El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más agresivo y frecuente. A pesar de los avances en el tratamiento de pacientes con GBM, que incluye su remoción quirúrgica, radioterapia y quimioterapia, el pronóstico es muy desfavorable, e incluso en los centros más desarrollados del mundo, la sobrevida a 2 años es del 8-20%. Este tumor es muy difícil de tratar ya que las células de GBM tienen una resistencia intrínseca a las terapias tradicionales. Además, debido a su invasividad, el tumor presenta recurrencias y es letal en casi todos los pacientes. Por lo tanto, es importante desarrollar nuevas terapias para mejorar la sobrevida de los pacientes con GBM.
ObjetivoEn este artículo revisaremos las estrategias de terapia génica desarrolladas para inducir citotoxicidad específica en células de GBM.
DesarrolloDescribiremos especialmente las estrategias que utilizan vectores adenovirales, ya que son los vectores más popularmente utilizados en el tratamiento del GBM. Discutiremos estrategias que utilizan adenovirus recombinantes no replicativos para la transferencia de moléculas citotóxicas condicionales, como la cinasa de timidina y de citocinas proapoptóticas. También revisaremos las estrategias que utilizan vectores adenovirales oncolíticos, que replican específicamente en células tumorales, induciendo su lisis.
ConclusionesLa terapia génica es una herramienta muy útil para inducir apoptosis en GBM. La versatilidad de los vectores de la terapia génica permite adaptarlos para mejorar su especificidad y aumentar su eficacia. Estas características, sumadas al buen perfil neuropatológico de los vectores adenovirales, hacen de la terapia génica citotóxica una modalidad muy promisoria para combinar con otros agentes citotóxicos y con estrategias inmunoestimulantes para el tratamiento del GBM.
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive primary brain tumor. In spite of recent advances in the treatment of this tumor, which consists of neurosurgery followed by radiotherapy and chemotherapy, the prognosis of these patients remains dismal, with 2-year survival rates of with 8-20%. This tumor is very difficult to treat due to the intrinsic resistance of GBM cells to conventional therapies. Additionaly, due to its invasiveness, the tumor recurs and kills virtually all the patients with GBM. Thus, it is crucial to develop novel therapies to improve the survival of these patients.
AimIn this article we review gene therapy strategies developed to induce specific cytotoxicity in GBM cells.
DevelopmentWe review gene therapy strategies that use adenoviral vectors, which are the most extensively used for the treatment of GBM. We will discuss strategies that employ recombinant non-replicative adenoviral vectors for the delivery of conditionally cytotoxic molecules and pro-apoptotic cytokines. We will also describe strategies that use oncolytic adenoviral vectors, which specifically replicate in tumor cells inducing their lysis.
ConclusionsGene therapy is a very valuable tool to induce apoptosis in GBM. The versatility of gene therapy vectors allows their manipulation to improve their specificity and efficacy. These features and the very acceptable neuropathological profile of these vectors makes cytotoxic gene therapy a very promissing therapeutic strategy to combine with other cytotoxic agents and immunostimulatory strategies for the treatment of GBM.
Cada año en nuestro país se diagnostican 1.600 nuevos pacientes con tumores cerebrales primarios (www.msal.gov.ar/inc/equipos_analisis.php). El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor cerebral más frecuente en adultos, constituyendo un 25% de los tumores cerebrales primarios. A pesar de los avances en su tratamiento, que incluye la remoción quirúrgica, seguida de radioterapia y quimioterapia, el pronóstico es muy desfavorable, e incluso en los centros más desarrollados del mundo, la sobrevida a 2 años es del 8-20%. Los desafíos terapéuticos que encierra esta enfermedad incluyen: la invasividad del tumor en el tejido cerebral, la resistencia de las células de glioma a las terapias tradicionales, el microambiente tumoral inmunosupresor y el inmunoprivilegio del sistema nervioso central. El carácter invasivo de estos tumores hace que la remoción quirúrgica completa sea virtualmente imposible, por lo que el tumor presenta recurrencias y es letal en casi todos los pacientes. Por ello, es importante el desarrollo de terapias alternativas. La inducción de muerte celular en el GBM es esencial en el tratamiento de estos tumores, no solo para reducir el tamaño del tumor, sino porque la apoptosis produce la liberación de moléculas inflamatorias intracelulares que favorecen la inmunidad antitumoral1,2.
La terapia génica constituye una herramienta muy útil para la transferencia de genes citotóxicos a los tumores cerebrales. Los vectores adenovirales son ideales para la transferencia genética en el sistema nervioso central3, por ello han sido los más utilizados en neuro-oncología traslacional. Estos vectores tienen la habilidad de infectar eficientemente células normales y tumorales, no generan neurotoxicidad a dosis terapéuticamente efectivas y pueden ser producidos en altos títulos con relativa facilidad. Además, dado que estos vectores permanecen episomales, no presentan riesgo de mutagénesis insercional. En este artículo, describiremos algunas estrategias terapéuticas experimentales que utilizan vectores adenovirales recombinantes no replicativos (Ad) para transferir moléculas proapoptóticas a las células tumorales. También discutiremos el uso de vectores adenovirales oncolíticos de replicación condicional (CRAd), que replican específicamente en las células tumorales, induciendo su lisis. Estas estrategias buscan inducir muerte celular específicamente en células de GBM, sin afectar el parénquima cerebral que rodea al tumor.
DesarrolloCitocinas proapoptóticasLa administración de vectores Ad que codifican para citocinas proapoptóticas es una estrategia interesante para inducir citotoxicidad en células de GBM (fig. 1), ya que la expresión de los respectivos receptores de muerte ha sido detectada en especímenes de GBM humano. Distintos vectores que codifican para TNF-α, TRAIL y FasL fueron construidos y evaluados en roedores portadores de GBM intracraneal1,4-8. A pesar de que in vitro estos vectores producen potentes efectos proapoptóticos en células de GBM, su efecto in vivo en modelos de GBM es más discreto1. La administración intratumoral de un Ad que codifica para TNF-α no afecta a la sobrevida de ratas portadoras de GBM intracraneal, mientras que la sobreexpresión de TRAIL solo incrementa moderadamente la sobrevida mediana, sin inducir regresión tumoral completa en los animales tratados1. El vector con mayor eficacia entre los evaluados es Ad-FasL, que induce regresión tumoral y sobrevida a largo plazo en aproximadamente el 30% de las ratas portadoras de GBM intracraneal, cuando el tratamiento se aplica 4 días luego de la inoculación tumoral1. Sin embargo, si el tratamiento con Ad-FasL se pospone hasta el día 10, cuando los tumores son más grandes y el modelo es más similar a lo que ocurre en la clínica, la terapia falla por completo1. La relativa baja eficacia de estos vectores ha sido atribuida en parte a la presencia de receptores solubles para TNF-α y FasL que neutralizan las citocinas proapoptóticas1,9,10. Por otra parte, dado que las citocinas proapoptóticas tienen como blanco las células tumorales que expresan receptores de muerte específicos, estos tratamientos pueden llevar a la selección de células tumorales que no expresan dicho receptor y el tumor puede volverse resistente a la terapia. Sin embargo, ha sido descrito que las células de GBM pueden aumentar la expresión de receptores de muerte, ante injurias como la irradiación o la quimioterapia7,11-13, por lo tanto la combinación de vectores proapoptóticos con terapias tradicionales podría tener un beneficio clínico significativo.
Terapia génica con citocinas proapoptóticas. Esta estrategia utiliza vectores que codifican para citocinas proapoptóticas, como TNF-α, TRAIL o FasL, para inducir apoptosis en células tumorales que expresan el receptor de muerte correspondiente. Luego de que los vectores infectan a las células tumorales (a), las citocinas son sintetizadas y liberadas al espacio intercelular, donde interactúan con receptores de muerte presentes en la misma célula (b) o en células tumorales vecinas (efecto bystander, c), induciendo la activación de caspasas y finalmente la muerte por apoptosis. Dado que los receptores de muerte también pueden expresarse en células normales del parénquima cerebral (d), esta estrategia conlleva el riesgo de producir neurotoxicidad. Además, muchas células tumorales no expresan receptores de muerte (e), de modo que son insensibles a esta estrategia, pudiendo seleccionarse y generar un tumor resistente a esta terapia.
Dado que en la clínica los vectores de terapia génica son inyectados en los márgenes del tumor luego la resección quirúrgica14, es de vital importancia utilizar agentes proapoptóticos cuyos efectos citotóxicos sean específicos para las células de GBM y no afecten al parénquima cerebral no neoplásico (fig. 1). La administración de vectores Ad que codifican para TRAIL o FasL en el cerebro de ratas normales provoca neurotoxicidad aguda severa1, lo que se correlaciona con la expresión de receptores para TRAIL y FasL en células del parénquima cerebral normal15–17. La citotoxicidad de estos vectores podría ser reducida si la expresión de estas citocinas estuviera controlada por vectores específicos de GBM, como hTERT18, o promotores que se activan específicamente en condiciones de hipoxia características del GBM19. Una desventaja de los Ad controlados por promotores específicos de célula consiste en que su eficiencia de traducción es significativamente menor que los promotores ubicuos20, requiriendo mayores dosis de Ad para lograr eficacia terapéutica, lo cual puede llevar a reacciones inflamatorias21,22. Por otra parte, existen promotores inducibles, los cuales dependen de la administración sistémica de inductores atóxicos, como la doxiciclina, para inducir la expresión génica23. Los promotores radioinducibles dependen de la aplicación de radioterapia para funcionar y permiten el control espacial y temporal de la expresión génica, por lo que pueden ser útiles para dirigir la expresión de este tipo de vectores que codifican para agentes altamente citotóxicos24. La utilización de promotores que dependen de temozolomida también permite controlar la expresión de los Ad terapéuticos en el contexto del tratamiento de rutina para estos pacientes25.
Genes suicidasLos genes suicidas codifican para enzimas que transforman profármacos no tóxicos en moléculas citotóxicas, por eso son transgenes atractivos para utilizar en terapia génica antitumoral (fig. 2). El gen suicida que ha sido más ampliamente estudiado para el tratamiento del GMB es la cinasa de timidina del virus del herpes simple (VHS-TK)26. La VHS-TK fosforila el profármaco ganciclovir (GCV) a GCV monofosfato, el cual, después de su conversión a GCV trifosforilado por enzimas celulares, sustituye a la 2-deoxiguanosina trifosfato. Cuando el GCV trifosfato es incorporado a la cadena de ADN, este inhibe a la ADN polimerasa conduciendo la terminación de la misma27. Dado que el GCV fosforilado puede acceder a células vecinas mediante uniones gap, esta modalidad tiene un robusto efecto bystander que amplifica el efecto citotóxico de VHS-TK28 (fig. 2). Dado que el efecto bystander del TK depende de las uniones intercelulares, la sobreexpresión de las proteínas que forman dichas uniones, como las conexinas, es una estrategia que puede incrementar la eficacia terapéutica de TK. En los astrocitos, la conexina 43 (CX43) es la conexina principal y ha sido también detectada en el 75% de los especímenes de GBM humano. Ha sido demostrado recientemente que la sobreexpresión de las conexinas CX26 y CX43 por la tanshinona iiA, una sustancia química derivada de una hierba medicinal china, aumenta la sensibilidad de células de melanoma B16 a la citotoxicidad inducida por TK + GCV in vitro e in vivo29. El tratamiento con ácido retinoico también incrementa la comunicación intercelular mediante uniones gap, de modo que podría incrementar la respuesta a la terapia génica de genes suicidas30. Células de GBM tratadas con el inhibidor de la histona desacetilasa 4-fenil butirato incrementa la expresión de CX43, la cual es redistribuida a la superficie celular31, aumentando la comunicación mediante uniones gap y amplificando el efecto apoptótico de TK + GCV32. La sobreexpresión de CX43 mediante el uso de vectores de terapia génica mejora significativamente la eficacia de TK en ratones portadores de GBM humano intracraneal33.
Terapia génica con genes suicidas. Esta estrategia utiliza vectores que codifican para genes suicidas para inducir apoptosis en células tumorales proliferación. Luego de que el vector infecta las células tumorales, la cinasa de timidina (TK) se expresa y fosforila al profármaco ganciclovir (GCV, a), un análogo del nucleósido 2’ desoxiguanosina que ingresa libremente a las células luego de su administración sistémica. El GVC-monofosfato (GCV-P) es fosforilado adicionalmente por enzimas celulares (GCV-PPP, b). El GCV-PPP accede al núcleo celular, se incorpora al ADN e inhibe a la ADN polimerasa conduciendo a la terminación de la cadena (c), por lo tanto, es altamente citotóxico en células en proliferación. El GCV fosforilado puede acceder a células vecinas a través uniones GAP e inducir apoptosis (d), por lo que presenta un importante efecto bystander. Dado que TK + GCV solo inducen apoptosis de células en proliferación, esta estrategia tiene bajo riesgo de neurotoxicidad.
Los vectores Ad que codifican para VHS-TK han sido extensamente evaluados en modelos experimentales de cáncer cerebral, como también en ensayos clínicos de pacientes con GBM. Estos vectores inducen la apoptosis en células de GBM humanas, de roedores y caninas2,34–36. La inyección intratumoral de Ad VHS-TK en GBM singeneicos implantados en el cerebro de ratas conduce a la regresión tumoral y a la sobrevida a largo plazo en más del 75% de los animales si los tumores son pequeños en el momento del tratamiento (día 3-4 postimplantación)1,37. Sin embargo, cuando el tratamiento se retrasa al día 10 postimplantación, el Ad VHS-TK + GCV no logra inducir regresión tumoral en estos animales1,37–39. Estos hallazgos están en concordancia con los reportes clínicos que indican que el tratamiento con Ad VHS-TK + GCV solo induce una mejora discreta, aunque significativa, en la sobrevida mediana de pacientes con GBM tratados adicionalmente con terapia convencional40. Este sistema ha sido manipulado para mejorar su eficacia y reducir su posible toxicidad, por ejemplo, los mutantes VHS-TK SR39 y SR26 exhiben gran afinidad por GCV y aciclovir41, lo que permite administrar dosis menores de los profármacos para obtener eficacia terapéutica42. Una cinasa de timidina derivada de la planta del tomate (toTK) ha sido descrita recientemente. La toTK tiene alta afinidad y especificidad por el azidotimidina (AZT) y muestra un efecto citotóxico potente en células de GBM humanas in vitro43. Las ventajas de este sistema son que AZT penetra fácilmente la barrera hematoencefálica y que toTK puede eficientemente fosforilar tanto AZT como AZT-monofosfato44.
Otra forma de incrementar la eficacia de Ad VHS-TK, así como de otras estrategias proapoptóticas, es combinarlas con estrategias inmunoterapéuticas45. Durante la apoptosis de las células de GBM mediada por TK + GCV, se liberan proteínas intracelulares proinflamatorias que estimulan el sistema inmunitario1,2. Ha sido demostrado que durante la apoptosis inducida por TK + GCV, las células de GBM liberan HMGB1, que activa al receptor tipo Toll 2 presente en las células dendríticas (CD) que infiltran el tumor, disparando una respuesta inmunitaria antitumoral que erradica el GBM intracraneal en ratas y ratones1,2. La combinación del vector Ad VHS-TK con vectores que codifican para citocinas inmunoestimulantes que reclutan células presentadoras de antígeno hacia la masa tumoral o aumentan la función de células T citotóxicas, como Flt3L, IFN-α, IFN-γ e IL-2, conduce a la regresión de los tumores cerebrales, la sobrevida a largo plazo y la memoria inmunológica antitumoral en ratones y ratas portadores de GBM intracraneal1,2,46. Estas observaciones sirven de fundamento para la aplicación de vectores Ad que codifican para VHS-TK en combinación con estrategias inmunoterapéuticas, las cuales pueden incluir la administración de vacunas antitumorales de células dendríticas1,2,47,48.
VHS-TK + GCV sensibiliza las células de GBM al efecto citotóxico de la radioterapia y los agentes quimioterapéuticos49, los cuales constituyen el tratamiento estándar de los pacientes con GBM luego de la neurocirugía. La combinación de la terapia génica con GCV y el agente quimioterapéutico y alquilinizante temozolomida tiene un efecto antitumoral sinérgico en modelos experimentales de GBM humano12. La sinergia con temozolomida parece estar relacionada con la inhibición de las enzimas reparadoras de ADN por GCV fosforilado50. Ad VHS-TK + aciclovir aumentan la sensibilidad de las células de GBM de rata a la radioterapia in vitro e in vivo49,51. El tratamiento de modelos murinos de GBM humano con Ad VHS-TK aumenta la eficacia de la radioterapia y reduce la ocurrencia de efectos secundarios neurológicos en ratones irradiados52. Ha sido sugerido que el efecto sinérgico de VHS-TK con la radiación podría estar mediado por un mecanismo de inmunoestimulación mediado por VHS-TK53. En conclusión, considerando que varios estudios preclínicos y clínicos muestran que VHS-TK tiene un efecto sinérgico con otros agentes citotóxicos, como también con estrategias inmunoestimulantes, es importante continuar el desarrollo de esta estrategia, la cual ha demostrado ser segura al ser inyectada en el cerebro de cientos de pacientes con GBM en múltiples ensayos clínicos en diferentes países40,53–55.
Adenovirus oncolíticosInicialmente, los abordajes de terapia génica para el tratamiento de tumores cerebrales utilizaron vectores Ad para la transferencia de genes terapéuticos. Los vectores recombinantes no replicativos portan una deleción en la región E1 que hace al virus incapaz de replicar y dependiente de un virus helper56. Las limitaciones en la distribución de la expresión del transgén de interés utilizando estos vectores57 motivaron el desarrollo de virus oncolíticos de replicación selectiva como una estrategia terapéutica alternativa para inducir apoptosis en células tumorales. Los adenovirus replicativos condicionales (CRAd) pueden replicar selectivamente en células tumorales induciendo su lisis (fig. 3). Con el objeto de mejorar su eficacia, la replicación selectiva puede ser combinada con la expresión de transgenes terapéuticos. Así, los CRAd pueden matar las células lisándolas como resultado de su ciclo replicativo y adicionalmente pueden expresar proteínas citotóxicas, estimular la producción de citocinas inflamatorias, activar la inmunidad mediada por células T o sensibilizar a las células tumorales a la quimioterapia58–60.
Terapia génica con Ad oncolíticos. Esta estrategia utiliza vectores que replican específicamente en células tumorales induciendo su lisis. A) En células normales que no se encuentran en proliferación, la proteína de retinoblastoma (Rb) forma un complejo con E2F, el cual interviene en la replicación celular (a). Luego de la infección el Ad5 wild type sintetiza la proteína E1A, que se une a Rb, permitiendo la liberación de E2F del complejo (b). El E2F libre desencadena así la replicación viral (c) que lleva a la lisis celular. B) En el Ad delta-24, la proteína E1A ha sido mutada (E1AMUT), de manera que no puede interactuar con la proteína Rb (a). De este modo, EF2 no es liberado y no se estimula la replicación viral (b). En células tumorales, Rb se encuentra mutado y disociado de E2F (c), por lo tanto, E2F está libre para inducir la replicación viral luego de la infección con delta-24 (d), llevando a la lisis celular. Durante este proceso, se liberan partículas de delta-24 que infectan a células vecinas, dando lugar a un potente efecto bystander.
Hay varias estrategias para desarrollar CRAd. Una manera es codificar la expresión del gen E1A, que controla la replicación, bajo el control de un promotor o enhancer específico de tumor. Esta estrategia puede aplicarse en GBM utilizando promotores específicos de GBM, como los promotores de hTERT18, HMGB261 o el receptor de quimiocina CXCR462. Otra forma de restringir la replicación de los CRAd en las células normales es aprovechar el perfil de expresión diferencial entre una célula tumoral y una normal. Este es el caso del CRAd delta-24, en el cual el gen E1A posee una pequeña deleción que restringe su interacción con la proteína de retinoblastoma (Rb), que es crítica para el funcionamiento correcto del punto de control G1. Frecuentemente, la vía p16/Rb/E2F se encuentra alterada en varios tumores, en particular en gliomas63. En estas células, Rb es inactivo y no puede unirse a E2F, por lo tanto, este se haya disponible para activar el promotor E2 del CRAd y de genes celulares que regulan el ciclo celular64. Así, delta-24 puede replicarse únicamente en células cancerígenas que posean la función Rb afectada, sin afectar a las células normales64 (fig. 3).
Usando un enfoque similar, otro CRAd, el ONYX-015, ha sido utilizado para el tratamiento de tumores en los cuales la función del factor supresor tumoral p53 se encuentra afectada. Los adenovirus normalmente codifican para genes tempranos E1B que inhiben la función de p53. El ONYX-015 posee una deleción en el gen E1B, de modo que cuando infectan células normales con p53 activo, no pueden replicarse. Sin embargo, cuando este virus infecta células con p53 mutado replica y causa la lisis celular65. Es importante mencionar, que el papel de p53 en la selectividad de ONYX-015 es aún controvertido, ya que ha sido demostrado que este vector podría replicarse en células tumorales con p53 funcional66. Al parecer, la replicación selectiva en las células tumorales estaría determinada por la capacidad de estas células de exportar ARN viral tardío en ausencia de E1B67.
Una estrategia para mejorar la eficacia clínica de estos vectores es aumentar su infectividad. Una manera de aumentar la infectividad de estos vectores es modificar las proteínas de la cápside que se encuentran involucradas en la unión y entrada a la célula tumoral. Por ejemplo, la infectividad del CRAd delta-24ha sido aumentada por la incorporación de un péptido de 3 aminoácidos a la fibra knob, que aumenta su unión a integrinas αv, mejorando la entrada del CRAd a la célula68. Delta-24 RGD ha mostrado un aumento en su capacidad infectiva en células de cáncer ovárico y en modelos in vitro e in vivo de gliomas malignos69.
Un problema potencial de estos vectores es el desarrollo de anticuerpos neutralizantes anti-Ad, que impiden la infectividad de los vectores luego de su administración repetida70. Sin embargo, los Ad replicativos competentes han demostrado ser seguros para el tratamiento de pacientes71. Chiocca et al. evaluaron el ONYX-015 en un ensayo clínico de fase i, que incluyó a 24 pacientes con glioma maligno recurrente. Los autores concluyeron que la administración de ONYX-015 es segura en las dosis reportadas72. Además, en la actualidad, hay 2 ensayos clínicos que utilizan delta-24 RGD en pacientes con GBM, uno en fase i (NCT00805376) y un segundo en fase i/ii (NCT01582516).
Es importante mencionar que existe otro tipo de vectores oncolíticos no adenovirales que han sido desarrollados para la terapia antitumoral. Russell y Peng han trabajado con el virus del sarampión, el cual adquiere tropismo por el receptor CD46 durante la adaptación en cultivo73. Este receptor se encuentra sobreexpresado en células humanas tumorales en comparación con células normales. A alta densidad celular de este receptor, la infección con estos vectores oncolíticos lleva a la fusión intercelular, un efecto citopático clásico del virus del sarampión, que conlleva a la lisis celular73. En particular, una cepa atenuada del virus, derivada del linaje de la vacuna Edmonston, fue genéticamente modificada para producir el antígeno carcinoembrionario, que sirve como marcador de la expresión génica viral74. Este vector (MV-CEA) se encuentra en ensayo clínico fase i para pacientes con glioblastomas recurrentes (NCT00390299).
ConclusionesLa terapia génica es una herramienta muy útil para inducir apoptosis en GBM. Las posibilidades de manipular los vectores de terapia génica para restringir la expresión de los transgenes citotóxicos a las células tumorales utilizando promotores específicos de célula permiten incrementar la especificidad de estas terapias. Además, la posibilidad de utilizar promotores inducibles, dependientes de fármacos o radioterapia, permite controlar la expresión de los transgenes tanto temporal como espacialmente, reduciendo aún mas la posibilidad de desarrollar efectos colaterales. Esta versatilidad, sumada al buen perfil neuropatológico de los Ad, hace de la terapia génica citotóxica una modalidad muy útil para utilizar en el tratamiento del GBM.
El uso de múltiples agentes proapoptóticos parece tener efectos sinérgicos en ensayos preclínicos y en pacientes con GBM. Además, la liberación de proteínas proinflamatorias desde células en proceso de apoptosis parece ser necesaria para disparar respuestas inmunitarias inducidas por inmunoterapia con citocinas y con vacunas antitumorales. Por lo tanto, la combinación de estrategias terapéuticas parece ser el futuro del tratamiento del GBM y otros tumores. Las terapias génicas citotóxicas aquí descritas constituyen modalidades muy promisorias para combinar con otros agentes citotóxicos y con estrategias inmunoestimulantes para el tratamiento del GBM.
FinanciaciónEste trabajo recibió apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONICET PIP 114-201101-00353 a M.C.; beca de posgrado tipo i a M.A.M.A.), la Fundación Bunge y Born (Beca Jorge Oster de perfeccionamiento en oncología a M.A.M.A.) y de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT-2012-0830 a M.C.).
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
