En 1962, Watson observó que en la sangre de recién nacidos con ictericia una pequeña fracción de la bilirrubina se asociaba con los hematíes1. Unos pocos años más tarde, Wan Ho Cheung et al2 revelaron que, cuando se incubaban con bilirrubina en la solución amortiguadora, en particular a concentraciones > 340 µM (20 mg/dl), los hematíes experimentaban cambios dependientes del tiempo y la concentración en la morfología y metabolismo, con una hemólisis final. (Retrospectivamente, parece muy probable que las soluciones de bilirrubina a las que se expusieron las células estuvieran sobresaturadas y hubieran contenido formas agregadas de bilirrubina37.) Los cambios morfológicos inducidos por la bilirrubina se ilustraron con fotografías sorprendentes similares a las publicadas unos 30 años más tarde por otros8,9, sin una referencia a la investigación previa. Fueron reversibles mediante la adición de albúmina sérica al medio de incubación y no se produjeron cuando esta proteína estuvo presente desde el principio en el medio. Más tarde, Brito et al han confirmado y extendido estas observaciones y recientemente han revisado la toxicidad de este pigmento para los hematíes10 (una vez más, sin hacer alusión a la investigación previa fundamental). Para el neonatólogo, un problema importante es si la hemólisis inducida por bilirrubina es clínicamente sustancial en la ictericia neonatal o en otras hiperbilirrubinemias no conjugadas. La revisión implica que lo es10. Sin embargo, disponemos de un número abundante de pruebas de que no es así:
La hipótesis de que la bilirrubina induciría hemólisis de los hematíes se basa sobre todo en los estudios sobre su citotoxicidad in vitro. En la mayor parte de estos estudios, el pigmento se presentó a las células como una solución en un neutralizador o medios de cultivo en presencia o ausencia de albúmina u otras proteínas. Puesto que la bilirrubina cristalina no se disuelve en estos solventes, invariablemente las soluciones se producen añadiendo una solución concentrada de bilirrubina a un pH alcalino fuerte ~ 13 (o en ocasiones en dimetilsulfóxido [DMSO] o etanolamina) al medio, con frecuencia seguido de una neutralización con un ácido fuerte. En general, se supone que la estructura y propiedades de la bilirrubina en las soluciones finales son idénticas a las de la bilirrubina presentada a los hematíes u otras células in vivo. Sin embargo, esta asunción no siempre es válida debido a su capacidad para formar complejos con la albúmina de diferente estoiquiometría y estereoquímica; a su labilidad conformacional y a su capacidad para formar complejos unidos al hidrógeno; y a su tendencia bien conocida a agregarse34-36. De casi todos los estudios in vitro sobre toxicidad de la bilirrubina faltan datos sobre la estructura, molecularidad y estabilidad de la bilirrubina en los medios usados, tanto en presencia como en ausencia de células. La mayor parte de estudios donde se han observado efectos tóxicos significativos, incluidos los que han usado agentes de desplazamiento, se emprendieron en condiciones no fisiológicas en las que habría estado presente bilirrubina. Sin embargo, no disponemos de pruebas de la presencia de agregados de bilirrubina en los hematíes o en el plasma de recién nacidos o de pacientes con síndrome de Crigler-Najjar, incluso con concentraciones altas de bilirrubina, y hay pruebas de que es muy improbable que ocurra34,35. La sorprendente lesión de los hematíes inducida por bilirrubina y representada en la figura 1 de una revisión reciente10 llega a ser menos considerable desde un punto de vista clínico cuando se reconoce que se obtuvo por la exposición de las células a concentraciones de bilirrubina cuyos órdenes de magnitud eran mayores que las de bilirrubina libre a la que se exponen los hematíes en lactantes con ictericia. Ni habría ocurrido si en el medio hubieran estado presentes concentraciones fisiológicas de bilirrubina2. Además, puesto que las soluciones acuosas de bilirrubina a las que se expusieron los hematíes tuvieron más probabilidades de estar sobresaturadas, su mezcla con las células podría haber multiplicado la nucleación, agregación y precipitación del pigmento originando mezclas multifásicas no fisiológicas3,4,6,37. En sangre completa se han efectuado pocos estudios sobre los efectos tóxicos de la bilirrubina sobre los hematíes. Algunos se han emprendido con hematíes lavados reconstituidos hasta un hematocrito del 10%. En dichos estudios no parece haberse reconocido que la carga total de bilirrubina presentada a las células para la misma concentración plasmática de bilirrubina sea mucho mayor con un hematocrito del 10% que con el normal de ~ 45%. Petrich et al describieron que la bilirrubina añadida a la sangre heparinizada de un adulto a una concentración de sólo 70-80 µM (~ 4-5 mg/dl) indujo hemólisis después de 4 h a 37 °C38. Sin embargo, esta observación aislada no coincide con otras efectuadas en hematíes in vitro en los que no se identificó hemólisis con concentraciones incluso más altas de bilirrubina en presencia de albúmina sérica2,8. En estos estudios sólo se utilizaron hematíes de un adulto, y no se verificó la posible interferencia de la bilirrubina en el método espectroscópico usado para estimar la hemólisis38, un fenómeno documentado por Watson1.
De las pruebas clínicas e in vitro publicadas, con la excepción del artículo mencionado previamente38, es difícil negar la conclusión de que la hemólisis inducida por bilirrubina es insignificante in vivo incluso con concentraciones plasmáticas del pigmento asociadas a querníctero o con concentraciones mayores que con las que se considera forzosa una intervención terapéutica. Incluso se dispone de pruebas de que la bilirrubina refuerza la membrana de los hematíes y los protege frente a la lesión oxidativa que podría dar lugar a una hemólisis8,15,16,39. Naturalmente, es difícil sustanciar una negativa. La documentación de la hemólisis de carácter leve en recién nacidos es compleja, e incluso un grado insignificante de hemólisis, insuficiente para producir un efecto sustancial sobre las determinaciones del hematocrito, podría aumentar de manera destacada la reserva de bilirrubina circulante40-42. Necheles et al y, más recientemente, Maisels y Kring han demostrado que el aumento del catabolismo del hem es importante en el desarrollo de la hiperbilirrubinemia en lactantes sanos en los 5 primeros días después del naci-miento41,43. La causa es desconocida y merece una investigación adicional, pero sería prematuro atribuirlo a la hemólisis inducida por bilirrubina.
Sin duda, la hipótesis de que la unión de la bilirrubina predispondría a la hemólisis o fagocitosis de los hematíes de recién nacidos es verosímil y parece respaldada por algunos estudios in vitro10. Incuestionable-mente la bilirrubina puede separarse en las membranas celulares, modificando sus propiedades. No obstante, las extrapolaciones precipitadas a partir de los estudios in vitro a la vida real han enturbiado previamente las aguas del metabolismo de la bilirrubina; dando lugar, por ejemplo, a sugerencias de que su fotodegradación es la vía más importante en la fototerapia y que la fotohemólisis sería un efecto adverso sustancial del tratamiento, sugerencias que hoy día se consideran inco-rrectas44,45. Parece haber pasado desapercibido que la bilirrubina tiene las características de un inhibidor pro-miscuo46-48. Los inhibidores promiscuos son moléculas que dan lugar a falsos positivos en el cribado de alto rendimiento de los fármacos potenciales in vitro. Al igual que la bilirrubina, en general, los inhibidores promiscuos son moléculas hidrófobas con una tendencia a agregarse, y muchas veces la agregación es la causa de la inhibición in vitro promiscua, no fisiológica. Aunque los efectos tóxicos de este pigmento sobre los hematíes y otras células in vitro puedan ser interesantes desde un punto de vista científico con respecto a sus propiedades químicas y los efectos inespecíficos de las moléculas lipofílicas y agregadas sobre las membranas, se requieren pruebas más potentes que las presentadas recientemente10 o las disponibles en la actualidad para respaldar la hipótesis de que la lesión de los hematíes inducida por bilirrubina es suficiente alguna vez para suscitar preocupación clínica.
AGRADECIMIENTOSFinanciado con la beca DK-26307 (AFM) de los National Institutes of Health.
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