“Nihil novum sub sole (nada nuevo bajo el sol)”
Eclesiastés
El fenómeno de persistencia no es nuevo. Fue descripto por primera vez en 1944 por Joseph Bigger al comprobar que en cultivos planctónicos de Staphylococcus aureus tratados con penicilina, una pequeña población (1/10 000 a 1/1 000 000) sobrevivía a sucesivos tratamientos2. Sin embargo, el interés por el estudio de esta población persistente tendría un nuevo impulso en la década de los 80, cuando Moyed et al., 1983, las identificaron en cepas de Escherichia coli tratadas con ampicilina. Dado que dichas células estaban presentes entre 10 a 10 000 veces más que en la cepa de E. coli wild type (WT), las llamaron mutantes high persister (hip)7. Estudios posteriores permitieron identificar al primer gen ligado al fenómeno de persistencia, hipA, quien codifica la toxina HipA que, junto con la antitoxina HipB forman un módulo toxina-antitoxina4. Sin embargo, aún no ha sido posible aislar cepas con el gen defectivo hipA incapaces de generar células persistentes (persister cells), indicando la importancia de la regulación de los genes involucrados en este fenómeno.
Actualmente a las células persistentes se las define como una subpoblación menor al 1% de células isogénicas. Muchos microorganismos, incluidas bacterias y levaduras son capaces de producir células persistentes en cultivos planctónicos y en biofilm (biopelículas). La persistencia es un concepto distinto a la resistencia, ya que el/los factor/es genético/s que las hace/n a persistir a altas concentraciones de antimicrobianos son provocados debido a variaciones fisiológicas no heredables a la progenie. Contrariamente, la resistencia es genéticamente estable, dando origen a una población de células completamente resistentes, y siendo necesarias dosis mayores de antimicrobianos para eliminarlas, con el consecuente incremento en la concentración inhibitoria mínima (CIM). En el fenómeno de persistencia, una vez que la presión del antimicrobiano cesa, se genera una población con la misma sensibilidad a la original, siendo variaciones fenotípicas transitorias del tipo WT, es decir, se mantiene mientras exista presión antimicrobiana. Esto significa que las células persistentes son susceptibles al mismo antimicrobiano, con iguales valores de CIM que las células planctónicas originales4,5.
Diversos trabajos de investigación demostraron que el fenómeno de persistencia se manifiesta tanto en la forma de vida planctónica como en el biofilm. La presencia de estas poblaciones persistentes puede ser estudiada, de forma relativamente sencilla, mediante curvas de muerte dosis-dependiente. De esta manera, se observaría una curva de muerte bifásica característica con dos pendientes diferentes. La primera, abrupta, con un pronunciado descenso en el recuento de células viables como consecuencia de la eliminación de las células (planctónicas o sésiles regulares) que son sensibles al antimicrobiano. Posteriormente, se genera una meseta en el recuento de células viables, correspondiente a una subpoblación de células capaces de sobrevivir al antimicrobiano, es decir, las células persistentes. Spoering et al., 2001, evaluaron la presencia de células persistentes en cultivos planctónicos en fase logarítmica, en fase estacionaria y en biofilm de Pseudomonas aeruginosa en presencia de distintos antibióticos. Dichos autores observaron que las células en fase logarítmica eran completamente sensibles, mientras que, tanto en cultivos planctónicos —en fase estacionaria— como el biofilm, contenían una pequeña fracción de células persitentes8.
La relación entre las células persistentes y la recurrencia de las infecciones microbianas crónicas es actualmente motivo de estudio. Según un modelo desarrollado por Lewis, en una infección asociada a biofilm, el tratamiento antimicrobiano podría eliminar la mayoría de las células sésiles (regulares) del biofilm, también las que se desprendan de esta estructura, y el resto podrían ser eliminadas por el sistema inmune. Sin embargo, las células persistentes que permanecen en el interior o en la base, no se verían afectadas, debido al complejo fenómeno multifactorial de resistencia que brinda el biofilm y/o a la imposibilidad del sistema inmune de penetrar en él. Durante el tratamiento, la población microbiana se reduciría enormemente, y junto con ella los síntomas de la infección. Sin embargo, en los casos de infecciones asociadas a biofilm o en pacientes con deficiencias en el sistema inmune esto no ocurriría. En este momento, las células persistentes que sobrevivieron en el interior de la estructura del biofilm proliferarían formándolo nuevamente, y dando lugar a la reaparición de la infección. También se ha podido demostrar que terapias antimicrobianas prolongadas pueden seleccionar cepas con alta tasa de persistencia (mutantes hip), produciendo mayor cantidad de células persistentes, estableciéndose así un vínculo entre el fenómeno de persistencia y las infecciones crónicas altamente recalcitrantes4.
Aunque las células persistentes pueden formarse de manera espontánea como consecuencia de variaciones estocásticas en los niveles de expresión genética de las células4, existe una gran diversidad de disparadores y mecanismos que pueden inducir este estado de persistencia en un microorganismo. Por ejemplo, el shock térmico induce persistencia a aminoglucósidos en Acinetobacter baumannii; la limitación de nutrientes ha sido descripta como un inductor de persistencia en E. coli y en Mycobacterium tuberculosis; la generación de estrés oxidativo y daño en el ADN causado por peróxido de hidrógeno o dosis sub-letales de antibióticos promueven la formación de células persistentes en E. coli y en P. aeruginosa. Moléculas de quorum sensing como el indol y péptidos alarmonas en Streptococcus mutans también han demostrado que pueden actuar como reguladores de la formación de células persistentes. Se ha reportado que en biofilm de algunas especies de Candida y Cryptococcus neoformans, distintas condiciones ambientales, como variaciones en la temperatura y pH, pueden modifican la fracción de células persistentes y por ende la sensibilidad a los antifúngicos9. De esta manera, es evidente que esta formación estaría regulada por diversos factores externos5.
Existen sólidas evidencias que han demostrado que las células persistentes son, en gran parte, responsables de las infecciones microbianas crónicas recurrentes asociadas a biofilm. La eliminación de células persistentes, podría ser el paso clave para la erradicación de los mismos. Varias investigaciones se han realizado para lograr este objetivo; sin embargo, ningún resultado parece ser altamente eficaz. Una de las estrategias sería reactivar las células persistentes de su estado metabólico y tratar posteriormente a las células reactivadas con un antimicrobiano efectivo. La molécula de señalización de ácidos grasos, ácido cis-2-decenoico (cis-DA), puede cambiar el estado metabólico de P. aeruginosa y E. coli. La reactivación de las células persistentes mediada por cis-DA coincidieron con un aumento de la respiración y la síntesis de proteínas bacterianas6.
Recientes investigaciones demostraron que se puede aumentar la susceptibilidad antimicrobiana cuando se exponen a las células persistentes a un agente osmótico. El tratamiento de P. aeruginosa con tobramicina en combinación con manitol aumentó la sensibilidad de las células persistentes a este antibiótico hasta 1000 veces y se pudo revertir el fenotipo persistente como respuesta fisiológica asociada al estrés osmótico1.
Conlon et al., 2013, describieron otra estrategia para la eliminación de las células persistentes en biofilm al utilizar acildepsipéptido (ADEP4) como antibiótico, que activa a una proteasa inespecífica (ClpP) que por lo general causa la muerte de las células en fase exponencial. El tratamiento de biofilm de S. aureus con ClpP elimina a las células persistentes al degradar más de 400 proteínas. Además, combinando ADEP4 con rifampicina se produce la erradicación completa del biofilm de S. aureus en un modelo de infección crónica en ratones3.
Aunque ya lo había propuesto Bigger en 1944, la evidencia acumulada en las últimas décadas señala de manera convincente la importancia de las células persistentes, siendo el “talón de Aquiles” de la terapia antimicrobiana, como un factor clave en la reactivación de las infecciones crónicas asociadas a biofilm y es por eso que su estudio ha cobrado gran interés.
