Introducción: Los micro-ARN (mi-ARN) son moléculas de 22-24 nucleótidos implicadas en la regulación de la expresión génica de numerosos procesos. Recientemente, se han identificado perfiles alterados de expresión de mi-ARN en diferentes casos de infertilidad idiopática, sugiriendo un papel relevante de estas moléculas en la regulación de la fertilidad.
Objetivo: Caracterizar los patrones de expresión de 4 mi-ARN en ácido ribonucleico espermático procedente de individuos fértiles e infértiles.
Material y métodos: Se obtuvo la fracción espermática de 4 muestras de semen de individuos fértiles y 4 muestras de individuos que consultaban por infertilidad. Se aisló el ácido ribonucleico utilizando el método TRIzol® y seguidamente se efectuó un tratamiento con DNasa. La ausencia de ácido desoxirribonucleico en las muestras extraídas se confirmó mediante una reacción en cadena de la polimerasa para el gen de la protamina 1. Seguidamente, con cebadores específicos para los mi-ARN hsa-miR-23a, hsa-miR-744, hsa-let-7f y hsa-miR-1, y el normalizador Mamm-U6, se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa a tiempo real mediante tecnología TaqMan. La cuantificación de las diferencias de expresión se realizó mediante el cálculo del estadístico Fold Change y la utilización de un intervalo de confianza del 95%.
Resultados: Para cada individuo, se obtuvo una media de 2,6 × 10-5ng de ácido ribonucleico/espermatozoide con una pureza de 1,72 (± 0,05) y sin trazas de ácido desoxirribonucleico. El análisis TaqMan reveló la presencia de hsa-miR-23a, hsa-miR-744 y hsa-let-7f en los espermatozoides de todos los individuos estudiados. La expresión de hsa-let-7f mostró una reducción significativa en 3 de los 4 individuos problema respecto a los individuos control.
Conclusión: Los espermatozoides humanos contienen los mi-ARN hsa-miR-23a, hsamiR-744 y hsa-let-7f. Este último muestra una reducción significativa de expresión en 3 de los 4 individuos infértiles analizados sugiriendo la implicación de alteraciones en la expresión de mi-ARN como causa subyacente de algunos casos de infertilidad masculina.
Introduction: MicroRNAs (miRNAs) are 22-24nt molecules involved in the gene expression regulation of many biological processes. Several authors have recently identified altered miRNA expression profiles in cases of male idiopathic infertility, suggesting its fundamental role in fertility regulation.
Objective: To characterize the expression of four miRNAs in sperm ribonucleic acid from fertile and infertile men.
Material and methods: Four ejaculated samples from fertile donors and four samples from idiopathic infertile patients were obtained. Total RNA was isolated using the TRIzol method followed by a DNase treatment. To confirm proper ribonucleic acid purification, a polymerase chain reaction for the Protamine-1 gene (PRM-1) was performed. Afterwards, real-time polymerase chain reaction with specific primers for the miRNAs hsa-miR-23a, hsa-miR-744, hsa-let-7f and hsa-miR-1, together with the normalization control Mamm-U6, were performed. Differences in expression were quantified by the Fold-Change statistic and 95% confidence intervals.
Results: For each individual, an average of 2.6×10-5ng ribonucleic acid/spermatozoa was obtained, with a purity of 1.72 (±0.05) and no traces of deoxyribonucleic acid. TaqMan analysis confirmed the presence of hsa-miR-23a, hsa-miR-744 y hsa-let-7f in all the samples. The expression of hsa-let-7f was significantly lower in three of the four samples from men with idiopathic infertility.
Conclusion: Human spermatozoa contain the miRNAs hsa-miR-23a, hsa-miR-744 and hsalet-7f. Hsa-let-7f expression was significantly reduced in three out of four infertile patients, suggesting the involvement of alterations in miRNA expression as the underlying cause of some cases of male infertility.
Introducción
Los micro-ARN (mi-ARN) son moléculas de ácido ribonucleico (ARN) funcionales, formadas por una cadena de 22-24 nucleótidos que forman estructuras semicomplementarias en las regiones 3' no traducidas de los ARN mensajeros a los que regulan1,2.
Los mi-ARN se sintetizan en el núcleo en forma de moléculas precursoras primarias. Éstas son procesadas por grupos catalizadores llamados DGCR8 y DROSHA hasta las moléculas precursoras secundarias, de 60-70 nucleótidos. Éstas son exportadas al citoplasma, vía exportina-5', y procesadas por los complejos TRBP y DICER. Después del procesamiento, los mi-ARN se unen a proteínas de la familia Argonauta, formando los complejos miRNA-induced silencing complex3. Estos complejos regulan la expresión génica, inhibiendo o activando la traducción de determinados ARN mensajeros4,5.
En humanos, se han identificado hasta 1.527 mi-ARN6 (miRBase, versión 18.0, http://microrna.sanger.ac.uk), muchos de ellos relacionados con la regulación del ciclo celular7,8, el desarrollo embrionario9 y la regulación de la gametogénesis, tanto masculina10 como femenina11.
Por otra parte, alteraciones en los perfiles de expresión de mi-ARN se han vinculado con procesos biológicos anormales como el cáncer8,12,13, afecciones cardíacas14, trastornos neuronales15 o alteraciones respiratorias16, entre otros. Algunos autores también han identificado perfiles alterados de expresión de mi-ARN en tejido testicular de individuos con infertilidad idiopática17,18, sugiriendo un papel relevante de estas moléculas en la regulación de la fertilidad. Lian et al17,18 identificaron pacientes con azoospermia no obstructiva con alteraciones de la expresión de mi-ARN en células de la línea germinal. McCallie et al18 observaron que blastocistos transferibles obtenidos de parejas con síndrome de ovario poliquístico e infertilidad por factor masculino mostraban una disminución significativa en la expresión de mi-ARN en comparación con los blastocistos de donantes fértiles.
Está descrito que el transcriptoma del espermatozoide humano contiene más de 5.000 ARN mensajeros9, más de 35 mi-ARN19 y unos 1.100 piwi-interacting RNAs19. También se ha demostrado que algunos de estos transcritos son necesarios para el desarrollo del zigoto y el embrión20-25, indicando que la presencia de los diferentes tipos de ARN en el espermatozoide maduro no sería el resultado de un proceso estocástico23.
En este estudio hemos caracterizado los patrones de expresión de 4 mi-ARN en ARN espermático procedente de individuos fértiles e infértiles. Este trabajo marca el punto de partida de un proyecto global destinado a determinar si los patrones de mi-ARN presentes en espermatozoides de individuos con infertilidad idiopática son diferentes a los patrones de mi-ARN en espermatozoides de individuos fértiles.
Material y métodos
Se analizaron muestras de semen procedentes de 4 pacientes infértiles y 4 individuos fértiles o control. Las muestras control fueron facilitadas por el Laboratorio de Andrología y Banco de Semen del Instituto Valenciano de Infertilidad de Valencia (casos C1-C4). Los individuos que conformaban esta población presentaban: cariotipo normal, fertilidad probada, recuentos superiores a 90 × 106 espermatozoides totales con motilidad progresiva, más del 14% de formas normales (criterios estrictos de Kruger26) y recuentos superiores a 10 × 106 espermatozoides/ml con motilidad progresiva después del test de supervivencia posdescongelación (criterios de la Organización Mundial de la Salud, 201027). Las muestras de semen de individuos que consultaban por infertilidad procedían de la Unidad de Reproducción Asistida del Centro Médico Teknon de Barcelona, y se les atribuyó un origen idiopático después del examen andrológico rutinario (exploración física, historia reproductiva, perfil hormonal y seminal) (casos P1-P4, tabla 1). Los protocolos utilizados fueron aprobados por los comités de ética de los centros colaboradores.
La fracción espermática fue separada del resto de células del eyaculado mediante la lisis de las células somáticas utilizando una solución de 0,1% dodecilsulfato sódico y 0,5% Tritón X-100 en H2O miliQ, según el protocolo descrito por Goodrich et al28.
El ARN total de los espermatozoides fue extraído mediante el método TRIzol® (InvitrogenTM, LifeTechnologies, EE. UU.), basado en el protocolo de Chomczynski y Sacchi29,30, y seguidamente purificado mediante un tratamiento con DNasa recombinante (Ambion®, LifeTechnologies, EE. UU.). La calidad y cantidad de ARN extraído se determinó utilizando un espectrofotómetro UV/visible (Nanodrop-2000; ThermoS-cientific Inc., EE. UU.).
Una fracción de cada una de las muestras de ARN obtenidas fue retrotranscrita a cDNA mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y posteriormente amplificada por PCR con cebadores exónexón para el gen de la protamina 1 sintetizados por Roche Applied® (tabla 2). Con esta estrategia se puede verificar la integridad de los transcritos obtenidos y diferenciar los productos resultantes de la amplificación de ARN de los resultantes de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).
Una vez confirmada la ausencia de ADN, se realizaron RT-PCR adicionales utilizando el kit TaqMan MicroRNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, LifeTechnologies, EE. UU.), para los siguientes mi-ARN: hsa-miR-23a, hsamiR-744, hsa-let-7f y hsa-miR-1, y el gen normalizador Mamm-U6. El cDNA se diluyó con los cebadores correspondientes (TaqMan MicroRNA Assays, Applied Biosystems, Life-Technologies, EE. UU.), y se realizó la PCR a tiempo real con el kit TaqMan Universal PCR Master MixII (Applied Biosystems, LifeTechnologies, EE. UU.). Se analizaron 3 réplicas para cada muestra mediante la plataforma 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, LifeTechnologies, EE. UU.).
La cuantificación de las diferencias de expresión se determinó mediante el cálculo del estadístico Fold Change obtenido a partir de la variable Ct normalizada (ΔCt) por Mamm-U6. El objetivo de la normalización es reducir la variación técnica dentro de un conjunto de datos y, por tanto, permitir una mejor apreciación de la variación de expresión. La variable Ct indica el ciclo de PCR en que los mi-ARN son detectados, siendo un reflejo de sus niveles de expresión. El valor de Fold Change se calculó a partir de la relación numérica entre cada uno de los ΔCt obtenidos en individuos problema y la media de los valores ΔCt de los 4 individuos control. Los valores de Fold Change < 1 son indicativos de una menor expresión, mientras que valores > 1 indican un incremento de expresión. Se consideraron significativas las diferencias de expresión cuando el valor de ΔCt se situaba fuera del intervalo de confianza del 95% de ΔCt en las muestras control.
Resultados
Las extracciones de ARN total realizadas en espermatozoides mediante la utilización del método TRIzol® permitieron obtener una media de 2,6 × 10-5 ng de ARN (equivalente a 26 fg por espermatozoide). El grado medio (± DE) de pureza de la muestras fue de 1,72 (± 0,05) (tabla 3).
Los resultados de las PCR para el gen de protamina 1 confirmaron la presencia de este transcrito en las muestras analizadas y descartaron contaminaciones de ADN genómico, ya que solamente aparecieron amplificados los productos con medidas correspondientes a cADN (fig. 1).
Figura 1 Análisis electroforético al 2% de los productos de la PCR de protamina 1 (PRM-1). Carril 1: peso molecular (PM) de 100 a 1.000pb. Carril 2: control positivo de ADM (422pb). Carriles 3-10: cADN procedentes de espermatozoides de los individuos estudiados (331pb); la falta de intrones (91pb) permite ver la diferencia respecto el control positivo (ADN). Carriles 11 y 12: controles negativos.
Los resultados del ensayo TaqMan para los 4 mi-ARN identificaron la presencia de 3 de ellos tanto en las muestras problema como control (fig. 2): hsa-miR-23a, hsa-miR-744 y hsa-let-7f. En cambio, ninguna de las muestras mostró resultados de Ct para miR-1 compatibles con la presencia de esta molécula en espermatozoides humanos. Dos de los 3 mi-ARN identificados, hsa-miR-23a y hsa-miR-744, mostraron niveles de expresión equivalentes en muestras control y problema, mientras que hsa-let-7f presentó una reducción significativa de expresión en 3 de los 4 individuos problema. La reducción de expresión resultó significativa en los individuos P1 (astenoteratozoospérmico), P3 (teratozoospérmico) y P4 (normozoospérmico), no siendo significativa en el individuo P2 (normozoospérmico).
Figura 2 Diferencia de expresión de los 3 mi-ARN detectados en los individuos problema respecto a la media de los individuos control. * Diferencia de expresión significativa (la media se sitúa fuera del intervalo de confianza de la expresión normalizada en las muestras control).
Discusión
El método de extracción de ARN utilizado ha permitido la obtención de muestras de ARN espermático con una media de 26 fg de ARN por espermatozoide, coincidentes con las descritas en la bibliografía (entre 20 y 50 fg de ARN)23,31. Los valores de pureza de ARN obtenidos se consideran adecuados, teniendo en cuenta la alta proporción de TRIzol® utilizado y la reducida cantidad de ARN presente en los espermatozoides31,32. Esta alta proporción de TRIzol® desplaza la curva de absorbancia hacia 270 nm, situación que provoca una disminución de la ratio 260/28033. Además, el elevado grado de empaquetamiento del ADN espermático dificulta la recuperación del ARN e influye negativamente en las purezas obtenidas34.
Por otro lado, los resultados de las PCR de protamina 1 han confirmado que la extracción de ARN seguida por el tratamiento con DNasa recombinante permite la obtención de un ARN íntegro y libre de contaminaciones de ADN. Esta estrategia con cebadores exón-exón fue descrita previamente por varios autores28,35,36 y su aplicabilidad en este tipo de estudio está extensamente aceptada.
Los 4 mi-ARN analizados (hsa-miR-23a, hsa-miR-744, hsalet-7f y hsa-miR-1) se han descrito con anterioridad en diferentes tejidos humanos17,37, pero solamente hsa-miR-23a lo ha sido en espermatozoides19. Nuestro estudio, además de confirmar la presencia del hsa-miR-23a en espermatozoides humanos, constata, por primera vez, la presencia del hsamiR-744 y hsa-let-7f en estas células.
El presente estudio ha puesto de manifiesto una disminución significativa de la expresión del mi-ARN hsa-let-7f en 3 de los 4 individuos infértiles (individuos P1, P3 y P4). De estos 3 individuos, 2 de ellos (P1 y P3) presentaban alteraciones del seminograma. Aunque la función del mi-ARN hsalet-7f todavía es desconocida en humanos, en distintas especies animales se ha descrito que la familia let-7 está estrechamente relacionada con las funciones de desarrollo embrionario38,39. En conjunto, nuestros resultados indican que diferencias en el patrón de expresión de ciertos mi-ARN podrían ser la causa subyacente de algunos casos de infertilidad masculina.
Conclusiones
Los espermatozoides humanos contienen los mi-ARN hsamiR-23, hsa-miR-744 y hsa-let-7f. Este último muestra una reducción significativa de expresión en 3 de los 4 individuos infértiles, sugiriendo la implicación de alteraciones en la expresión de mi-ARN como la causa subyacente de algunos casos de infertilidad masculina.
Responsabilidades éticas
Protección de personas y animales: los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.
Confidencialidad de los datos: los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes y que todos los pacientes incluidos en el estudio han recibido información suficiente y han dado su consentimiento informado por escrito para participar en dicho estudio.
Derecho a la privacidad y consentimiento informado: los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
Financiación
El trabajo se ha desarrollado mediante la financiación de los proyectos FIS PS-09-00330, 2009/SGR00282 y Ayudas Merk Serono 2011FE16. Albert Salas-Huetos es el beneficiario de una beca predoctoral PIF de la UAB 456-01-1/E2010.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido posible gracias a la aportación de muestras del Instituto Valenciano de Infertilidad de Valencia y la Unidad de Reproducción Asistida del Centro Médico Teknon de Barcelona. Los autores agradecen la colaboración del Dr. Nicolás Garrido del Instituto Valenciano de Infertilidad de Valencia y del Dr. Mark Grossmann, la Dra. Carme Pons y el Dr. Javier Nadal de la Unidad de Reproducción Asistida del Centro Médico Teknon de Barcelona.
Recibido el 3 de mayo de 2012; aceptado el 25 de mayo de 2012
* Autor para correspondencia
Correo electrónico:ester.anton@uab.cat (E. Anton).