ha modificado el curso de la infección por el VIH-11,22, causando una caída drástica de la CV y habilitando la recuperación del sistema inmunitario, que conduce a una reducción de las infecciones oportunistas y mejoría clínica11. Sin embargo, no se ha descrito una recuperación completa en el número y particularmente en la función de las células T CD4+ hasta valores normales23. En este trabajo no disponemos de las determinaciones basales de los niños infectados por el VIH, pero se puede asumir como aproximación que los valores de subpoblaciones T del grupo Res antes de la TARGA son cercanos a los que tiene el grupo no-Res. Cuando los niños del grupo Res tenían < 15% T CD4+ o < 200 células T CD4+/ml, sus valores de células memoria, virgen y activadas estarían más cercanos al grupo no-Res que al propio grupo Res después de más de 24 meses de TARGA. Además, éste no es un ensayo clínico en el que la cohorte de seguimiento esté perfectamente seleccionada con un tiempo de seguimiento similar; por tanto, nuestro grupo de niños infectados por el VIH-1 no es homogéneo respecto al tiempo de tratamiento. Conseguir un grupo homogéneo de tratamiento antirretroviral en tiempo fuera de un ensayo clínico es prácticamente imposible, como es el caso de este trabajo.
Hemos encontrado que los niños del grupo Res aumentan los valores de células T CD4+ y CD8+ virgen después de la TARGA, y tienen valores más bajos de células de memoria y activadas, lo que apoya la idea de una recuperación cuantitativa y funcional del sistema inmune. Sin embargo, los 7 niños del grupo no-Res que no respondieron a la TARGA, tuvieron valores opuestos de células T CD4+ y CD8+ virgen, memoria y activadas a los del grupo Res, posiblemente por una terapia subóptima, resistencia a los fármacos antirretrovirales, concentraciones de fármacos y otros factores inmunológicos desconocidos involucrados en la respuesta frente al VIH-1.
Los niños del grupo Res tuvieron valores de células T CD4+ y CD8+ virgen similares al grupo control después de un período de más de 24 meses con TARGA, lo que podría indicar que un control completo de la replicación del VIH-1 evita la activación de las células T virgen antígeno-específicas y su paso a células de memoria y/o efectoras24. No obstante, las células T CD8+ de memoria y activadas están más elevadas en los niños infectados por el VIH-1 (grupos Res y no-Res) que en el grupo control no VIH-1, posiblemente porque aquellos niños tienen una falta de control completo de la replicación viral. Los valores bajos de células T CD4+ y CD8+ virgen observados en el grupo no-Res podrían ser debidos a la destrucción preferencial de células T virgen infectadas por el VIH-1 en la fase de precursores tímicos25, o bien por la falta de generación de nuevas células como consecuencia de la atrofia tímica secundaria a la infección por el VIH-126. La disminución de las células T virgen se correlaciona con un bajo porcentaje de células T CD4+27, mientras que la recuperación de células T CD4+ después de la TARGA se correlaciona con un aumento de células T virgen5.
Durante la infección por el VIH-1, el paso de células T virgen (CD4+CD45RO-) a memoria (CD4+CD45RO+) probablemente se ve favorecido por la estimulación crónica de los antígenos del VIH-1 o por otros agentes, así como por una expansión periférica antígeno-independiente de las células CD4+CD45RO+ habilitada por la disfunción tímica causada por la infección por el VIH-126. Este incremento de células T CD4+CD45RO+ ocurre preferentemente en estadios avanzados de la infección por el VIH-1, en paralelo con un involución real de la arquitectura normal de los ganglios linfáticos26. Las células T CD4+ de memoria pueden ser destruidas por varios mecanismos, entre los que se encuentran la infección directa de estas células de memoria por el VIH-128 y la apoptosis inducida por la activación celular anormal29, lo que conduce a una caída de células T CD4+ en el organismo. Los datos presentados en este estudio apuntan a que en los niños del grupo Res, con una buena respuesta a la TARGA, el porcentaje de células T CD4+ de memoria ha disminuido y el número absoluto ha aumentado hasta valores similares al grupo control, permitiendo la recuperación del sistema inmunitario.
La activación del sistema inmunitario es un sello característico de la infección por el VIH-1, mostrando un aumento en la expresión de los marcadores de activación, como CD38+ y HLA-DR+12,13. En este estudio, el grupo Res tuvo valores de células T CD4+ y CD8+ activadas mas bajos que el grupo no-Res14, y similares al grupo control no VIH-1. La excepción a esta regla es la expresión de CD38 en las células T CD4+, debido al papel de CD38 como marcador de inmadurez más que de activación13,27. Con la TARGA se consigue disminuir la replicación viral y por tanto, la activación del sistema inmunitario11, pero los niños del grupo Res presentaron valores más altos de células T CD8+ activadas que el grupo control, posiblemente debido a la falta de control completo de la replicación viral. Así, el estudio de la expresión de marcadores de activación en células T CD8+ es una herramienta de gran utilidad para supervisar si la TARGA funciona, ya que la disminución de células T CD8+ activadas constituye un marcador de respuesta eficaz a la TARGA, probablemente porque estas células se activan crónicamente por la infección por el VIH-1 y, por consiguiente, su disminución sigue a la disminución de la carga viral inducida por la terapia antirretroviral30,31. Es posible que para que exista una disminución de las células T CD8+ activadas no se necesite llegar a valores de CV indetectable, pero sí disminuir la CV por debajo de unos límites, y probablemente serán estos pacientes los que lleguen a recuperar su sistema inmunitario. Inversamente, la persistencia de valores altos de células T activadas es un marcador de fracaso terapéutico en los niños infectados por el VIH-1. De hecho, el grupo Res alcanzó valores bajos de célula T CD8+ activadas considerando que estos niños tuvieron valores de células T CD8+ activadas similares a las del grupo no-Res.
Por ultimo, cabe destacar que la recuperación y desactivación inmunológica continuada hasta conseguir valores similares a controles sanos se producirían si la supresión de la replicación viral fuera total durante todo el tiempo de seguimiento; pero es conocido que en un porcentaje alto de pacientes infectados por el VIH, sobre todo niños, conseguir la CV indetectable es muy difícil. Aunque fuera un ensayo clínico con el mismo tiempo de seguimiento, si en un porcentaje de los pacientes no se consigue carga viral indetectable, también estaríamos en una situación de heterogeneidad en repoblación y desactivación inmunológica.
En resumen, la recuperación del sistema inmunitario inducida por la TARGA en los niños infectados por el VIH-1 parece ser la consecuencia de la disminución de la activación crónica del sistema inmunitario y de la recuperación de las células T virgen.
Agradecimientos
A Dolores García Alonso y Consuelo Muñoz por su excelente labor técnica.
