Avaliar por meio do teste de micronúcleo em células esfoliadas da mucosa oral a genotoxicidade de hormônios empregados na terapia de reposição hormonal (TRH).
Material e métodosQuarenta mulheres menopausadas foram selecionadas e distribuídas em quatro grupos de dez: G0 (não submetidas à TRH), G1 (TRH com estrógeno), G2 (TRH com estrógeno e progestágeno) e G3 (TRH com tibolona). Células esfoliadas da mucosa oral foram coletadas e processadas para análise, sob microscopia óptica, de danos cromossômicos (micronúcleos) e de apoptose, inferida pelo somatório de alterações nucleares degenerativas (picnose, cariorréxis e cromatina condensada). Duas mil células foram analisadas por participante. A análise estatística foi feita com o uso do teste condicional para comparação de proporções em situação de eventos raros.
ResultadosA frequência de micronúcleo não diferiu entre os grupos (p>0,05). As alterações nucleares indicativas de apoptose foram significativamente mais altas entre as mulheres do G0 em relação às dos demais grupos (p<0,01). Os grupos submetidos à TRH não diferiram quanto à ocorrência de apoptose (p>0,05).
ConclusõesEsses resultados indicam que, tal como avaliado neste estudo, a TRH não induz danos cromossômicos. Entretanto, devido ao efeito antiapoptótico, permite a proliferação de células geneticamente danificadas, está assim potencialmente associada ao processo de transformação maligna.
To evaluate through the micronucleus test in exfoliated cells of oral mucosa the genotoxicity of hormones used in hormone replacement therapy (HRT).
Material and methodsForty postmenopausal women were selected and divided into four groups of ten: G0 (not submitted to HRT), G1 (HRT with estrogen), G2 (HRT with estrogen and progestogen) and G3 (HRT with tibolone). Exfoliated cells of oral mucosa were collected and processed for analysis of chromosomal damage (micronuclei) and apoptosis, inferred by the sum of nuclear degenerative alterations (picnosis, cariorréxis and condensed chromatin). Two thousand cells were analyzed by participant. Statistical analysis was performed using the conditional test to compare proportions in a situation of rare events.
ResultsThe frequency of micronuclei did not differ between groups (p>0.05). Apoptotic cells were significantly higher among women from G0 when compared to the other groups (p<0.01). The groups submitted to HRT did not differ in apoptosis occurrence (p>0.05).
ConclusionsThese results indicate that, as assessed in this study, TRH does not induce chromosomal damage, however, due to the anti‐apoptotic effect, cells genetically damaged can proliferate, favoring the malignant transformation process
A terapia de reposição hormonal (TRH) por meio da administração de hormônios à base de estrógeno e progestágenos sintéticos é usada para amenizar os sintomas da menopausa. Além desses hormônios, a tibolona, esteroide sintético com propriedades estrogênicas, progestogênicas e androgênicas, constitui uma opção na TRH.1 Segundo Guazzelli et al. (2014)2 “postula‐se que a tibolona constitua uma valiosa opção para o tratamento das queixas climatéricas, além de ter efeitos positivos sobre a sexualidade, o bem‐estar e o humor”.
Efeitos adversos da TRH, entretanto, têm sido relatados, entre eles o desenvolvimento de câncer.3,4 Uma vez que o câncer é uma doença genética decorrente de alterações em genes envolvidos no controle da proliferação e diferenciação celular, no reparo do DNA e na apoptose, a avaliação dos efeitos genotóxicos dos hormônios usados na TRH é necessária para maior segurança desse tratamento.
Joosten et al.,5 em revisão bibliográfica que incluiu estudos que objetivaram avaliar o potencial genotóxico de esteroides, alguns dos quais usados na TRH, concluíram que efeitos dessa natureza estavam associados principalmente aos estrógenos naturais estrona e estradiol e aos progestágenos sintéticos acetato de ciproterona e medroxiprogesterona.
Liehr3 observou que o 17β‐estradiol estimula a proliferação celular e quando metabolizado é convertido em compostos que podem causar danos ao DNA. Efeitos genotóxicos desse hormônio não foram, contudo, observados por Casella et al. (2005).6 Genotoxicidade de progestágenos foi observada nos estudos de Dhillon & Dhillon7 e Martelli et al.8 que avaliaram, respectivamente, o acetato de noretisterona em linfócitos humanos e o acetato de ciproterona em hepatócitos de ratas. Danos ao DNA induzidos pela tibolona não foram observados em linfócitos de mulheres menopausadas que faziam uso exclusivo desse hormônio.9
Nesse contexto, testes de genotoxicidade se constituem em valiosos métodos para inferir a capacidade de determinado agente de induzir danos no material genético. Dentre esses, o teste de micronúcleo em células esfoliadas tem sido amplamente usado na avaliação de populações humanas expostas a agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos.10,11 Micronúcleos são estruturas formadas por cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos que, durante a divisão celular, falharam na ligação ao fuso e assim não foram incluídos no núcleo das células filhas. Refletem, portanto, a ação de agentes aneugênicos e clastogênicos.
Na feitura do teste de micronúcleo, Tolbert et al.12 e Thomas et al.13 propõem adicionalmente o cômputo de alterações nucleares indicativas de apoptose: picnose, cromatina condensada e cariorréxis. Apoptose é um mecanismo de morte celular geneticamente programado responsável pela homeostase tecidual e pela eliminação de células com alterações no DNA que poderiam vir a lhes conferir vantagens sobre suas contrapartes normais.14
Diante do exposto, foi objetivo deste estudo avaliar, com o uso do teste de micronúcleo em células esfoliadas da mucosa oral, o potencial genotóxico da terapia de reposição hormonal em mulheres menopausadas.
Material e métodosTipo de estudoO desenho experimental caracteriza um estudo individualizado e observacional de corte transversal que permite identificar possível associação entre o uso de terapia hormonal e efeitos genotóxicos evidenciados pela ocorrência de danos cromossômicos (micronúcleos) e apoptose, inferida pelo somatório de alterações nucleares degenerativas (picnose, cariorréxis e cariólise).
AmostraA amostra foi composta por 40 mulheres menopausadas distribuídas em quatro grupos de dez: G0, não submetidas à TRH; G1, que recebem estrógeno isoladamente; G2, tratadas com estrógeno combinado com progestágeno e G3, em uso de tibolona.
A caracterização da amostra foi feita com aplicação de questionário de entrevista sobre idade, hábito de fumar, ingestão de bebidas alcoólicas, exposição à radiação e a genotóxicos químicos. Foram incluídas no estudo mulheres em menopausa havia pelo menos seis meses e, exceto no G0, em uso de TRH por igual período. As fumantes e aquelas que informaram exposição a agentes genotóxicos de qualquer natureza havia menos de seis meses foram excluídas.
Obtenção do material e preparações para o estudo citológicoCélulas da mucosa bucal foram coletadas com uso de escova endocervical e transferidas, por esfregaço, para lâmina de microscopia com duas gotas de solução fisiológica (NaCl 0,9%). Após secagem à temperatura ambiente, as preparações foram submersas por dez minutos em solução de metanol/ácido acético (3:1) para fixação. Vinte e quatro horas depois foram coradas com reativo de Shift e contracoradas com fast green a 1% em álcool absoluto por um minuto.
Análise citológicaA análise de micronúcleo e alterações nucleares indicativas de apoptose foi feita em teste cego com relação aos dados do questionário. Foram analisadas 2.000 células de cada mulher. Os critérios adotados para identificação de micronúcleo (fig. 1C) e alterações nucleares indicativas de apoptose (fig. 1A, B e D) foram os descritos por Sarto et al.15 e Tolbert et al.,12 respectivamente. Apoptose foi inferida pelo somatório de cariorréxis, picnose e cromatina condensada.
Análise estatística
A comparação entre as médias de idade dos grupos foi feita com uso da análise de variância (Anova). O teste condicional para comparação de proporções em situação de eventos raros16 foi usado para avaliação da ocorrência de micronúcleos e apoptose. Esse é um teste opcional ao qui‐quadrado, similar ao de Fisher,17 apropriado para avaliar eventos citogenéticos quando um grande número de células é necessário para detectar marcadores que ocorrem em baixa frequência.
Aspectos éticosO projeto de pesquisa foi elaborado de acordo com a Declaração de Helsinque revisada em 2008 e obteve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Feira de Santana (CAAE 0083.0.059.000‐09). Todas as pessoas da amostra foram esclarecidas a respeito e tiveram liberdade para não participar ou desistir no momento que lhes fosse conveniente. Aquelas que concordaram em participar assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
ResultadosCaracterísticas da amostraAs médias de idade em anos±desvio padrão das participantes, 51,7±6,53 (G0), 56,2±7,00 (G1), 57,8±8,75 (G2) e 58,6±5,23 (G3), não foram significativamente diferentes (p>0,50). Duas mulheres em G0 e três em cada um dos demais grupos informaram ingestão de bebidas alcoólicas em frequência baixa (82% bebiam ocasionalmente).
O uso de TRH foi relatado evidentemente pelas mulheres do G1, G2 e G3. Em G1 o tempo de terapia foi de seis meses a dez anos, em G2 de um a dez anos e G3 entre seis meses e oito anos. Algumas mulheres (cinco) declararam ter usado ao longo do tempo de TRH mais de um tipo de hormônio, entretanto para este estudo foi considerada a terapia instituída nos últimos de seis meses. Nove mulheres do G1 faziam uso de estradiol e apenas uma de estriol. No G2 cada uma fazia uso do estradiol, combinado a um dos quatro progestágenos: acetato de noretisterona, didrogesterona, drospirenona, acetato de ciproterona.
Análise citogenéticaForam analisadas 80.000 células (20.000 em cada grupo). A análise estatística que comparou a ocorrência de micronúcleos observada entre os grupos não revelou diferença significativa (tabela 1).
Ocorrência de micronúcleo na mucosa oral de mulheres menopausadas submetidas (G1, G2 e G3) ou não (G0) à terapia de reposição hormonal
| Grupo amostral | Micronúcleos observados | Micronúcleos esperado | Parâmetros estatísticos |
|---|---|---|---|
| G0 | 5 | 4,75 | χ2=2,2632 GL= 3 p>0,05 |
| G1 | 6 | 4,75 | |
| G2 | 6 | 4,75 | |
| G3 | 2 | 4,75 |
χ2, valor de qui‐quadrado; GL, graus de liberdade.
Diferença significativa foi observada na ocorrência de apoptose (∑cariorréxis, cromatina condensada e picnose) entre os grupos. As partições do qui‐quadrado revelaram que as mulheres que não estavam sob TRH apresentaram frequência significativamente maior de apoptose em relação àquelas submetidas à TRH, independentemente do tipo de terapia. Em função do tipo de TRH, não foram observadas diferenças nas frequências de apoptose entre os grupos. Os dados referentes à ocorrência de apoptose são apresentados na tabela 2.
Ocorrência de apoptose (∑cariorréxis, cromatina condensada e picnose) na mucosa oral de mulheres menopausadas submetidas (G1, G2 e G3) ou não (G0) à terapia de reposição hormonal
| Grupo amostral | Apoptose observada | Apoptose esperada | Parâmetros estatísticos | Partições do χ2; GL=1 |
|---|---|---|---|---|
| G0 | 298 | 240,25 | χ2=19,43 GL = 3 p<0,01 | G0 x G1=15,24; p<0,05 G0 x G2=11,10; p < 0,05 G0 x G3=8,48; p < 0,05 G1 x G2=0,33; p > 0,05 G1x G3=1,00; p > 0,05 G2 xG3=0,18; p > 0,05 |
| G1 | 210 | 240,25 | ||
| G2 | 222 | 240,25 | ||
| G3 | 231 | 240,25 |
χ2, valor de qui‐quadrado; GL, graus de liberdade.
Os efeitos adversos da menopausa, a exemplo de suores noturnos, secura vaginal, riscos de doença cardiovascular e osteoporose, podem ser minimizados com a TRH.18 A despeito dos benefícios que se traduzem em melhoria da qualidade de vida, Caufriez19 ressaltou que uma série de estudos tem revelado que os riscos potenciais da TRH poderiam exceder os benefícios esperados. Segundo este autor, entre os principais efeitos adversos estariam: problemas cardiovasculares, tromboembólicos e o risco de câncer, principalmente o câncer de mama. Nesse contexto, a análise de danos cromossômicos e alterações nucleares indicativas de apoptose, com uso do teste de micronúcleos, em mulheres sob TRH se faz importante, uma vez que na iniciação e no desenvolvimento do câncer danos de natureza diversa ao DNA ocorrem antes dos sintomas clínicos.
A ocorrência de micronúcleo observada neste estudo não foi estatisticamente diferente entre as mulheres sob TRH e aquelas não submetidas a essa terapia. Esse resultado corrobora os descritos por Casella et al.6 em estudo no qual avaliaram a ocorrência de micronúcleo em linfócitos de 16 mulheres submetidas a TRH à base de dihidrogesterona combinada com 17‐β‐ estradiol. Martelli et al.20 e Reimann et al.21 avaliaram em modelos animais os efeitos genotóxicos de hormônios usados na TRH e também não identificaram maior ocorrência de micronúcleos.
A associação entre ocorrência de micronúcleo e hormônios usados na TRH foi, por outro lado, relatada em estudos in vitro.22–25 Kayani & Parry22 avaliaram o efeito genotóxico de 17‐β‐estradiol e progesterona em linfoblastos humanos e identificaram aumento na frequência de micronúcleos após exposição. Fisher et al.23 e Stopper et al.,25 em avaliação dos efeitos genotóxicos do estradiol, relataram resultados similares possivelmente devido ao efeito desse hormônio em estimular a proliferação celular. Maior ocorrência de micronúcleos em hepatócitos de ratos induzida pelo acetato de ciproterona (progestágeno sintético) foi descrita por Martelli et al.8
Apesar de não terem sido encontrados na literatura estudos que relacionem a frequência de micronúcleos com a administração de tibolona, Ozcagli et al.9 avaliaram o potencial genotóxico desse composto com o uso do ensaio cometa e não observaram diferença significativa na ocorrência de danos ao DNA entre um grupo de mulheres controle e outro em TRH com tibolona.
A apoptose é um processo que tem papel essencial como mecanismo de proteção contra a carcinogênese por eliminar células geneticamente danificadas.26 Neste estudo a ocorrência dessas alterações foi significativamente maior no grupo controle (G0) quando comparado com qualquer um dos grupos que usavam a TRH. Esse resultado sugere que os hormônios da TRH podem estar relacionados ao processo de transformação maligna devido à inibição da apoptose, o que permitiria a proliferação de células geneticamente danificadas.
Efeito antiapoptótico do estradiol foi relatado por Gompel et al.,27 Teixeira et al.28 e Lee et al.29 Hissom e Moore30 também observaram esse efeito em relação aos progestágenos, porém, segundo esses autores, os progestágenos tanto inibem a morte celular quanto à proliferação, resultados esses confirmados em outros estudos.31,32
Franke e Vermes33 mostraram que nem todos os progestágenos agem igualmente em células de câncer de mama in vitro. Alguns estimulam a proliferação, enquanto outros induzem a apoptose. Acetato de medroxiprogesterona, acetato de noretisterona, isolados ou combinados ao estradiol, estimulam a proliferação; dihidrodidrogesterona não induz a proliferação nem a apoptose, enquanto que a progesterona induz a apoptose.
Em relação ao uso combinado de estradiol e progestágeno, Moore et al.32 sugeriram que os progestágenos são inibidores de morte celular mais potentes do que os estrógenos. Esse acentuado efeito antiapoptótico dos progestágenos poderia explicar por que a TRH que combina progestágeno e estrógeno está mais relacionada com o risco de câncer de mama do que a terapia à base de estrógeno.34
Em relação à tibolona, no presente estudo não foi observada diferença significativa na ocorrência de apoptose entre o grupo sob TRH com esse composto e aqueles que usam estrógeno isoladamente ou estrógeno combinado com progestágeno. Além disso, a ocorrência de apoptose foi também maior no G0 em relação ao G3. Esse resultado revela que a tibolona também está relacionada à inibição da apoptose. Entretanto, outros estudos são necessários para avaliar o efeito da tibolona na apoptose, uma vez que Gompel et al.35 e Kloosterboer36 relataram que esse hormônio tem efeito indutor desse processo, e não inibidor.
Nas condições em que o estudo foi feito é possível concluir que em longo prazo a TRH pode contribuir para o desenvolvimento neoplásico por permitir a proliferação de células geneticamente danificadas.
Conflitos de interesseOs autores declaram não haver conflitos de interesse.
Ao Centro de Pesquisa e Assistência em Reprodução Humana (CEPARH) de Feira de Santana e às médicas Adenilda Martins e Ednalva Menezes, que propiciaram a coleta do material usado neste trabalho.