Con el advenimiento del sida, la histoplasmosis ha aumentado considerablemente y su tratamiento continúa siendo relativamente eficaz, si bien provoca efectos adversos.
ObjetivoEvaluar el efecto inhibitorio del ajoeno sobre Histoplasma capsulatum, en fase micelial, utilizando como medios de cultivo caldo glucosado de Sabouraud y RPMI-1640.
MétodosLas curvas de crecimiento y el efecto inhibitorio del ajoeno (1,25-20μg/ml) se realizaron a temperatura ambiente, en agitación y se registraron turbidimétricamente (540nm) cada 48h, durante 14 días. Se construyeron gráficas para estimar el tiempo de generación (Tg), concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración inhibitoria 50% (CI50). La concentración fungicida mínima (CFM) se determinó por el método de cultivo en placas. Se usaron las pruebas de Mann-Whitney y T-test para evaluar la significación estadística entre los medios de cultivo y los parámetros Tg, CIM, CI50, CFM y efecto fungistático (EF) con un nivel de significación de 0,05.
ResultadosPara los dos medios de cultivo, en todos los aislamientos se obtuvieron curvas de crecimiento con Tg de 43 a 67h, EF a concentraciones de 1,25 y 2,5μg/ml y CFM de 5 y 10μg/ml. Los valores de la CIM, en CSD fueron de 2,5 y 5 y en RPMI, de 1,25 a 5μg/ml. La CI50 en CSD fue de 1,9 a 2,6 y en RPMI, de 3,8 a 4,3μg/ml de ajoeno. No hubo diferencias significativas entre los medios de cultivo para los parámetros estudiados (p>0,05).
ConclusionesLos hallazgos del presente trabajo corroboran que el ajoeno inhibe el desarrollo de H. capsulatum en fase micelial.
The number of histoplasmosis cases have considerably increased since the advent of AIDS, and the therapy for this mycosis is not always effective, as well as having adverse effects.
AimsTo evaluate the inhibitory effect of ajoene on five clinical isolates of Histoplasma capsulatum, on the mycelial form, using Sabouraud dextrose broth (SDB) and RPMI-1640 culture media.
MethodsGrowth curves and inhibitory activity of the drug (at concentrations of 1.25 ug/ml to 20μg/ml) were performed at room temperature, under mechanical agitation, and the turbidimetric readings (540nm) were recorded every 48h for 14 days, in both culture media. Generation times (GT) were calculated and graphs were constructed to estimate Minimal Inhibitory Concentrations (MIC) and Inhibitory Concentration 50% (IC50). The fungicidal minimal concentrations (FMC) were determined by plate cultures. The U-Mann-Whitney and t-test with a significance level of 0.05 were used to evaluate the statistical significance between culture media and GT, MIC, IC50 MFC and fungistatic effect (FE).
ResultsIn both media and for all isolates, growth curves showed a GT of 43 to 67hrs, an FE at 1.25-2.5μg/ml, and a MFC at 5-10μg/ml of ajoene. Values of MIC were 2.5-5 in SDB and in RPMI medium these values were 1.25-5μg/ml of ajoene. For IC50, in SDB, the values were 1.9-2.6 ug/ml and in RPMI medium, they were of 3.8-4.3μg/ml of ajoene. There were no significance differences between culture media for GT, FE, MIC, IC50 and MFC (p>0.05).
ConclusionsThese findings corroborate that ajoene inhibits the growth of the mycelial form of H. capsulatum.
El ajoeno [(E, Z) 4,5,9-tritiadodeca-1,6,11-trieno-9-oxido] es un compuesto organosulfurado derivado del ajo, del que se ha demostrado, sistemáticamente, su potencial actividad inhibitoria in vitro e in vivo sobre la mayoría de los hongos causantes de micosis humanas4,6,9-12,14,15,19,20,27,29-33,37,25,26,35. Este compuesto actúa selectivamente sobre la membrana plasmática inhibiendo la síntesis de fosfatidilcolina, con acumulación de fosfatidiletanolamina y, en consecuencia, provocando la muerte celular28,34. La histoplasmosis, micosis sistémica endémica con predilección por el sistema macrofágico mononuclear y causada por el hongo dimorfo Histoplasma capsulatum var. capsulatum, fue descrita en 1985 como una enfermedad indicadora de sida2,18. Con el advenimiento de este síndrome, su frecuencia se ha incrementado considerablemente convirtiéndose en la micosis respiratoria más frecuente del mundo y la tercera en pacientes con sida2,16,22,24. En Venezuela, esta entidad ocupa el primer lugar entre las micosis profundas7,23.
La terapia para esta micosis es relativamente eficaz, si bien es muy costosa y provoca efectos adversos indeseables5,8,13,17,36, por lo que, la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas es una prioridad. En estudios previos se informó, por primera vez, acerca de la actividad antifúngica del ajoeno sobre un aislamiento de H. capsulatum, en fase micelial, utilizando medios de cultivo líquidos y sólidos y diferentes metodologías25,33. Con el fin de corroborar estos hallazgos, en el presente estudio se evaluó el efecto inhibitorio del ajoeno sobre cinco aislamientos clínicos de H. capsulatum, en fase micelial, empleando los medios de cultivo líquidos Sabouraud dextrosa (CSD) y RPMI-1640.
Material y métodosSe utilizaron cinco aislamientos clínicos de H. capsulatum provenientes de sangre periférica y médula ósea, de pacientes inmunocomprometidos, del Hospital Universitario de Caracas. Estos aislamientos se identificaron siguiendo la metodología convencional, según las características macro y microscópicas de los cultivos, y se mantuvieron en medio Mycosel, a temperatura ambiente hasta el momento del ensayo.
Los medios de cultivo usados fueron CSD (Oxoid) y RPMI-1640 (Sigma) tamponado con ácido-3-N-morfolinopropanosulfónico (MOPS) 0,165mol.L-1 y suplementado con glucosa al 2%21,25.
Para preparar los inóculos fúngicos se siguió el procedimiento descrito previamente25,26. El ajoeno fue donado por el Dr. Rafael Apitz-Castro (patente N.° 4665088. Mayo 1987)1,3. Se preparó una solución madre de 8mg.ml-1, en dimetilsulfóxido (DMSO), a partir de la cual se obtuvieron soluciones de trabajo de 1,25, 2,5, 5, 10 y 20μg/ml en un volumen de 10ml25. Como control de crecimiento, para cada aislamiento y medio de cultivo, se utilizó un erlenmeyer que contenía el medio de cultivo y el inóculo sin ajoeno y otro que contenía DMSO y el inóculo.
Los cultivos se incubaron durante 14 días a temperatura ambiente y, en agitación mecánica constante (80rpm). Las curvas de crecimiento fúngico y la actividad inhibitoria del ajoeno se registraron mediante lecturas turbidimétricas (540nm) cada 48h. Se calculó el tiempo de generación (Tg) de los cultivos, sin ajoeno, representando la densidad óptica (DO) sobre una escala semilogarítmica en función del tiempo, y entendiéndose como Tg el tiempo en el cual la DO es 2DO°. La concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración inhibitoria 50% (CI50) se calcularon representando las DO en función de las concentraciones de ajoeno25; se consideró efecto fungistático la inhibición del crecimiento fúngico durante los primeros días de incubación, en comparación con el control, y la determinación de la concentración fungicida mínima (CFM) se realizó cinco días después de la culminación del ensayo, a partir de la CMI, según la técnica de subcultivos en placas, y se consideró como la menor concentración de ajoeno que produjo subcultivos negativos o el crecimiento de únicamente dos a tres colonias, en comparación con el control de crecimiento30. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
Análisis estadísticoPara comprobar si existían diferencias significativas entre los cinco aislamientos con respecto a los parámetros Tg, CMI, CFM, CI50 y efecto fungistático (EF) se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis, y para evaluar si existía diferencia significativa entre los medios CSD y RPMI con relación a las variables usadas, se aplicó la prueba U de Mann-Whitney. Ambas pruebas se aplicaron con un nivel de significación de 0,05.
ResultadosCurvas de crecimiento y tiempos de generaciónEn los aislamientos estudiados, se observó que la fase exponencial comenzó entre los tres y siete días, con tiempos de generación de 43 a 67h, en ambos medios de cultivo (fig. 1 y tabla 1).
Parámetros obtenidos en el estudio de la sensibilidad de H. capsulatum al ajoeno
| Aislamientos | Tg (h) | EF (μg/ml) | CI50 (μg/ml) | CFM (μg/ml) | ||||
| SDA | RPMI | SDA | RPMI | SDA | RPMI | SDA | RPMI | |
| Hc1 | 48 | 48 | 2,5 | 1,25 | 2,0 | 3,8 | 5 | 10 |
| Hc2 | 48 | 43,2 | 2,5 | 2,5 | 2,6 | 3,9 | 10 | 10 |
| Hc3 | 48 | 67,2 | 1,25 | 0,0 | 1,9 | 4,3 | 5 | 5 |
| Hc4 | 48 | 50,4 | 2,5 | 2,5 | 2,3 | 3,8 | 5 | 10 |
| Hc5 | 55,2 | 43,2 | 2,5 | 2,5 | 2,3 | 3,8 | 5 | 10 |
CFM: concentración fungicida mínima; CI50: concentración inhibitoria 50%; EF: efecto fungistático; Tg: tiempo de generación.
En CSD hubo inhibición del crecimiento de los aislamientos Hc1, Hc2, Hc4 y Hc5 a partir de concentraciones de ajoeno de 5μg/ml, mostrando un efecto fungistático cuando se usaron 2,5μg/ml del compuesto. Las concentraciones de ajoeno ≥ 2,5μg/ml frenaron totalmente el crecimiento del aislamiento Hc3, revelando un efecto fungistático con 1,25μg/ml (fig. 1A y tabla 1). Los valores de la CMI fueron de 2,5 y 5μg/ml y de la CI50 de 1,9 a 2,6. La CFM fue de 5 y 10μg/ml de ajoeno (tabla 1).
En RPMI, las concentraciones de ajoeno ≥ 5μg/ml bloquearon el crecimiento de los aislamientos Hc2, Hc4 y Hc5. Para los aislamientos Hc1 y Hc3 la inhibición se observó con 2,5 y 1,25μg/ml de ajoeno, respectivamente. En los aislamientos Hc2, Hc4 y Hc5 hubo efecto fungistático con 2,5μg/ml de ajoeno; en el Hc1 este se observó con 1,25μg/ml y en el Hc3 este efecto no se evidenció.
Los valores de la CMI fueron de 1,25 a 5μg/ml, los de la CI50 de 3,8 a 4,3 y los de las CFM, de 5 y 10μg/ml (fig. 1B y tabla 1).
El diluyente utilizado (DMSO) no ejerció ningún efecto sobre el crecimiento fúngico.
Análisis estadísticoNo hubo diferencias significativas al analizar cada uno de los aislamientos con respecto al Tg, EF, CMI, CI50 y CFM ni al comparar ambos medios de cultivo (p>0,05).
DiscusiónEn un reporte previo se informó acerca del efecto inhibitorio del ajoeno sobre un aislamiento clínico de H. capsulatum en fase micelial. En base a los resultados que presenta dicho estudio, y conscientes de la necesidad de disponer de nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de la histoplasmosis, el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad inhibitoria del ajoeno en cinco aislamientos clínicos de H. capsulatum, en fase micelial, utilizando dos medios de cultivo.
Con relación a las curvas de crecimiento, los Tg obtenidos en ambos medios de cultivo fueron consistentes con los informados previamente25.
El efecto inhibitorio del ajoeno fue dosis dependiente, mostrando un EF y valores de CMI y de CI50 similares a los observados por Romero et al., al utilizar un solo aislamiento clínico de H. capsulatum25, datos que además coinciden con los obtenidos previamente empleando otras metodologías en hongos como Cryptococcus neoformans, Microsporum canis, Cladophialophora carrionii, Fonsecaea pedrosoi, Scedosporium prolificans y diferentes especies de Candida4,14,19,26,29,30,33,35. Es interesante resaltar que los valores de las CMI fueron considerablemente menores que los obtenidos en otros estudios con Aspergillus niger, Alternaria spp., Fusarium spp., Curvularia spp. y la fase filamentosa de Paracoccidioides brasiliensis y de Coccidioides immitis27,29,31. El ajoeno igualmente reveló actividad fungicida (CFM) con valores muy inferiores a los reportados previamente en ensayos con Alternaria spp., Fusarium spp., Curvularia spp., C. immitis, C. carrionii y F. pedrosoi29,30,31.
Los datos aquí recogidos indican que con los medios de cultivo utilizados los resultados fueron similares, puesto que todos los aislamientos presentaron la misma respuesta en relación a los parámetros Tg, EF, CMI, CI50 y CFM, en ambos medios de cultivo (p>0,05), por lo cual, el CSD podría ser una alternativa para ser usado en ensayos con hongos filamentosos en aquellos laboratorios de escasos recursos, puesto que éste es de menor coste que el RPMI-1640. Por otra parte, se comprueba que el diluente utilizado (DMSO) no ejerció ningún efecto sobre el crecimiento fúngico.
Los resultados que arroja la presente investigación confirman que el ajoeno posee actividad inhibitoria in vitro sobre H. capsulatum, en fase micelial.
FinanciaciónEste trabajo se financió por parte del proyecto CDCH-UCV N.° 09-00-7119-2008.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Los autores desean expresar su gratitud a aquellos que de una u otra manera contribuyeron en la realización de este trabajo: al Dr. Axel Santiago, Laboratorio de Micología del Hospital Universitario de Caracas; al Dr. Rafael Apitz-Castro, Laboratorio de Trombosis Experimental-IVIC; a la Profesora Rosaria Ruggiero y al Sr. Pablo Rojas, de la Escuela de Bioanálisis, UCV.
