INTRODUCCIÓN
Desde su aparición en 1972, las técnicas de reproducción asistida han mostrado una rápida evolución. En sus comienzos, las técnicas existentes, no eran eficientes para solucionar el problema de fertilidad de parejas que presentaban esterilidad por factor masculino debido a daño espermático. Una solución a este problema surgió en 1992 con el desarrollo de la técnica de microinyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI). Sin embargo, y a pesar de los buenos resultados obtenidos con la implementación de esta técnica, aún hay factores que influyen en el desarrollo embrionario en estos pacientes que permanecen enigmáticos.
En la actualidad, las técnicas de reproducción asistida se basan en la utilización de métodos fiables de selección espermática previa a la realización de la ICSI. Dicha selección, basada en características morfológicas y funcionales del esperamatozoide, permite lograr mejores tasas de fecundación, desarrollo embrionario y embarazos, así como también la disminución de las tasas de aborto3-8.
Estudios de las características morfológicas del espermatozoide han revelado que la presencia de anormalidades acrosómicas y subacrosómicas se encuentran asociadas a fallos de fecundación in vitro mediante ICSI. Más recientemente, la observación de la morfología espermática a gran aumento ha revelado que la presencia de vacuolas nucleares estaría también relacionada con una función espermática deficiente9. En la actualidad, se ha implementado el uso de alta magnificación en la selección espermática (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) previa al ICSI con el objetivo de realizar una selección morfológica mas exhaustiva en los pacientes que presentan un claro factor masculino y/o abortos previos10-13.
En cuanto a la funcionalidad del espermatozoide, diversos estudios han revelado que el ácido hialurónico, un mucopolisacárido no sulfatado presente en la matriz extracelular del ovocito, es uno de los componentes que más contribuye a la fertilidad a través de la interacción con receptores específicos presentes en la membrana del espermatozoide maduro1,14. Por lo tanto, la evaluación de la capacidad del espermatozoide de unirse al ácido hialurónico constituye una forma de valorar su madurez y funcionalidad15-17.
Por tal motivo, en este trabajo se propuso evaluar los beneficios de realizar la selección espermática basándose en las características funcionales del espermatozoide, utilizando como método de selección la capacidad del espermatozoide de reaccionar al hialuronato presente en el medio SpermSlow (Medicult).
MATERIAL Y MÉTODOS
Se realizó un estudio prospectivo comparativo entre los medios de Hialuronato (SpermSlow, Medicult) y polivinilpirrolidona (PVP, Medicult) en la selección espermática de pacientes sometidos a ICSI. En el estudio se incluyeron 60 pacientes, de los cuales se recuperaron entre 8 y 16 ovocitos con un porcentaje de más de 60% de ovocitos a microinyectar (MII). Los ovocitos de cada paciente fueron clasificados según su morfología y divididos en 2 grupos de calidad similar. Un grupo se fertilizó mediante técnica de ICSI con espermatozoides seleccionados por medio de hialuronato y el otro por PVP. En todos los pacientes se evaluaron tasas de fertilización y desarrollo embrionario en días +2 y +3 para su posterior transferencia embrionaria.
Criterios de inclusión
- Mujeres menores de 35 años en las cuales se recuperaron entre 8 y 16 ovocitos con un porcentaje de más del 60 % de ovocitos MII.
- Varones con oligoastenozoospermia moderada o severa y menores de 45 años.
Técnica
- Placas de PVP: en una placa de Petri de 55 mm se colocaron 2 gotas de 5 µl de PVP a las cuales se agregó 1 µl de espermatozoides previamente capacitados. Alrededor de éstas se colocaron 8 microgotas de 5 µl de ICSI Holding Medium (Medicult) donde se incorporaron los ovocitos MII. Se cubrió con aceite de parafina y posteriormente se procedió a la microinyección convencional.
- Placas de SpermSlow: en otra placa de Petri se procedió de la misma forma que la anterior, sustituyendo el PVP por medio SpermSlow, pero en lugar de agregar al medio 1 µl de espermatozoides capacitados, se depositó la gota capacitada inmediatamente al lado de una de las gotas de SpermSlow, juntando muy cuidadosamente ambas gotas (fig. 1). Se incubó 15 min al 5% de CO2 a 37 ºC. Posteriormente, se procedió a seleccionar los espermatozoides móviles que quedaron adheridos en la interfase de las gotas para realizar, seguidamente, la microinyección (fig. 2).
Figura 1. Diagrama que muestra cómo se realiza la selección espermática con SpermSlow. Tomada de How to select the best mature spermatozoa for ICSI, con autorización de MediCult.
Figura 2. Espermatozoides en la interfase hialuronato-semen (aumento, ×400).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS. La comparación de las calidades embrionarias en días +2 y +3 se realizó mediante el test de la χ2.
RESULTADOS
Se fertilizaron 517 ovocitos, 252 por PVP y 265 por SpermSlow, de los cuales en el grupo de PVP fertilizó de forma normal el 83,3%, anormal el 2% y no fertilizó el 14,7% de los ovocitos, mientras que en el grupo del SpermSlow fertilizó de forma normal el 84,9%, anormal el 1,9% y no fertilizó el 13,2 % (fig. 3). La calidad embrionaria se analizó según criterios de ASEBIR del año 2008 en A-B-C-D.
Figura 3. Tasa de fecundación de ovocitos microinyectados con espermatozoides seleccionados en SpermSlow o PVP.
En el día + 2 se observó, con PVP, un 9,3% de embriones tipo A, un 30,2% tipo B, un 43,3% tipo C, un 12,6% tipo D y un 4,6% de embriones no evolutivos (fig. 4). Con SpermSlow, se observó un 23,1% tipo A, un 26,1% tipo B, un 36,1% tipo C, un 3% tipo D y un 11,7% de embriones no evolutivos (fig. 4). En cuanto al día +3 se observó en el grupo de PVP un 15,1% de embriones de calidad embrionaria de tipo A, un 30,2% tipo B, un 33,2% tipo C, un 12,2% tipo D y un 9,3% no evolutivos, y con SpermSlow un 20,8% tipo A, un 26,6% tipo B, un 36,4% tipo C, un 12,3% tipo D y un 3,9% no evolutivos (fig. 5).
Figura 4. Calidades embrionarias a día +2 de ovocitos microinyectados con espermatozoides seleccionados en SpermSlow o polivinilpirrolidona (PVP).
Figura 5. Calidades embrionarias a día +3 de ovocitos microinyectados con espermatozoides seleccionados en SpermSlow o polivinilpirrolidona (PVP).
El análisis estadístico mediante el test de la χ2 de las calidades embrionarias en día +2 reveló que hay diferencias con un nivel de significación de 0,022 (significativo < 0,05) para las calidades A y D, siendo la calidad A mayor en SpermSlow y la D mayor en PVP.
En cuanto al día +3, las diferencias encontradas no resultaron significativas según dicho test (nivel de significación: 0,914).
DISCUSIÓN
La selección de espermatozoides para la microinyección contribuye en forma importante al éxito de la ICSI. Previamente, se ha demostrado que los espermatozoides capaces de unirse al hialuronato son más maduros, contienen menor daño en el ADN y menor número de aneuploidías18,19. Esta observación ha llevado a la conclusión que el hialuronato constituiría un buen medio de selección de espermatozoides maduros, y en la actualidad esta hipótesis se encuentra bajo estudio intensivo en diversos laboratorios20-24.
En el presente trabajo se compararon las tasas de fecundación y calidades embrionarias en días +2 y +3 obtenidas de ovocitos MII por ICSI con espermatozoides seleccionados en medios de PVP y SpermSlow que contienen hialuronato. No se encontraron diferencias significativas en cuanto a las tasas de fecundación obtenidas en los 2 tratamientos (fig. 3). Sin embargo, la comparación de las calidades embrionarias según los criterios de ASEBIR, reveló diferencias de embriones tipo A y tipo D. En el medio con hialuronato se obtuvo un mayor porcentaje de embriones tipo A que en PVP, esta diferencia fue más importante en el día +2 que en el día +3. En cuanto a los embriones tipo D, se encontraron menor cantidad de embriones de esta calidad en el medio SpermSlow (figs. 4 y 5).
Si bien las diferencias encontradas resultaron ser estadísticamente significativas sólo en día +2, no se puede desestimar la tendencia observada también en día +3.
Las diferencias obtenidas en las calidades embrionarias, revelan que el uso de hialuronato en el medio de selección-inyección de espermatozoides favorecería la selección de espermatozoides de mejor calidad. Adicionalmente, otra ventaja del hialuronato es que se trata de un compuesto naturalmente presente en el ovocito y, por lo tanto, que no posee efectos dañinos; en cambio, el PVP es un compuesto no metabolizable que podría presentar efectos adversos15, 25.
CONCLUSIÓN
El presente trabajo revela que el método de selección espermática basado en la funcionalidad del espermatozoide a través de su capacidad de reacción al hialuronato es un método que aporta los mismos resultados que el PVP en cuanto a tasas de fecundación y, además, posee una tendencia a mostrar mejores calidades embrionarias. Adicionalmente, el SpermSlow posee la ventaja de ser un medio similar al natural y, de esta manera, evitaría el uso de sustancias que pueden tener efectos dañinos. En un futuro, sería necesario complementar el presente estudio con resultados de tasas de embarazo y de aborto, en donde podrían encontrarse mayores evidencias de las ventajas del método funcional de selección espermática.
Correspondencia: Dr. A. Brassesco-Macazzaga.
Centro de Infertilidad y Reproducción Humana (CIRH). Clínica Corachán. Plaza Eguilaz, 14. 08017 Barcelona. España.
Correo electrónico: laboratorio@cirh.es