Ginecología
Valor de la sobreexpresión de la proteína nuclear p53 en la supervivencia de pacientes con cáncer epitelial de ovario
Value of nuclear protein p53 overexpression in survival of patients with epithelial ovarian cancer
L. Chiva de Agustín1
C. Carrasco2
E. Álvarez2
L. Chiva Carrión1
P. Mazariegos1
S. Lizarraga1
A. Hernández1
L. Granados1
N. López García1
1 Servicio de Ginecología Oncológica Departamento de Ginecología y Obstetricia
2 Departamento de Anatomía Patológica Hospital General Universitario «Gregorio Marañón»
Correspondencia:
Dr. Luis Chiva de Agustín
Clínica Salvia
General López Pozas, 10
28036 Madrid
Fecha de recepción: 22/11/99
Aceptado para publicación: 11/2/00
RESUMEN
Objetivos: Evaluar si la sobreexpresión de la proteína nuclear p53 tiene algún impacto en la supervivencia en las pacientes con cáncer de ovario y si se asocia con otros factores pronósticos.
Material y métodos: Se evalúan mediante técnicas de inmunohistoquímica la sobreexpresión de p53 en 78 pacientes con cáncer epitelial de ovario diagnosticadas en nuestro centro entre 1985 y 1993.
Resultados: La sobreexpresión de la proteína p53 mutada empeora la supervivencia de estas pacientes al considerar todos los estadios. (Supervivencia a cinco años del 84 por 100 en el grupo de tinción negativa frente al 46 por 100 en el grupo de tinción positiva. p < 0,05). La sobreexpresión de dicha proteína se correlaciona de modo estadísticamente significativo con estadios avanzados (83 por 100 de tinción positiva frente a un 62 por 100 en estadios precoces), tumores con grado nuclear agresivo (90 por 100 de positividad en pacientes con grado nuclear G3, frente al 55 por 100 en pacientes G1-G2) y pacientes que fueron sometidas a citorreducción subóptima (85 por 100 de positividad frente al 65 por 100 en pacientes con citorreducción óptima).
Conclusión: La acumulación de p53 en el núcleo de las células de cáncer epitelial de ovario se asocia a un peor pronóstico y se correlaciona con estadios más avanzados, grados nucleares más agresivos y cirugía subóptima.
PALABRAS CLAVE
Cáncer de ovario; p53; Supervivencia.
SUMMARY
Objective: To evaluate the relationship between overexpression of p53 and survival of patients with epithelial ovarian cancer. To study the association of this overexpression with other prognostic factors in this disease.
Methods: 78 patients with epithelial ovarian cancer diagnosed among 1985 and 1993 were evaluated by imnunochemistry tecniques to detect nuclear acumulated p53 .
Results: Considering all stages, p53 overexpresion worsened survival in ovarian cancer patients (84% of 5-y survival in the negative expresion group versus 46 % in the positive group). p53 overexpresion was corelated stastistically with late stages, high nuclei grades and suboptimal debulking.
Conclusion: p53 acumulation in ovarian cancer patients is associated with a poor outcome and it is corelated more frecuently with other poor survival indicators as late stages, high nuclei grades and suboptimal debulking.
KEY WORDS
Ovarian cancer; p53; Survival.
Chiva de Agustín L, Carrasco C, Álvarez E, Chiva Carrión L, Mazariegos P, Lizarraga S, et al. Valor de la sobreexpresión de la proteína nuclear p53 en la supervivencia de pacientes con cáncer epitelial de ovario. Prog Obstet Ginecol 2000;43:183-190.
INTRODUCCIÓN
En los últimos cinco años se han publicado más de 6.000 artículos en la literatura mundial incluyendo en el título el concepto p53. Este interés generalizado por una proteína no tiene parangón en la literatura científica y refleja el importante papel de este gen y de la proteína que codifica, la cual regula y controla el crecimiento celular. En 1994, p53 fue denominada molécula del año por la revista Science(1) y recibe el nombre de proteína «guardiana del genoma» por múltiples investigadores(2). La proteína p53 juega un papel básico en la transcripción del DNA, crecimiento celular y en diversos procesos metabólicos de la célula(3).
p53 es indetectable o se encuentra en muy pequeñas cantidades cuando la célula se encuentra en reposo(4). Sin embargo, existe una gran producción de la misma cuando la célula se torna activa. El modo como funciona esta proteína no se conoce del todo, aunque se entiende que modifica el ciclo celular. Los agentes mutágenos activan su producción. Si existe una mutación del gen y éste queda inactivo está comprobado que aparecen neoplasias primarias. Por lo tanto, este gen se ha considerado un gen supresor. Desde hace varios años se ha demostrado en múltiples ocasiones que diversos tumores sólidos se asocian a la mutación de este gen. Las mutaciones del gen se encuentran localizadas en el dominio interno entre los residuos 175, 248, y 273(5). Mutaciones de este gen se demuestran en tumores de mama, colon, pulmón, ovario y vejiga entre otros(6).
Uno de los efectos que produce la mutación o inactivación del gen p53 es la acumulación intranuclear de la proteína defectuosa. Cuando esa proteína se acumula, se puede apreciar mediante técnicas inmunohistoquímicas si se cruza con anticuerpo monoclonal específico. En general, las células somáticas normales no sobreexpresan esta proteína(7). Surge la duda de si esa sobreexpresión representa en realidad, proteína p53 inactiva o también proteína p53 mutada pero activa. Algunos estudios recientes con análisis de PCR demuestran que al menos el 80 por 100 de los casos que sobreexpresan p53 nuclear son en realidad tumores con genes mutados que codifican para una proteína incapaz de llevar acabo su labor supresora(8).
Los primeros estudios sobre la pérdida de la capacidad supresora de p53 en cáncer de ovario datan de principios de los 90(9,10). El grupo de Duke University describe mutaciones en al menos, el 50 por 100 de los tumores malignos de ovario estudiados. Este grupo encuentra una buena correlación entre la mutación del gen, valorada por la sobreexpresión imnunohistoquímica de la proteína mutada y la aneuploidía existente en estadios avanzados. La existencia de una menor proporción de mutaciones en estadios precoces hace pensar que la mutación de p53 es un acontecimiento tardío en la tumorogénesis del cáncer de ovario(11). Al mismo tiempo varios autores encuentran cierta influencia entre la mutación del gen y un ensombrecimiento de la supervivencia por estadios(12,13 ). En todos estos estudios se describe una buena correlación entre la mutación del gen por PCR y la acumulación nuclear de la proteína mutada. De este modo existe una correlación entre la cantidad de proteína acumulada cuantificada por análisis de imagen y el pronóstico del tumor(14). Esta sobreexpresión intranuclear de proteína mutada produce autoanticuerpos que es posible identificarlos, pero hasta la fecha no se encuentra correlación entre la cuantificación de los mismo y el pronóstico de la enfermedad(15). A pesar de ser muchos los trabajos que reflejan la importancia de este gen en la oncogénesis, son muy pocos los que encuentran que la mutación del mismo sea un una variable independiente que ensombrezca el pronóstico(12,13). Es decir, con frecuencia se encuentra que es una variable que modifica la supervivencia en el análisis univariante pero no en el multivariante. A su vez esta mutación está ausente en los tumores benignos y es extremadamente rara en los tumores de bajo potencial de malignidad(16). Un hecho clínico asociado a esta mutación que se detecta in vitro es la aparente disminución de respuesta a adriamicina de clones de células de cáncer de ovario con p53 mutada, a diferencia de lo que ocurre con los clones que no tienen esta mutación(17). Este hallazgo asocia la mutación del gen a los mecanismos de quimiorresistencia. La inactivación de este gen en las células ováricas se entiende que se produce de modo esporádico a excepción de lo que ocurre en algunos síndromes familiares que asocian cáncer de ovario, como el Síndrome de Li-Fraumenni. El estudio de las líneas germinales en leucocitos periféricos demuestra que no existe mutación primaria en la inmensa mayoría de los casos esporádicos(18).
MATERIAL Y MÉTODOS
Se eligen al azar 78 casos de cáncer epitelial diagnosticados entre 1985 y 1993, siendo aproximadamente la mitad estadios precoces y la otra mitad estadios avanzados. Se revisan de nuevo los cristales y se seleccionan los bloques de parafina donde el tumor es más representativo de su tipo histológico.
Una vez obtenidos los bloques de parafina se realiza el proceso de corte y desparafinación.
Para la tinción inmunohistoquímica se utilizan anticuerpos monoclonales de ratón anti p53 (Novo Castra Laboratories Ltd, UK).
Una vez que se completa el proceso de tinción inmuhistoquímico en los bloques de las 78 pacientes seleccionadas, se procede a su valoración y tabulación. Los cristales son de nuevo revisados por dos observadores quienes se ajustan al siguiente criterio metodológico:
Existencia de tinción nuclear (p53).
* Tincion positiva.
* Tincion negativa.
Intensidad de la tinción INMUNOHISTOQUíMICA.
* Débil (+/+++).
* Moderada (++/+++).
* Intensa (+++/+++).
Porcentaje de tejido teñido.
* Tinción positiva en 1-49 por 100 de las células.
* Tinción positiva en 50-90 por 100 de las células.
* Tinción positiva en 100 por 100 de las células.
Una vez evaluados los cristales se tabulan e introducen en la base de datos SPSS para su correlación con los factores clínicos. Para el análisis de la supervivencia se emplea el método de Kaplan y Meier, usando el método de Log-Rank para las diferencias entre curvas de supervivencia.
RESULTADOS
Se realiza tinción inmunohistoquímica en 78 pacientes. Las características de las pacientes cuyos cristales se someten a tinción imnunohistoquímica de p53 se exponen en las tablas 1 y 2.
Tabla 1 Distribución por estadios de las pacientes estudiadas mediante inmunohistoquímica | ||
| Estadios | Número | % |
| I-II | 36 | 46 |
| III-IV | 42 | 54 |
| Tabla 2 Distribución por tipos histológicos de las pacientes estudiadas mediante inmunohistoquímica | ||
| Tipo AP | Número | % |
| Seroso | 18 | 25 |
| Mucinoso | 17 | 23,6 |
| Endometrioide | 18 | 25 |
| Mulleriano mixto | 2 | 2,8 |
| Células claras | 7 | 9,7 |
| Tumores mixtos serosos | 1 | 1,4 |
| Adenocarcinoma | 9 | 12,5 |
Tras la valoración por dos observadores de la tinción inmunohistoquímica de la proteína p53 nuclear se distribuyen y tabulan las observaciones. Mostramos el porcentaje de pacientes con sobreexpresión positiva, la intensidad de tinción y el porcentaje de tejido teñido en la tabla 3.
Tabla 3 Distribución de las pacientes según las características de la tinción inmuhistoquímica para p53 | |||
| N | % | ||
| Sobreexpresión p53 nuclear | |||
| Tinción positiva | 57 | 73,1 | |
| Tinción negativa | 21 | 26,9 | |
| Intensidad de tinción | |||
| Tinción + | 9 | 15,8 | |
| Tinción ++ | 16 | 28,1 | |
| Tinción +++ | 32 | 56,1 | |
| % de tejido teñido | |||
| 5-50 por 100 de núcleos | 10 | 19 | |
| 50-90 por 100 de núcleos | 17 | 32 | |
| 100 por 100 de núcleos | 28 | 49 | |
La sobreexpresión de proteína p53 mutada empeora el pronóstico de este grupo de pacientes de modo estadísticamente significativo. Este hecho se demuestra en la supervivencia global y en la supervivencia libre de enfermedad (Fig. 1). Al estudiar los estadios precoces la sobreexpresión de p53 modifica el pronóstico, aunque no se demuestra significación estadística dado el número de casos (tabla 4). No se encuentran diferencias significativas en las curvas de supervivencia entre las pacientes con estadios avanzados al estudiar la tinción de la proteína p53 (tabla4). La tinción positiva de la proteína p53 se correlaciona bien con diversas variables que condicionan normalmente el pronóstico como son: el grado nuclear, el grado arquitectural, el grado de agresividad biológica, entendido como la impresión global del tumor valorado por un mismo patólogo. Las pacientes con enfermedad precoz muestran porcentualmente una tinción de p53 significativamente menor que aquellas con enfermedad avanzada. Los tumores con grados histológicos y nucleares más agresivos tienen un porcentaje mucho mayor de núcleos celulares positivos para p53 mutada. Las pacientes sometidas a una citorreducción óptima también presentan un porcentaje menor de positividad para p53. Todos estos datos se muestran en la tabla 5.
Tabla 4 Supervivencia global y libre de enfermedad a cinco años según tinción inmunohistoquímica para p53. Estadios precoces y avanzados | |||
| Sobreexpresión p53 nuclear | N | Superv. libre de enf. cinco años | |
Estadios I-II | |||
| Tinción negativa | 14 | 100 | |
| Tinción positiva | 21 | 75,6% | |
| Estadios III-IV | |||
| Tinción negativa | 6 | 33,2% | |
| Tinción positiva | 29 | 25,0% | |
| N.S. | |||
Tabla 5 Asociación existente entre la distribución porcentual de casos por variables pronósticas y tinción inmunohistoquímica de p53 | ||||
| Sobreexpresión p53 nuclear | Tinción negativa | Tinción positiva | p | |
| Estadio figo | I-II | 38% | 62% | < 0,05 |
| III-IV | 17% | 83% | ||
| Grado nuclear | G1 | 45% | 55% | < 0,01 |
| G2-G3 | 10% | 90% | ||
| Grado arquitectural | G1 | 47% | 53% | < 0,01 |
| G2-G3 | 15% | 85% | ||
| Grado de agresividad | G1-G2 | 49% | 51% | < 0,05 |
| G3 | 13% | 87% | ||
| Citorreducción | Subóptima | 15% | 85% | < 0,08 |
| Óptima | 34% | 65% | ||
Figura 1. Supervivencia de pacientes con cáncer epitelial de ovario según la sobreexpresión de la proteína p53 para todos los estadios (p < 0,05).
Cuando se valora la intensidad de la tinción positiva, la supervivencia es menor cuando la tinción es intensa (+++) que cuando la intensidad es más débil (+ y ++), pero estas diferencias aunque importantes no alcanzan significación estadística (Fig. 2).
Figura 2. Curvas de supervivencia en pacientes con cáncer de ovario según intensidad de tinción de p53 (p < 0,08).
La mayor intensidad de la tinción entre las pacientes con tinción positiva se asoció de nuevo a pacientes con enfermedad más precoz y con un grado de agresividad mayor (tabla 6). También se estudia entre las pacientes con tinción positiva para p53 la distribución de la tinción imnunohistoquímica en el tejido problema. Se encuentran diferencias pero no fueron significativas entre las pacientes con tinción de más y menos del 80 por 100 de los núcleos.
Tabla 6 Asociación existente entre la distribución porcentual de casos por variables pronósticas y la intensidad tinción inmuno-histoquímica de p53 | ||||
| Sobreexpresión p53 nuclear | +y++ | +++ | p | |
| Estadio | I-II | 62% | 37% | < 0,05 |
| III-IV | 36% | 63% | ||
| Grado nuclear | G1-G2 | 60% | 40% | < 0,06 |
| G3 | 23% | 72% | ||
Por tanto si consideramos como factores de mal pronóstico: tinción positiva, intensidad +++ y porcentaje de tinción mayor de 80 por 100 podemos establecer diversos grupos de riesgo. Un primer grupo de pronóstico (bajo riesgo) viene definido por los tumores negativos para sobreexpresión de p53. El segundo grupo de riesgo (riesgo intermedio), definido como aquellos tumores positivos para p53 pero con intensidad baja y con un porcentaje de tinción menor del 80 por 100. Finalmente un grupo de alto riesgo compuesto por los tumores con positividad de alta intensidad y porcentaje mayor del 80 por 100 para p53. Estos grupos expresan grupos de supervivencia muy definidos, tal como se demuestra en la tabla 7 y en la figura 3.
Tabla 7 Supervivencia libre de enfermedad a cinco años según grupos de riesgo de tinción de p53 | ||
| Sobreexpresión p53 nuclear | N | Superv. libre de de enf. cinco años |
| Tinción negativa | 21 | 84,2% |
| Tinción positiva + y ++ menos del 80 por 100 de núcleos teñidos | 26 | 65,6% |
| Tinción positiva +++ más del 80 por 100 de núcleos teñidos | 25 | 28,65 |
| p < 0,05. | ||
Figura 3. Curvas de supervivencia en pacientes con cáncer de ovario según la valoración global de parámetros de tinción de la proteina nuclear p53 (p < 0,05).
DISCUSIóN
Tal como se indicó en la introducción, a principios de los 90, el grupo de Duke University encabezado por Andrew Berchuck publica sus resultados sobre la asociación entre la mutación del gen p53 y cáncer epitelial de ovario. Llamaba la atención que el 50 por 100 de los tumores epiteliales de ovario presentaban una mutación de este gen que se acompaña de sobreexpresión de la proteína en el núcleo tumoral. En un principio se encontró una correlación entre la expresión y la supervivencia de las pacientes(19). Al mismo tiempo se encontró una buena asociación entre la expresión de p53, enfermedad avanzada y aneuploidía tumoral(19-22). En 1993 el Grupo de Duke University publica un artículo en el que se manifiesta que los tumores precoces se en menor frecuencia a mutación de p53 y que ésta no predice la supervivencia en estos estadios(21). Hasta ese momento se estima que la mutación de p53 es una realidad en cáncer de ovario, que no es un evento que acaece en tumores benignos, raramente ocurre en tumores borderline y que posiblemente se trata de un suceso tardío en la cadena de acontecimientos de la tumorogénesis. Otra teoría considera que los tumores con sobreexpresión de la proteína p53 son tumores avanzados desde el principio, considerando su agresividad(22). Sin embargo ningún estudio amplio ha sido capaz de detectar la mutación de p53 como una variable independiente de pronóstico, en relación con los tumores epiteliales de ovario y la mutación de p53 sólo podemos decir que se trata de un suceso molecular frecuente, que se asocia a tumores de peor pronóstico y que además es más frecuente en la enfermedad avanzada. Otros autores han asociado la mutación del gen a tipos histológicos serosos, que son normalmente más agresivos(23). También se asocia la expresión de p53 en el tumor ovárico primario con quimiorresistencia a los derivados del platino(24).
Es obligado en esta discusión destacar una reciente presentación multicéntrica americana sobre este particular. En febrero de 1999 A. Berchuck(25) presenta en los resultados de un trabajo que intenta correlacionar la mutación de p53 --sobreexpresión nuclear inmunohistoquímica de la proteína mutada-- con la supervivencia de pacientes de cáncer de ovario. El trabajo incluye pacientes de los protocolos de tratamiento del GOG (protocolos de 114 y 132), en donde encuentran que el 45 por 100 de los tumores avanzados presentan una mutación en el gen que codifica para p53. Todos los tumores que tienen mutado el gen presentan sobreexpresión de la proteína, pero al mismo tiempo el 35 por 100 de los tumores que expresan la proteína nuclear no tienen mutación del gen. Se destacaba que ni la mutación del gen ni la sobreexpresión de su producto modifican de modo estadístico la supervivencia. Existe una supervivencia peor en el grupo con gen mutado (39 frente 49 meses), pero esta diferencia no es estadísticamente significativa(25).
Nuestros resultados en general avalan y ratifican todo lo descrito hasta ahora. En primer lugar encontramos que la sobreexpresión de p53 es frecuente (70 por 100), pero la sobreexpresión intensa se da en algo menos de la mitad de los casos (41 por 100). En nuestra serie nosotros encontramos un beneficio estadísticamente significativo en la supervivencia, entre las pacientes p53 negativas respecto las p53 positivas cuando consideramos todos los estadios. (Supervivencia a cinco años del 88 por 100 versus 59 por 100). Este beneficio es más evidente entre las pacientes en estadios precoces que entre las que se encontraban en estadios avanzados. Al considerar a las pacientes por estadios, en ningún caso fueron significativas las diferencias. Los tumores en fase precoz expresan p53 en una proporción mucho menor que los tumores avanzados (62 por 100 frente a 93 por 100). Por tanto, una primera conclusión es que la mutación de p53 se asocia a enfermedad avanzada y por tanto es lógico que las pacientes con enfermedad avanzada tengan peor supervivencia. Quizá la asociación más evidente queda determinada entre la sobreexpresión de p53 y el grado nuclear. En nuestra población hemos demostrado(26) que el grado nuclear es la variable que de modo independiente modifica la supervivencia. Por tanto aunque la sobreexpresión de p53 no predice la supervivencia de modo independiente, podemos afirmar que es un buen marcador de agresividad tumoral como lo indica su estrecha asociación a grados nucleares más agresivos, tipos histológicos más agresivos, grados arquitecturales más agresivos, etc. Otro aspecto interesante es que la intensidad de la tinción de la sobreexpresión de p53 es también un marcador de supervivencia tras el análisis de nuestros datos. De este modo vimos que los tumores más avanzados se tiñen con una intensidad mayor de modo estadísticamente significativo. Así los tumores con un grado nuclear más agresivo ofrecen también una intensidad de tinción mayor. Estas conclusiones nos permiten encontrar un nuevo filtro que denominamos tinción positiva de alta intensidad que es capaz también de diferenciar un grupo de pacientes de peor supervivencia al compararlo con el grupo de tinción negativa e intermedia.
Concluimos por tanto que en la población estudiada de pacientes con cáncer de ovario la sobreexpresión nuclear de la proteína p53 es un marcador de enfermedad avanzada y en general de tumor más agresivo. Entre las pacientes con estadios precoces se encuentran diferencias en la supervivencia pero no fueron significativas. Sería interesante en un futuro dilucidar si las pacientes con estadios I-II se benefician del estudio de la positividad de la sobreexpresión de p53 ya que estas pacientes serían portadoras de un tumor más avanzado de lo que se pensaba (implantes o metástasis ocultas, no diagnosticadas) o de tumores más agresivos dentro del grupo de estadios precoces.
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