Perspectivas de uso da hibridização genômica comparativa como rastreamento pré-implantacional em biópsias de embrião humano no estágio de blastocisto

Resumo

O rastreamento genético pré-implantacional parece melhorar as taxas de gravidez em certos grupos de pacientes com mau prognóstico nos tratamentos de fertilização in vitro. Mais recentemente tem-se sugerido seu uso para a seleção visando à transferência de um embrião único. O presente artigo tem como objetivo discorrer sobre a técnica de hibridização genômica comparativa, a biópsia do embrião na fase de blastocisto e as perspectivas de uso desses como rastreamento genético pré-implantacional. Foi feita revisão bibliográfica em artigos científicos, livros e periódicos. O método de hibridização genômica comparativa é capaz de analisar todos os pares cromossômicos e mostra-se promissor na identificação das aneuploidias. A biópsia do embrião na fase de blastocisto parece ser menos agressiva e fornece mais material genético do que aquela feita na fase de clivagem. A transferência de um embrião geneticamente normal aumenta as chances de gravidez nos procedimentos de fertilização in vitro. Entretanto, ainda não temos estudos randomizados controlados suficientes para assegurar que a hibridização genômica comparativa em blastocisto tenha impacto prático suficiente para aumentar as chances de gravidez.

Abstract

Pre-implantation genetic screening could improve pregnancy rates in certain groups of patients with poor prognosis undergoing in vitro fertilization procedures. Recently its use as screening has been suggested aiming single embryo transfers. This paper evaluates comparative genomic hybridization technique, blastocyst stage embryo biopsy and analyzes the prospects of using both as pre-implantation genetic screening. A bibliographical review in scientific articles, books, journals and websites was done. Comparative genomic hybridization is able to analyze all chromosomes being promising as pre-implantation genetic screening. Blastocyst biopsy seems to be less aggressive to the embryo and provides additional genetic material compared to cleavage stage biopsies. The transfer of a genetically normal embryo increases pregnancy rates in in vitro fertilization procedures. However there are insufficient randomized controlled trials to ensure that comparative genomic hybridization in blastocysts cells has a practical impact in pregnancy rates.

Introdução

Casais que experimentam a infertilidade recorrem a tecnologias de reprodução assistida para conseguir a gravidez. Muitos desses casais submetem-se a múltiplos ciclos de fertilização in vitro (FIV) sem sucesso e frequentemente procuram outras opções para melhorar suas chances de um bom resultado.

A aneuploidia cromossômica é causa reconhecida de abortamentos espontâneos e responsável por cerca de dois terços desses.¹ As aberrações encontradas podem variar desde simples trissomias ou monossomias até anomalias mais complexas, que envolvem múltiplos cromossomos. Os resultados de gravidez variam desde falhas de implantação, abortamentos precoces ou tardios até nascimentos anormais, o que depende dos cromossomos envolvidos.

A estratégia mais usada para a identificação de embriões viáveis é baseada na avaliação de critérios morfológicos, tais como o número e tamanho das células, a presença de multinucleação, o percentual de fragmentação e a taxa de clivagem.^2–5 A avaliação morfológica é praticada em todos os laboratórios de FIV e continua a ser o esteio na avaliação do embrião. No entanto, alguns dos aspectos mais importantes da viabilidade do embrião permanecem invisíveis para tais análises.

Recentemente, com a evolução das técnicas de biópsia embrionária e o aprimoramento dos testes genéticos, várias estratégias têm sido sugeridas para se alcançar uma avaliação mais acurada de todos os cromossomos a partir do material biopsiado de embriões ou oócitos. Atualmente, a mais promissora delas parece ser a hibridização genômica comparativa (CGH).^6–10

Em 2008, durante a reunião da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM), os dados clínicos de ciclos que usam a CGH para analisar biópsias de blastocisto foram apresentados e indicaram aumento estatisticamente significante, superior a duas vezes, nas taxas de implantação (30-62%, p < 0,001) para mulheres com uma idade média de 38 anos e com história de 1-10 falhas em ciclos de FIV. A taxa de gravidez em curso foi de 78%, bem acima das taxas de gravidez esperadas sem PGS.¹¹

Desde então, vários centros de reprodução assistida no mundo têm usado o método como opção para se diminuírem as falhas em FIV, principalmente naqueles casais com mau prognóstico gestacional.

Diagnóstico genético pré-implantacional

O diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) foi desenvolvido há mais de vinte anos e inicialmente usado para a determinação do sexo em embriões de casais com risco para a transmissão de uma doença recessiva ligada ao X.¹² O procedimento envolve a geração de embriões por FIV, seguido pela biópsia desses e teste do material embrionário.

A biópsia pode ser feita em diferentes estágios de desenvolvimento do embrião: dia 0, com a remoção do primeiro corpo polar (PB) do ovócito maduro; dia 1, com a biópsia do segundo corpo polar do zigoto (o primeiro PB também pode ser obtido nesse momento); dia 3, por meio da remoção de 1-2 células (blastômeros) do embrião em fase de clivagem; ou nos dias 5-6, com a remoção de um pequeno grupo de células do trofoectoderma (células TE) do blastocisto.¹³ O PGD para doenças hereditárias foi feito com sucesso em 1990 e permitiu que casais portadores de uma anomalia genética pudessem ter um filho normal.^12,14

Rasteamento genético pré-implantacional

Sabendo-se que as anormalidades cromossômicas desempenham um importante papel nas falhas de implantação embrionária em tratamentos de FIV, surgiu a hipótese de que o estudo genético dos embriões melhoraria as taxas de implantação. Em 1993, Munné et al. usaram a hibridização fluorescente in situ (Fish) para detectar anormalidades cromossômicas em cinco cromossomos e, assim, fizeram os primeiros casos de rastreamento genético pré-implantacional (PGS).¹⁵

Tais técnicas passaram, então, a ser usadas para o rastreamento genético, com a finalidade de tentar melhorar as taxas de gravidez em certos grupos de pacientes com mau prognóstico nos procedimentos de FIV, como aquelas com idade materna avançada, abortamentos de repetição, repetidas falhas de implantação e fator masculino grave.¹⁶ Desde então, o PGS começou a ser feito com a finalidade de aumentar as taxas de implantação e nascidos vivos, além de reduzir os abortamentos espontâneos em pacientes sem desordem genética conhecida.¹⁷

O PGS oferece aos casais submetidos à FIV uma ferramenta de seleção adicional sobre a simples análise morfológica, visando a escolher o melhor embrião para transferência. A seleção dos embriões sem erros cromossômicos pode melhorar as taxas de sucesso na implantação e reduzir a probabilidade de abortamentos associados a aneuploidias.¹⁸

O PGS foi relatado pela primeira vez em 1995, na análise de corpos polares.^19,20 Desde então, numerosos artigos foram publicados sobre o seu uso. No entanto, como acontece com várias novas tecnologias em reprodução humana, houve pouca evidência de que aumentasse as taxas de gestação. A maioria dos estudos randomizados e não randomizados de PGS foi feita com a biópsia de embriões na fase de clivagem, o que pode ser parte da razão para o seu mau desempenho até agora. Embriões nesse estágio de desenvolvimento mostram níveis elevados de anormalidades cromossômicas e mosaicismo.^19,21 Por isso, a análise de uma única célula do embrião na fase de clivagem pode não representar seu real estado genético.

Além disso, a maioria desses estudos usou a técnica de hibridização in situ fluorescente (Fish), que é capaz de detectar somente metade ou menos do cariótipo humano (de 5 a 12 cromossomos), além do que a eficiência do método é reduzida quando muitos cromossomos são analisados ao mesmo tempo.

Hibridização in situ fluorescente

A hibridização in situ fluorescente foi desenvolvida e aperfeiçoada para uso em amostras com muitas centenas de células para contar, o que permite variações naturais na eficiência da hibridização, sobreposição de sinal e outras questões técnicas a serem levadas em conta sobre toda a análise da amostra. Dessa maneira, mesmo que algumas células apresentem uma contagem anormal em uma sonda por problemas técnicos, a maioria das outras células terá a contagem real, que permite o diagnóstico da amostra.

A Fish não foi projetada para testar um conjunto de amostras de uma única célula. Portanto, as limitações técnicas do teste são amplas e podem levar a resultados falso-positivos e falso-negativos e afetar a capacidade do teste no PGS. Surgiu, então, a necessidade de se avaliar o momento da biópsia, visando à obtenção de um maior número de células e do desenvolvimento de novos métodos capazes de analisar todos os pares de cromossomos.¹³

Hibridização genômica comparativa

A hibridização genômica comparativa (CGH) é uma técnica que faz a ponte entre a genética molecular e a citogenética.⁸ Permite um rastreamento cromossômico abrangente, capaz de determinar com precisão todas as aneuploidias cromossômicas. Combina a amplificação de todo o genoma das células biopsiadas, seguida da marcação fluorescente e hibridização com cromossomos normais numa lâmina de microscópio. Mais recentemente a hibridização genômica comparativa com arrays (array CGH ou aCGH) foi introduzida e proporcionou resultados similares àquela com células em metáfase (mCGH), mas num período de tempo mais rápido.²²

A CGH já foi aplicada com sucesso para o rastreamento genético pré-implantacional (PGS) de corpos polares,^23–25 embriões em estágio de clivagem^10,26 e blastocistos, com resultados clínicos promissores.^27–29 Além da detecção de aneuploidias que afetam os cromossomos inteiros, a CGH também é capaz de identificar ganhos e perdas de segmentos desses e deve, portanto, ser capaz de detectar os desequilíbrios provocados por uma ampla variedade de rearranjos cromossômicos.^7,10,27 Na CGH, o ácido desoxirribonucleico (DNA) da amostra e o de um controle normal são amplificados separadamente, com o uso de uma amplificação genômica completa (WGA). A WGA em células individuais para PGD foi relatada tanto para fins clínicos como para de pesquisa.^30–35

Na mCGH, um software de computador especializado analisa a razão de fluorescência vermelho-verde ao longo do comprimento de cada cromossomo metafásico em cerca de seis conjuntos diferentes em um ideograma. Ganhos em vermelho indicam que a amostra é deficiente na região ou no cromossomo e ganhos em verde que o teste tem cópias extras da região ou do cromossomo. O processo é demorado e tecnicamente desafiador e leva até 72 horas para se fazer o trabalho em bancada de laboratório, mais o tempo adicional necessário para a análise detalhada dos dados.¹³

O aCGH segue o mesmo princípio do mCGH, mas usa um chip de DNA, geralmente cromossomos artificiais bacterianos (BACs) afixados na lâmina do microscópio, e já foi aplicado a uma única célula ou embrião. Cada clone de BAC corresponde a uma parte específica do cromossomo e um software de computador analisa a razão vermelho-verde de fluorescência em cada local que irá corresponder a uma perda ou ganho de região, semelhantemente ao mCGH. A análise é totalmente automatizada e todo o processo pode ser feito em 24 horas, o que permite a transferência dos embriões no mesmo ciclo.¹³

A vantagem principal da CGH em comparação com o método de Fish é que a primeira permite, em um único teste, a detecção de alterações numéricas (aneuploidias) em todos os cromossomos. Além disso, reduz os erros potenciais associados à fixação dos blastômeros. É também um método consistente, que fornece uma informação completa de todos os cromossomos, enquanto a Fish baseia-se no diagnóstico de uma pequena região do DNA.³⁶

Biópsia embrionária

Durante duas décadas a fase de biópsia embrionária predominante tem sido o estágio de clivagem, no qual geralmente um ou por vezes dois blastômeros são biopsiados no terceiro dia de desenvolvimento do embrião.¹³ Os primeiros estudos clínicos sobre PGS em embriões no estágio de clivagem mostraram aumento nas taxas de implantação e de gravidez em curso, bem como diminuição nas taxas de abortamento espontâneo.^37–39 A biópsia do blastocisto geralmente remove entre 5-10 células e consequentemente fornece mais DNA do que a biópsia na fase de clivagem, com 1 a 2 blastômeros.

Já está bem documentado que o embrião na fase de clivagem mostra elevados níveis de mosaicismo cromossômico.^21,40 O mosaicismo cromossômico na pré-implantação do embrião dificulta a acurácia do PGS, pois as células removidas podem não representar a totalidade do embrião. Portanto, a análise de maior número de células torna o diagnóstico mais preciso.⁴¹ Entretanto, estudos recentes indicam que isso também ocorre com blastocistos.²⁷

A cultura de embriões humanos até o estágio de blastocisto é uma inovação que só se tornou costumeira nos últimos anos. Avanços foram feitos na cultura estendida de embriões com o uso de uma combinação sequencial de meios de cultura ultraestáveis com pouco oxigênio específica para cada estágio do embrião.^42,43 Os embriões que se tornam blastocistos in vitro são considerados de melhor qualidade e, geralmente, têm um melhor potencial de implantação. Por essa razão a cultura para a fase de blastocisto é cada vez mais feita nas clínicas de reprodução assistida em todo o mundo. O que se torna cada vez mais evidente, no entanto, é que o cultivo desses embriões até blastocistos não elimina a aneuploidia.

Assim como em oócitos e embriões no estágio de clivagem, até recentemente a Fish foi o método de escolha para a análise citogenética de blastocistos humanos no contexto de pesquisa.^44–48 Dados obtidos com esses estudos têm demonstrado que um grande número de erros cromossômicos persiste até a fase de blastocisto, mas suas taxas tendem a ser mais baixas em comparação com a fase de clivagem do desenvolvimento.^44,48,49

Postula-se que o PGS na fase de blastocisto pode levar a melhores resultados clínicos para casais inférteis porque seriam escolhidos embriões de melhor qualidade.^6,13 Semelhantemente à de corpo polar, a biópsia das células trofoectodérmicas do blastocisto é considerada menos prejudicial para o embrião do que aquela na fase de clivagem. Apesar de serem retiradas cerca de cinco células, a proporção relativa tomada do volume do embrião é menor do que aquela associada à retirada de uma única célula na fase de clivagem. Além disso, a massa de células removidas é destinada a formar a placenta, e não o feto.

Perspectivas do rastreamento genético pré-implantacional

Na reprodução humana as taxas de gravidez e implantação de embriões são inversamente proporcionais à idade materna. Dados de três décadas de estudo sugerem um aumento nos erros de segregação cromossômica na ovogênese em mulheres acima de 35 anos. Assim, o aumento da idade materna aumenta o risco de aneuploidias embrionárias, eleva o risco de abortamentos e diminui as taxas de implantação dos embriões por aberrações cromossômicas incompatíveis com o desenvolvimento e a diferenciação celular.

Outro grupo de mulheres com elevada produção de embriões geneticamente alterados é o daquelas com repetidas falhas em tratamentos de reprodução assistida ou com abortamentos recorrentes. Esses embriões apresentam taxas de aneuploidia em torno de 70% e a taxa habitual é de 30%.²⁵

Atualmente, o uso do PGS em tratamentos de FIV tem sido proposto nos casos de idade materna avançada (AMA), falhas de implantação em repetidos ciclos de FIV anteriores (RIF) e abortamentos recorrentes (RPL).¹⁷ Além disso, o PGS tem sido proposto também para mulheres com gestações trissômicas anteriores⁵⁰ e naquelas que têm parceiros com fator masculino grave.^51–53 Estudos demonstram que a incidência de aneuploidias é alta nos procedimentos de fertilização in vitro, mesmo quando avaliamos mulheres jovens e sem problemas reprodutivos como em casos de ovodoação.⁵⁴ Mais recentemente, na reprodução assistida, têm sido crescentes as tendências de se transferir um único embrião para diminuir as taxas de gestações múltiplas, principal fator de risco em FIV.^55–59

Gestações múltiplas são mais propensas à prematuridade, com um maior risco de baixo peso ao nascer, atrasos de desenvolvimento, paralisia cerebral e malformações congênitas.^60–62 A transferência de múltiplos embriões normalmente é usada para melhorar as taxas de implantação. A transferência de embrião único é o ideal para a prevenção de nascimentos múltiplos. Um embrião de alta qualidade tem mais probabilidade de culminar em uma gravidez em curso e, em última análise, no nascimento de um bebê único e saudável.^63,64

Conclusão

A triagem de aneuploidias para a seleção de embriões já percorreu um longo caminho desde que foi inicialmente proposta como uma forma de melhorar os resultados clínicos em pacientes submetidas a tratamentos de fertilização in vitro. Dados mostram que o uso da hibridização in situ fluorescente para analisar tanto blastômeros como células trofoectodérmicas do blastocisto é dificultado por inúmeros problemas técnicos. Esses podem potencialmente aumentar o risco de erro diagnóstico.

As deficiências nas técnicas iniciais do rastreamento genético pré-implantacional levaram vários grupos de investigação a desenvolver métodos opcionais, citogenéticos e moleculares e examinar todos os pares cromossômicos de células individuais. Esses métodos já foram aperfeiçoados e validados e são cada vez mais usados no ambiente clínico.

Como a biópsia do embrião na fase de clivagem pode acarretar um maior risco de erro diagnóstico por causa do mosaicismo, muitas clínicas de fertilização in vitro têm escolhido fazer a biópsia dos embriões no estágio de blastocisto. Entretanto, ainda não temos evidência científica suficiente para assegurar o benefício da técnica. Estudos randomizados controlados estão em curso nos Estados Unidos e na Europa com o uso da biópsia de blastocisto em combinação com métodos de citogenética molecular abrangentes para o rastreamento genético pré-implantacional.

Esperamos que os resultados obtidos a partir desses estudos possam esclarecer se o PGS realmente faz diferença significante nos resultados clínicos para os casais que necessitam de fertilização in vitro, com o estabelecimento de uma gravidez bem sucedida e, finalmente, o nascimento de um bebê vivo, único e saudável.

Atualmente, o uso do rastreamento para pacientes saudáveis e sem indicações com o propósito de melhorar os resultados de fertilização in vitro está em ascensão. Entretanto, as evidências científicas ainda não são suficientes para recomendar a aplicação clínica da hibridização genômica comparativa em biópsias de embrião no estágio de blastocisto com a finalidade de rastreamento genético pré-implantacional.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.