Este trabajo ha sido financiado por Danone Vitapole (Francia).
Este trabajo ha recibido el premio Pañella Casas 2004 a la mejor comunicación oral del Área Biológica presentada en el XLVI Congreso nacional de la Sociedad Española de Geriatría y Gerontología, celebrado en Las Palmas de Gran Canaria del 9 al 12 de junio de 2004.
INTRODUCCIÓN
El envejecimiento es un proceso progresivo que conlleva el deterioro de las funciones fisiológicas. Hasta el momento, se ha propuesto un elevado número de teorías para explicar los mecanismos que subyacen a este proceso1, pero es la teoría de los radicales libres, propuesta inicialmente por Harman2 en los años cincuenta, la que ha conseguido una mayor aceptación por la gran cantidad de evidencias experimentales aportadas por diferentes autores3,4. Esta teoría se basa en la pérdida de equilibrio entre la tasa de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), que aumenta, y la actividad de los diferentes sistemas antioxidantes, que disminuye, hecho que conduce a una situación de estrés oxidativo en la cual la mitocondria desempeña un papel fundamental3,5. Esta oxidación provoca un deterioro irreversible de las principales macromoléculas de la célula, entre las que se encuentran los lípidos6. Uno de los productos finales de degradación que se forman durante el proceso de peroxidación lipídica es el malondialdehído (MDA), molécula muy ampliamente utilizada como marcador de daño oxidativo a lípidos y de envejecimiento7,8. En los últimos años, se ha llevado a cabo una serie de estudios que han permitido establecer una relación positiva entre la tasa de producción de radicales del oxígeno en la mitocondria y el daño oxidativo a los lípidos, que a su vez depende estrechamente del grado de insaturación de los ácidos grasos de estas macromoléculas. También, por su parte, el grado de insaturación de los ácidos grasos de los lípidos de membrana es capaz de modular el daño oxidativo tanto de los lípidos como el producido a otras macromoléculas9,10. Este estado de estrés oxidativo presente en las células ha sido correlacionado negativamente con la tasa de envejecimiento de las diferentes especies animales y, consecuentemente, con su esperanza de vida9-12. Además, el MDA es capaz de perpetuar el daño oxidativo, ya que puede interaccionar con otras macromoléculas, como las proteínas y el ADN, alterando tanto su estructura como su funcionalidad13. Por tanto, el MDA se forma como consecuencia del daño a lípidos originado por el estrés oxidativo que tiene lugar durante el proceso de envejecimiento, y a la vez es precursor de este tipo de daño a otras macromoléculas de la célula, por lo que la elevación de sus concentraciones es a la vez consecuencia y causa del deterioro celular que se observa con la edad.
La función de las células inmunitarias depende en gran medida del equilibrio entre oxidantes/antioxidantes14-16. Para desempeñar correctamente su función, los leucocitos necesitan producir radicales libres y, consecuentemente, requieren unos valores óptimos de antioxidantes que neutralicen el exceso de compuestos oxidantes, muy reactivos, y que mantengan un ambiente de carácter reductor que les proteja frente al daño oxidativo15. Al envejecer, los leucocitos aumentan la producción de compuestos oxidantes y disminuyen las defensas antioxidantes, y se produce un estado de estrés oxidativo16-18. Además, las células inmunitarias son más susceptibles al daño por el estrés oxidativo que otros tipos celulares, ya que contienen en sus membranas un elevado porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados14, hecho que favorece el proceso de peroxidación lipídica.
Actualmente es aceptado que con el envejecimiento se produce un deterioro de la función del sistema inmunitario18-20, y se ha sugerido que dicho deterioro tiene como base el estrés oxidativo que aparece en las células de este sistema4,16-18 y que es la causa del daño en sus macromoléculas, como se ha comprobado sucede en el ADN nuclear de los leucocitos17. Apoyando esta hipótesis, toda una serie de grupos, incluido el nuestro, han comprobado que la suplementación de la dieta con compuestos antioxidantes mejora la función de las células inmunitarias15,21-23. Concretamente, la ingestión de una dieta suplementada con galletas enriquecidas en cantidades nutricionales de varios antioxidantes mejora la funcionalidad de leucocitos peritoneales de ratones jóvenes con envejecimiento prematuro24.
Sobre la base de lo anteriormente comentado, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la evolución de los valores de MDA durante el envejecimiento en leucocitos peritoneales de ratones, y el efecto que tiene en este marcador de peroxidación lipídica la ingestión, en animales viejos, de una dieta suplementada con galletas enriquecidas en cantidades nutricionales de varios antioxidantes, así como la relación entre la administración de esta dieta con la longevidad de los animales.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales y grupos experimentales
Se emplearon ratones hembra de la cepa ICR (CD 1) (Harlan Ibérica, Barcelona, España) jóvenes (16 ± 2 semanas), adultas (36 ± 2 semanas), maduras (52 ± 2 semanas) y viejas (de 71 ± 2 semanas y a partir de esa edad hasta su muerte). Los animales se estabularon en condiciones de humedad y temperatura constantes (22 ± 2 ºC) y con un ciclo invertido de luz/oscuridad de 12 h. Se alimentaron con una dieta estándar (pienso A04 de Panlab L.S Barcelona, España) y agua del grifo ad libitum. Los animales fueron tratados en todo momento de acuerdo con la normativa indicada por la Directiva Comunitaria 86/6091 EEC.
Los animales viejos fueron divididos aleatoriamente en un grupo control (recibieron un 100% de dieta estándar) y un grupo suplementado con antioxidantes, el cual recibió una dieta constituida en un 80% por pienso estándar y en un 20% por galletas (Danone Vitapole) enriquecidas en cantidades nutricionales con antioxidantes tales como vitamina C, E, betacarotenos, cinc y selenio (tabla 1). La suplementación de la dieta con estos antioxidantes se mantuvo hasta la muerte de los animales, obteniéndose leucocitos peritoneales de estos ratones tras 5 semanas (animales de 18 meses de edad) y 15 semanas (animales de 20 meses de edad) de ingestión de dicha dieta. Se analizó la esperanza de vida de estos ratones que continuaron ingiriendo la dieta suplementada en comparación con los que tomaban dieta estándar.
Valoración del daño oxidativo a los lípidos: concentraciones de malondialdehído
La valoración de MDA se llevó a cabo mediante una técnica basada en el método del ácido tiobarbitúrico (TBA). El MDA tiene la capacidad de reaccionar con el TBA, lo que da lugar a la formación de un compuesto coloreado rosa que tiene un máximo de absorción a 532 nm, el cual se detecta mediante HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) con detector UV. La medida se realizó en alícuotas de 5 x 105 leucocitos peritoneales resuspendidos en Hank's y congelados a 80 ºC hasta el momento de la valoración. Las muestras se lavaron por centrifugación a 5.000 g durante 10 min a 4 ºC, desechado el sobrenadante se añadieron 100 μl de KH2PO4 50 mmol pH 6,8. A continuación se homogeneizaron las células por sonicación, siempre mantenidas en hielo. Una vez sonicadas se añadió al Eppendorf la mezcla de reacción que consistió en 150 μl de H3PO4 (Fluka), 0,44 mol, 50 μl de TBA (Sigma) (6 mg/ml) y 10 μl de hidroxitolueno butilado (BHT) (Sigma) 3 mmol (compuesto que previene la autooxidación de la muestra durante la fase de calentamiento, evitando así la obtención de valores de MDA más elevados). Después se incubaron en un baño a 95 ºC durante 30 min, transcurridos los cuales se paró la reacción con hielo y se añadieron 250 μl de n-butanol (Panreac), centrifugando rápidamente a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ºC. De la fase superior (fase orgánica) se inyectaron 50 μl en el HPLC. Las condiciones de la medición fueron las siguientes: flujo, 0,4 ml/min; fase móvil, 80%; KH2PO4, 50 mmol; pH, 6,8; 20% de metanol; λ, detector UV a 532 nm, Columna Novapack C18 (15 cm x 3,9 mm). Los valores de MDA se expresaron como nmol/106 células.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (DE). En primer lugar se llevó a cabo el análisis estadístico de la evolución de los niveles de MDA durante el envejecimiento, para lo cual se utilizó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA). La evaluación del efecto de la suplementación con antioxidantes se efectuó mediante la prueba de la t de Student. El estudio de la normalidad de las variables se realizó mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Para la obtención de las curvas de longevidad se utilizó el test de Kaplan-Meier, con la base de la prueba de rangos logarítmicos para las comparaciones entre los diferentes grupos. En todos los casos el criterio de mínima diferencia estadísticamente significativa fue p ¾ 0,05.
RESULTADOS
Como se observa en la figura 1 los valores de MDA aumentan progresivamente durante el envejecimiento: desde los jóvenes, que presentan los valores más bajos, hasta los viejos, cuando las cifras de MDA alcanzan los valores más elevados; entre ellos hay diferencias estadísticas muy significativas (p < 0,001). También, en comparación con los valores de adultos, el análisis estadístico revela diferencias significativas tanto en jóvenes como en viejos (p < 0,01).
Figura 1.Evolución de las concentraciones de malondialdehído (MDA) (nmol/106 células) con el envejecimiento en animales jóvenes (J), adultos (A), maduros (M) y viejos (V). Cada punto representa la media ± desviación estándar (DE) de 10 valores correspondientes a 10 animales; cada valor es la media de ensayos realizados por duplicado. **p < 0,01 con respecto del valor de MDA obtenido en los animales adultos. $$$p < 0,001 respecto del valor de MDA obtenido en los animales jóvenes.
En ratones viejos, la ingestión de una dieta suplementada con compuestos antioxidantes, después de 5 o 15 semanas, disminuye significativamente (p < 0,001) los valores de peroxidación lipídica (fig. 2); resulta más efectivo el tiempo mayor de ingesta (p < 0,05).
Figura 2.Valores de malondialdehído (MDA) (nmol/106 células) en ratones viejos tras 5 y 15 semanas de suplementación de la dieta con compuestos antioxidantes. Cada columna representa la media ± desviación estándar (DE) de 10 valores correspondientes a 10 animales, cada valor es la media de ensayos realizados por duplicado. ***p < 0,001 con respecto del valor de MDA obtenido en los animales que han recibido dieta estándar. $p < 0,05 respecto del valor de MDA obtenido tras 5 semanas de dieta suplementada con antioxidantes.
En relación al estudio de la esperanza de vida, el análisis estadístico basado en el test de Kaplan-Meier revela que el grupo suplementado con antioxidantes a partir de la vejez, experimenta un aumento significativo de la longevidad media (p = 0,01) con respecto al grupo control que ingirió únicamente dieta estándar (fig. 3).
Figura 3.Supervivencia de los controles frente a los suplementados. Para obtener las curvas de supervivencia se utilizaron los animales cuya suplementación se inició en la vejez y se mantuvo hasta el momento de la muerte, contabilizando el tiempo de supervivencia en semanas. Prueba de rangos logarítmicos, 0,0102.
Con los datos del presente trabajo y otros obtenidos también en nuestro laboratorio en ratones de la misma cepa suplementados durante 5 semanas con la dieta aquí administrada, se efectuó un análisis de regresión lineal entre los valores de MDA a lo largo de las diferentes edades (fig. 4), para comparar la asociación entre el grado de peroxidación lipídica y el envejecimiento en animales que recibieron dieta estándar o suplementada con varios antioxidantes. Los resultados revelan que en el grupo control existe un alto grado de asociación entre el valor de peroxidación lipídica y la edad de los animales (p < 0,001). Sin embargo, en el grupo cuya dieta fue suplementada con antioxidantes, el grado de asociación ente la edad y los valores de MDA fue bajo (p = 0,018).
Figura 4.Regresión lineal entre las concentraciones de malondialdehído (MDA) (nmol/106 células) y la edad en controles y suplementados. En cada edad están representados los valores de MDA de 10 animales. La ecuación obtenida en el caso de los controles nos indica un elevado grado de asociación entre ambas variables; sin embargo, en el caso de los animales en que se suplementó la dieta con antioxidantes el grado de asociación entre ambas variables es muy bajo. J: jóvenes; A: adultos; M: maduros; V18: viejos (18 meses); V20: viejos (20 meses).
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se ha comprobado que la peroxidación lipídica, valorada por las concentraciones de MDA en leucocitos peritoneales de ratón, aumenta con la edad. Este hecho confirma aportaciones previas que han demostrado que al envejecer el daño oxidativo a macromoléculas tales como el ADN, los lípidos o las proteínas va aumentando debido al estado de estrés oxidativo crónico que se establece con el paso del tiempo25. Es de destacar que en nuestro estudio se han utilizado células inmunitarias obtenidas del peritoneo de los ratones sin necesidad de sacrificar a los animales. De este modo, si bien en trabajos previos ya confirmamos que la valoración del estado funcional de los leucocitos peritoneales era un excelente marcador de esperanza de vida26, y que con la edad aparece un aumento del estrés oxidativo en estas células17, en el presente estudio se ha podido demostrar que la valoración del daño oxidativo a lípidos en leucocitos es un buen marcador de la longevidad que pueden alcanzar los individuos de una especie. Ya otros autores relacionaron los valores de MDA, junto con una mayor producción de radicales de oxígeno por la mitocondria, con la menor esperanza de vida de unas especies en relación con otras9,11. En el presente trabajo, la disminución de las concentraciones de MDA en el grupo suplementado con antioxidantes, en comparación con los valores obtenidos en animales de la misma edad alimentados con dieta estándar (grupo control), se relaciona con una mayor longevidad.
Se debe tener en cuenta que las células inmunitarias tienen una gran tendencia a presentar un elevado grado de estrés oxidativo debido a la gran cantidad de oxidantes que producen para llevar a cabo muchas de sus funciones y al hecho de gastar muy rápidamente, en el desarrollo de sus actividades, las defensas antioxidantes que poseen16,18. Asimismo, son muy sensibles al estrés oxidativo como consecuencia de la composición lipídica de sus membranas14. De hecho, como ha sugerido recientemente nuestro grupo, los leucocitos participan de forma importante en el estado de oxidación del organismo que se produce con el envejecimiento17. Por ello, comprobar que el aumento en el daño peroxidativo de los lípidos de estas células durante la vejez puede ser significativamente disminuido con una dieta enriquecida en antioxidantes, iniciada su administración a una edad avanzada, tiene una gran relevancia, y mucho más demostrar que esa disminución del daño peroxidativo se relaciona con una mayor longevidad de estos animales. Es evidente la repercusión de estos datos en el establecimiento de marcadores de envejecimiento y de estrategias de estilo de vida que permitan retardar los efectos inexorables del paso del tiempo. Además, el MDA no sólo es un buen marcador del envejecimiento y del daño oxidativo a lípidos, también es un compuesto que tiene la capacidad de propagar dicho daño al interaccionar con otras moléculas, modificando tanto su estructura como su funcionalidad13. De este modo, la disminución de sus concentraciones en los leucocitos de los ratones que ingirieron la dieta enriquecida en antioxidantes, y la mayor longevidad de éstos, es una prueba más que confirma la teoría oxidativa del envejecimiento y apoya el hecho de que disminuir el estrés oxidativo en la vejez permite mantener una mejor salud y, consecuentemente, una mayor esperanza de vida media de los individuos.
Centrándonos en la eficacia de dietas ricas en antioxidantes, hay un elevado número de trabajos científicos que demuestran que toda una serie de diferentes compuestos con capacidad antioxidante son efectivos para mejorar la función inmunitaria, muy deteriorada en el envejecimiento21-24. Todos los antioxidantes con los que están enriquecidas las galletas que se incorporan a la dieta administrada en el presente trabajo han demostrado tener efectos positivos en la función inmunitaria, tanto en humanos como en animales de experimentación14,22-24. También, hay algunos trabajos que demuestran que esos antioxidantes pueden disminuir el estado de estrés oxidativo y el daño a macromoléculas como los lípidos. Así, la vitamina C y la vitamina E, en concentraciones moderadas, son necesarias para una protección óptima contra el proceso de peroxidación lipídica en cobayas27 y la suplementación con estas vitaminas también se ha mostrado eficaz en pacientes con lupus eritematoso, quienes presentan un gran estrés oxidativo que desencadena una serie de procesos patológicos asociados con una alta mortalidad28. Además, el efecto protector de estos antioxidantes también se muestra en situaciones de estrés agudo inducido mediante lipopolisacárido bacteriano (LPS), en que los antioxidantes como la vitamina E, el betacaroteno y la N-acetilcisteína fueron capaces de disminuir las concentraciones de los indicadores de estrés oxidativo como el MDA y el contenido en glutatión en cerebro de rata29.
No obstante, una serie de autores han comprobado que puede resultar más eficaz una mezcla de antioxidantes en cantidades apropiadas que cada uno de ellos por separado en cantidades mayores22. De hecho, se ha demostrado una mayor eficacia de estos compuestos cuando se utilizan de manera combinada30. En un trabajo reciente de Actis-Goretta et al31, una suplementación regular con una mezcla de antioxidantes disminuye las concentraciones plasmáticas de MDA ya a los 20 días tras el inicio de la suplementación en humanos sanos. Nuestros resultados demuestran que la ingestión de una dieta enriquecida en una mezcla de cantidades muy bajas de antioxidantes, tanto durante 15 semanas como durante sólo 5 semanas, es efectiva para disminuir los valores de MDA; no obstante, resultó más eficaz el tiempo mayor de suplementación. Por otro lado, el análisis de la asociación entre el grado de peroxidación lipídica y las diferentes edades, en ratones controles y suplementados, reveló que estos últimos prácticamente no experimentaron cambios con el envejecimiento; sus concentraciones de MDA se modificaron sólo ligeramente y permanecieron con valores muy próximos a los encontrados en ratones jóvenes, mientras que, en el grupo que recibió únicamente la dieta estándar, el aumento de las concentraciones de MDA fue mucho más marcado.
En relación con el efecto que puede tener una suplementación con antioxidantes en la esperanza de vida de los individuos, una serie de investigaciones, incluidas las de nuestro grupo, han comprobado un aumento de la longevidad en animales de experimentación32-34. Ese efecto se ha relacionado con la modulación que los antioxidantes son capaces de efectuar en parámetros relacionados con el grado de estrés oxidativo, tanto en diferentes órganos32-34 como en células inmunitarias (datos en vías de publicación).
Todo lo expuesto, así como lo que se deduce de recientes resultados obtenidos en otros trabajos en curso de nuestro laboratorio, sugiere que tomar una dieta que contenga cantidades apropiadas de compuestos con capacidad antioxidante, incluso a una edad avanzada, al controlar el estrés oxidativo, puede ayudar a mantener un mejor estado de salud y, consecuentemente, retardar la tasa de envejecimiento y aumentar la longevidad media de los individuos.
