Los dermatofitos son un grupo de hongos queratinolíticos que producen infecciones denominadas dermatofitosis o tiñas. En Chile, los dermatofitos aislados con mayor frecuencia son Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes en la población adulta, y Microsporum canis en niños prepúberes. Para el tratamiento de estas micosis se emplean antifúngicos tópicos y orales como la griseofulvina, antifúngicos azólicos como el clotrimazol, el itraconazol o el fluconazol, alilaminas como la terbinafina, y nuevas moléculas antifúngicas.
ObjetivosEvaluar la sensibilidad in vitro de los dermatofitos frente a cinco antifúngicos y establecer posibles cambios respecto a estudios anteriores.
MétodosSe estudiaron 62 dermatofitos obtenidos de muestras clínicas (marzo-junio de 2010). Se utilizó el método de microdilución en caldo (M38-A2).
ResultadosEl rango de CMI para el fluconazol fue de 0,25-1μg/ml; 0,03-0,06μg/ml para el clotrimazol, la terbinafina y el itraconazol, y 0,015-0,03μg/ml para la griseofulvina frente a T. rubrum y T. mentagrophytes. Excepto para le fluconazol, no se encontraron diferencias estadísticas significativas en los rangos de sensibilidad antifúngica.
ConclusionesLos valores de CMI para el fluconazol fueron los más altos (0,25-1μg/ml) de todas las sustancias ensayadas, habiendo diferencias estadísticamente significativas entre este y el resto de antifúngicos. No hubo cepas resistentes a los antifúngicos analizados, y tampoco se encontraron cambios en el perfil de sensibilidad antifúngica in vitro en relación con estudios anteriores realizados en Chile.
Dermatophytes are a group of keratinophilic fungi able to produce dermatophytosis or tinea infections. In Chile, Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes are the ones most commonly isolated in adults, while Microsporum canis is found among children. Treatment of these infections is usually with topical or oral antifungals, such as griseofulvin or azole derivatives (clotrimazole, itraconazole, fluconazole), allylamines (terbinafine) or new drugs that are available.
AimsEvaluation of the in vitro susceptibility of dermatophytes to five antifungal agents and the comparison of the susceptibility pattern with that of previous years.
MethodsSixty-two clinical isolates of dermatophyte fungi were studied (March-June 2010). The CLSI M38-A2 micromethod was used.
ResultsFluconazole MIC values for T. rubrum and T. mentagrophytes varied between 0.25 and 1μg/ml; MIC range to clotrimazole, terbinafine and itraconazole was 0.03-0.06μg/ml, and MIC values for griseofulvin were 0.015-0.03μg/ml. No statistically significant differences were found between susceptibility patterns, except for fluconazole.
ConclusionsFluconazole was less active in comparison with other drugs tested (0.25-1μg/ml). None of the isolates were resistant to any of the drugs, and no changes in the susceptibility pattern were observed when comparing the results with data previously reported concerning dermatophytes in Chile.
Los dermatofitos son un grupo de hongos hialinos, filamentosos, septados y queratinolíticos, capaces de producir infecciones en la piel, el pelo y las uñas, tanto del ser humano como de los animales8,24,29,32,37. No es un término con un valor taxonómico, sino que engloba géneros diferentes que son capaces de explotar la queratina presente en distintos seres vivos como sustrato nutritivo energético y producir infecciones8,34,37. Las dermatofitosis, producidas por estos hongos y comúnmente llamadas tiñas, suelen estar restringidas al estrato córneo de la piel y sus apéndices, aunque también pueden afectar la dermis y el tejido subcutáneo, causando granulomas o seudomicetomas14,34,36. Con relativa frecuencia, estas micosis afectan el tejido no queratinizado en pacientes con o sin desórdenes inmunológicos13,31,34,35.
En Chile, los hongos dermatofitos aislados con mayor frecuencia son tradicionalmente Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Microsporum canis, si bien existe una clara disposición en función de la edad de los pacientes3,17,18,27,28,38.
La evaluación del perfil de sensibilidad de una determinada especie de hongo dermatofito a un agente antifúngico determinado permite al clínico seleccionar los fármacos adecuados, evitando fracasos y terapias inoperantes, a pesar de que no se recomiendan como pruebas de rutina en el laboratorio19. Además, la resistencia generada por los hongos ante los fármacos antifúngicos puede ser una de las diversas causas involucradas en el fracaso terapéutico, pero no la única que puede explicar este en el tratamiento de las dermatofitosis16,30.
El propósito de este estudio descriptivo fue determinar la actividad in vitro de cinco antifúngicos de uso habitual en el tratamiento de este tipo de micosis frente a distintas especies de dermatofitos, aisladas de pacientes entre marzo y junio de 2010, para evaluar la existencia de variaciones en el tiempo con respecto a los valores publicados en nuestro país en estudios anteriores (tabla 1)3,17–19,23,27,28,38.
Rangos de concentración mínima inhibitoria de las especies más comunes de dermatofitos encontradas en Chile
| Especies | Fluconazol | Itraconazol | Clotrimazol | Terbinafina | Griseofulvina |
|---|---|---|---|---|---|
| Trichophtyton rubrum | 0,5-1 | 0,03-0,06 | 0,03-0,06 | 0,03-0,06 | 0,03-0,06 |
| Trichophyton mentagrophytes | 0,125-0,5 | 0,03-0,06 | 0,03-0,06 | 0,03-0,06 | 0,03-0,06 |
| Microsporum canis | 1-32 | 0,125-0,25 | 0,03-0,125 | 0,03-0,06 | 0,03-0,125 |
Se utilizaron 62 aislamientos de hongos dermatofitos obtenidos a partir de muestras clínicas de pacientes atendidos entre marzo y junio de 2010 en el Servicio de Dermatología del Hospital Clínico de la Universidad de Chile, J. J. Aguirre (Santiago de Chile). Los aislamientos fueron identificados por métodos morfológicos y bioquímicos en el Laboratorio de Micología antes de ser utilizados para el estudio de la sensibilidad in vitro a los antifúngicos.
Para la obtención de los inóculos, todos los aislamientos fueron subcultivados en medio agar avena (para T. rubrum) y agar patata-dextrosa durante siete días a 28°C. Las colonias obtenidas se cubrieron con 1-2ml de agua destilada, raspando la superficie con la punta de una pipeta Pasteur estéril para obtener suspensiones del micelio aéreo de las colonias. La mezcla así obtenida de conidias e hifas se transfirió a un tubo de ensayo estéril para permitir la precipitación, durante 20min, de las partículas más pesadas. El sobrenadante se transfirió a otro tubo estéril y se agitó en vórtex (15seg). La suspensión obtenida se ajustó espectrofotométricamente (80-82% de transmitancia) antes de realizar las diluciones en medio de cultivo RPMI 1640 hasta obtener una concentración del inóculo de 0,5-2,5×103UFC/ml.
La sensibilidad in vitro a los antifúngicos se determinó por el método de microdilución en caldo (M38-A), según lo recomendado por el Clinical and Laboratory Standards Institute. Se emplearon los siguientes antifúngicos: fluconazol (Pfizer, S. A.), terbinafina (Novartis AG), griseofulvina, itraconazol y clotrimazol (Laboratorio Chile). Se prepararon soluciones madre de cada antifúngico con una concentración cien veces mayor a aquella más alta a probar en dimetilsulfóxido al 100%, excepto fluconazol, que fue disuelto en agua destilada estéril. Las soluciones fueron conservadas a −70°C hasta el día de inoculación de las placas.
A partir de las soluciones madre de cada antifúngico se preparó la serie de diluciones a una concentración 10 veces superior a la final usando como diluyente RPMI 1640 (Gibco BRL) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio, suplementado con glucosa al 2% y tamponado a pH 7 con 0,165M de ácido morfolinopropano sulfónico. Con estas diluciones se realizó una nueva dilución 1:50 en RPMI 1640. Estas soluciones fueron para cargar las microplacas y obtener las siguientes concentraciones finales para cada antifúngico: 0,125-64μg/ml para fluconazol; 0,03-16μg/ml para terbinafina; 0,03-8μg/ml para griseofulvina y clotrimazol, y 0,015-8μg/ml para itraconazol10,16,23,24,34.
La prueba de microdilución en caldo se realizó en microplacas estériles de 96 pocillos con fondo plano. En la columna 1 se agregaron 200μl de medio de cultivo RPMI 1640 como control de esterilidad, de la columna 2 a la 11 se añadieron 100μl del inóculo y 100μl del antifúngico en diluciones seriadas (concentraciones divididas en potencias de dos comenzando por el valor más alto). La columna 12 se llenó con 100μl del inóculo y 100μl del diluyente (control de crecimiento). En cada prueba se incluyeron cepas de control de calidad Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 625815. Las microplacas se incubaron en atmósfera húmeda a 35°C durante cinco días, siendo revisadas cada 24h desde su inoculación.
La actividad antifúngica se determinó mediante las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI), definidas como aquellas concentraciones capaces de inhibir el desarrollo del hongo en un 80% en comparación con el crecimiento obtenido en el pocillo de control, con inóculo y sin antifúngico15. También se calcularon las concentraciones inhibitorias parciales CMI50 y CMI90, que corresponden a aquellas concentraciones de antifúngico capaces de inhibir el desarrollo del inóculo en un 50 y un 90%, respectivamente, en comparación con los controles de crecimiento. La comparación estadística de los grupos se hizo utilizando el test de Student (p<0,05).
ResultadosDe los 62 aislamientos evaluados, 37 (59,68%) correspondieron a dermatofitos aislados de mujeres, de los que 22 eran T. rubrum y 15 T. mentagrophytes, mientras que los 25 restantes (40,32%) lo fueron de varones (14 T. rubrum y 11 T. mentagrophytes). No existieron diferencias estadísticamente significativas en la distribución de especies según el sexo de los pacientes. El 95,24% (n=59) correspondió a aislamientos obtenidos de uñas y espacio interdigital del pie, con diagnóstico de tinea unguium en el paciente. Solo el 4,76% (n=3) de los aislamientos fueron aislados de pacientes diagnosticados de tinea pedis.
Las cepas ATCC que se incluyeron como control de calidad según el protocolo del Clinical and Laboratory Standards Institute15 presentaron unos valores de CMI a fluconazol y a itraconazol dentro de los límites establecidos en este documento. La sensibilidad de los aislamientos de este estudio a los antifúngicos ensayados se expone en la tabla 2 como los rangos de CMI obtenidos, así como los valores de las concentraciones parciales (CMI50 y CMI90). Ese rango de concentraciones obtenido para el fluconazol (0,25-1μg/ml) fue más alto que el del clotrimazol, la terbinafina y el itraconazol (0,03-0,06μg/ml), o el de la griseofulvina (0,015-0,03μg/ml) frente a los aislamientos de T. rubrum y T. mentagrophytes.
Rangos de concentración mínima inhibitoria y concentraciones mínimas inhibitorias parciales de 62 aislamientos de Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes testados frente a diversos antifúngicos
| Fluconazol | Itraconazol | Clotrimazol | Terbinafina | Griseofulvina | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CMI50 | CMI90 | Rango | CMI50 | CMI90 | Rango | CMI50 | CMI90 | Rango | CMI50 | CMI90 | Rango | CMI50 | CMI90 | Rango | |
| T. rubrum (n=36) | 0,25 | 0,5 | 0,25-1 | <0,015 | 0,03 | 0,03-0,06 | <0,03 | 0,06 | 0,03-0,06 | <0,03 | >0,03 | 0,015-0,03 | <0,03 | 0,06 | 0,03-0,06 |
| T. mentagrophytes (n=26) | 0,25 | 0,25 | 0,25-0,5 | <0,015 | <0,015 | 0,03-0,06 | <0,03 | <0,03 | 0,03-0,06 | <0,03 | <0,03 | 0,015-0,03 | <0,03 | 0,06 | 0,03-0,06 |
| Total (n=62) | 0,25 | 0,5 | 0,25-1 | <0,015 | <0,015 | 0,03-0,06 | <0,03 | <0,03 | 0,03-0,06 | <0,03 | <0,03 | 0,03-0,06 | <0,03 | 0,06 | 0,03-0,06 |
CMI: concentración mínima inhibitoria.
Valores expresados en μg/ml.
Solo se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el fluconazol y el resto de antifúngicos ensayados. De todos los antifúngicos analizados, el fluconazol fue el menos activo frente a T. rubrum (CMI50 0,25μg/ml; CMI90 0,5μg/ml); la CMI50 y la CMI90 fueron de 0,25μg/ml para T. mentagrophytes (tabla 2). En cambio, las concentraciones inhibitorias parciales frente al itraconazol (CMI50<0,015μg/ml; CMI90 0,03μg/ml) para T. rubrum fueron similares a las obtenidas para T. mentagrophytes (CMI50 y CMI90 <0,015μg/ml) (tabla 1). Los valores de actividad del clotrimazol frente a T. rubrum (CMI50<0,03μg/ml; CMI90 0,06μg/ml) fueron similares a los obtenidos para T. mentagrophytes (CMI50 y CMI90<0,03μg/ml) (tabla 2). La actividad de la terbinafina coincidió en ambas especies (CMI50 y CMI90<0,03μg/ml), del mismo modo que con la griseofulvina (CMI50<0,03μg/ml; CMI90 0,06μg/ml) (tabla 2).
DiscusiónLa mayoría de las infecciones causadas por hongos dermatofitos pueden ser combatidas con antifúngicos de uso tópico, a pesar de que existan casos que pueden requerir un tratamiento sistémico11,16. A pesar de que la determinación de la sensibilidad in vitro a los antifúngicos de los hongos dermatofitos no se recomienda de forma rutinaria, y hasta hace poco tiempo no se disponía de un método estandarizado, este tipo de pruebas indican que el perfil de actividad antifúngica de los distintos fármacos no es el mismo en todos los casos11,21,22. Por ello, la determinación de la sensibilidad in vitro utilizando un método de referencia puede ser de ayuda para predecir la efectividad de un antifúngico en el tratamiento de las dermatofitosis, algo demostrado en numerosas publicaciones20,25. Por otro lado, a pesar de disponer en la actualidad de métodos de referencia, los valores de corte de la griseofulvina, el clotrimazol y la terbinafina no han sido establecidos hasta la fecha, por lo que no se dispone de criterios que indiquen que un aislamiento es sensible o resistente a estas sustancias. Sí se habían propuesto los puntos de corte para el fluconazol y el itraconazol15, siendo sensibles los aislamientos con valores CMI inferiores a 8μg/ml y 0,125μg/ml, respectivamente. La resistencia se situaba en valores superiores a 64μg/ml y 1μg/ml, también respectivamente, considerando los aislamientos con valores CMI intermedios a los citados sensibles dependientes de la dosis. En nuestro estudio todos los aislamientos estudiados fueron sensibles a fluconazol e itraconazol aplicando este criterio de interpretación.
Los antifúngicos incluidos en este estudio correspondieron a los ensayados en períodos de tiempo anteriores para disponer de una mejor comparación a la hora de valorar los cambios en los perfiles de sensibilidad de las especias estudiadas19. Los valores de CMI obtenidos en este estudio para los azoles, 0,25-1μg/ml para fluconazol y 0,03-0,06μg/ml para itraconazol, son inferiores a los descritos por Araújo et al. en Brasil, cuyos valores oscilaron con el fluconazol entre 2 y 32μg/ml para T. rubrum, y entre 4 y 16μg/ml para T. mentagrophytes. Con itraconazol, el intervalo de CMI fue de 0,03-4μg/ml para T. rubrum, y de 0,03 a 0,25μg/ml para T. mentagrophytes1. Igualmente, los valores publicados por Siqueira et al. indicaron una actividad inferior de fluconazol (0,125-8μg/ml para T. rubrum, y 0,5-16μg/ml para T. mentagrophytes)33. Nuestros resultados pueden situarse en el mismo rango de actividad que los de Sarifakioglu et al. para estas sustancias, y los de otros trabajos en los que se descartó la existencia de patrones de sensibilidad distintos según el grupo ecológico de los dermatofitos10,30. Estos valores coinciden con los obtenidos con aislamientos procedentes de otras áreas geográficas para terbinafina e itraconazol (0,03μg/ml)10. Sin embargo, al compararlos con los resultados de los aislamientos de otras muestras patológicas distintas, la CMI90 de nuestros aislamientos para terbinafina fue una dilución más baja, y el rango de CMI, mucho más estrecho5,7. Asimismo, los rangos de actividad in vitro para terbinafina (0,03-0,06μg/ml) obtenidos en el presente estudio para las dos especies también fueron más bajos respecto a los de Cetinkaya et al., que describieron valores de 0,03-4μg/ml para T. rubrum y de 0,03-1μg/ml para T. mentagrophytes, o los de Arzeni et al., con un número inferior de aislamientos de T. mentagrophytes2,12.
Todos los aislamientos estudiados fueron sensibles a todos los azoles incluidos en el estudio (fluconazol, itraconazol y clotrimazol), pero también a griseofulvina y terbinafina, a pesar de no disponer de valores de puntos de corte de CMI, ya que las CMI obtenidas están muy por debajo de los valores en los que estas sustancias se acumulan en la piel. Si se compara con los resultados obtenidos por medio de un método de difusión en agar, la sensibilidad de estos aislamientos fue notablemente superior a la procedente de otras áreas geográficas, cuyas tasas de resistencia fueron del 48,8% para fluconazol, 3,6% para clotrimazol, 20% para itraconazol y 4% para terbinafina6. También se han descrito aislamientos con una baja sensibilidad a fluconazol por medio de métodos de microdilución4,9.
Respecto a los valores publicados por otros autores en la misma área geográfica con anterioridad, no se observaron variaciones a lo largo del tiempo en los rangos de CMI de las especies de dermatofitos más frecuentes en Chile para estos cinco antifúngicos de uso común en clínica. Sin embargo, los datos obtenidos mostraron rangos de CMI inferiores en su límite superior a los anteriores utilizando el mismo método, pero con un número en este caso inferior de aislamientos estudiados19. Los actuales indican una CMI90 inferior para el fluconazol, el itraconazol, el clotrimazol y la terbinafina, mientras que el valor para la griseofulvina fue similar19. Mock et al. habían descrito una elevación de las CMI frente a los dermatofitos en países desarrollados, lo que explicaría una disminución de la sensibilidad como consecuencia de la exposición a los antifúngicos, no demostrada en nuestro entorno26. La diferencia entre esos valores elevados y los obtenidos en este estudio podría estar relacionada más con factores metodológicos que con una disminución de la sensibilidad, ya que dicho estudio utilizó una técnica de dilución en agar con un largo período de incubación (necesario para el crecimiento de los hongos dermatofitos) que podría haber alterado la difusibilidad de los antifúngicos. No obstante, la actividad del fluconazol, el itraconazol, el clotrimazol, la terbinafina y la griseofulvina es muy elevada frente a los aislamientos ensayados, si bien no se observa una variación respecto a los patrones de actividad en el mismo entorno en períodos de tiempo anteriores, a pesar de que sí se constata alguna diferencia con respecto a los valores de otras áreas geográficas.
En nuestro país, los antifúngicos utilizados para el tratamiento de las dermatofitosis se presentan como lacas (ciclopiroxolamina y amorolfina), cremas (azoles) y otras presentaciones de uso sistémico (terbinafina, fluconazol, itraconazol y griseofulvina). Los estudios nacionales citados en este trabajo describen una buena actividad antifúngica in vitro frente a los dermatofitos, lo que evidencia una buena eficacia in vivo, pero no hay estudios clínicos que hayan corroborado esto. El fluconazol oral está indicado en el tratamiento de las dermatofitosis (tinea cruris, tinea corporis, tinea pedis y onicomicosis), en aquellos casos en que haya habido fracaso terapéutico a otros antifúngicos, o si hay mala tolerancia por parte del paciente. Fich et al. evaluaron una serie de nueve pacientes y solo uno de ellos mostró una curación clínica a los 3 meses del inicio tratamiento23. Las tasas de curación del fluconazol son inferiores a las de la terbinafina. Por tanto, para algunos clínicos, la terbinafina es el tratamiento de elección de las dermatofitosis, especialmente las onicomicosis, a pesar de que en la literatura extranjera el fluconazol sigue describiéndose como un buen antifúngico. Se requieren estudios clínicos bien diseñados que permitan que el clínico pueda seleccionar los mejores antifúngicos disponibles.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
