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A. Porcentaje de CSC (con fenotipo ALDH<span class="elsevierStyleSup">+</span>) en células T47D, con fenotipo ALDH-positivas, en presencia o ausencia de fulvestrant (ICI). B. Análisis de expresión de PR (ARN) en células MCF-7 y resistentes a tamoxifeno (TamR) en presencia o ausencia de fulvestrant. C y D. Ensayo de proliferación de células MCF-7 y MCF-7-TamR (C) y células T47D y T47D-TamR (D) tratadas con concentraciones crecientes de fulvestrant (p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05). E. Niveles de expresión de Sox2 en células MCF-7 y resistentes a tamoxifeno en presencia o ausencia de fulvestrant.</p>" ] ] ] "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Introducción</span><p id="par0005" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La glándula mamaria es un órgano altamente regenerativo que puede experimentar múltiples ciclos de proliferación, diferenciación y apoptosis durante diferentes etapas de la vida, como la pubertad, el embarazo o la lactancia. Esta capacidad evidenció la presencia en la mama de células con características de células madre, es decir, con capacidad de autorrenovación (dar lugar a células iguales a ellas mismas) y de diferenciación (en la mama, a células luminales y células mioepiteliales)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0005"><span class="elsevierStyleSup">1</span></a>. Debido a su larga vida, las células madre tienen el potencial de sufrir mayor número de mutaciones y, por lo tanto, perder el control de sus propiedades y dar origen a un tumor.</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El cáncer de mama es una enfermedad muy heterogénea a nivel histológico y, sobre todo, a nivel molecular. Esta heterogeneidad se ve reflejada también a nivel celular con la identificación, en los carcinomas de mama, de una pequeña subpoblación de células con características de células madre, las células madre cancerosas (CSC).</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hoy en día es un hecho aceptado que las vías de señalización que controlan el destino y la función de las células madre se encuentran con frecuencia alteradas en el cáncer de mama y otros tipos de cáncer<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>. En consecuencia, se ha postulado la hipótesis de que las CSC son las células responsables de la iniciación de los tumores y, además, son más resistentes a las terapias actuales como la radioterapia<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>, la quimioterapia<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a> o la terapia hormonal<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>. Por otra parte, se ha demostrado que los tumores de alto grado contienen un mayor número de células con fenotipo de células madre que los tumores más diferenciados<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6,7</span></a>.</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se han empleado diferentes estrategias para identificar y caracterizar las células madre de la mama sana y tumoral, incluyendo la capacidad de formar mamoesferas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0040"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>, la presencia de células con fenotipo doble positivo (DP, es decir que expresan ambos antígenos de superficie, EMA<span class="elsevierStyleSup">+</span> y CALLA<span class="elsevierStyleSup">+</span>)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>, con la expresión de los marcadores de superficie CD44<span class="elsevierStyleSup">+</span>CD24<span class="elsevierStyleSup">−/low</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>, <span class="elsevierStyleItalic">side population</span> (SP, con mayor capacidad de expulsar la tinción Hoechst 33342)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a> o la elevada actividad aldehído deshigrogenasa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>. En este estudio analizamos la respuesta de las células madre de la mama, empleando varios de estos fenotipos, para investigar la influencia de los estrógenos, tamoxifeno y fulvestrant sobre las células madre en la mama sana y en cáncer de mama, con especial énfasis en su implicación en la resistencia a la terapia hormonal.</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Pacientes y métodos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Pacientes</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El tejido de mama sano (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>15) fue obtenido de mujeres premenopáusicas sin historia previa de cáncer de mama, que se sometieron a mamoplastia de reducción. Las muestras de tumores (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10) fueron obtenidas de mujeres con cáncer de mama (rango de edad de 42 a 80 años, sin criterios de inclusión ni exclusión, las muestras incluían diferentes tipos de carcinomas mamarios). En todos los casos las pacientes ofrecieron su consentimiento informado y firmado, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación Clínica de Euskadi y del Hospital de Galdakao-Usansolo.</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Materiales y métodos</span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Procesamiento del tejido mamario</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El tejido mamario fue procesado inmediatamente para su estudio, como se ha descrito previamente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>. El tejido fue cortado y digerido con colagenasa a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C. Después de varios lavados, los organoides (fragmentos muy pequeños de epitelio mamario, ductales y lobuloalveolares, obtenidos directamente tras la digestión del tejido mamario) fueron separados, filtrados y disgregados para dar lugar a una suspensión celular. Las células tumorales fueron aisladas empleando el mismo procedimiento.</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Cultivo celular</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las líneas MCF-7 y T47D se obtuvieron de la <span class="elsevierStyleItalic">American Type Culture Collection</span>, y las células resistentes a tamoxifeno de estas líneas celulares (MCF-7-TamR y T47D-TamR) fueron desarrolladas manteniendo las células en presencia de una concentración de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>×<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10<span class="elsevierStyleSup">−7</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M de 4-OH-tamoxifeno durante más de 6 meses. Las líneas fueron mantenidas en medio DMEM/F-12 con GlutaMAX™ suplementado al 10% con suero fetal bovino y con 1% penicilina/estreptomicina a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C y atmósfera del 5% de CO<span class="elsevierStyleInf">2</span>. Las mamosferas se cultivaron durante una semana en medio DMEM/F-12 con GlutaMAX™, suplementado con 0,5X de B27 (Gibco), 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ng/ml EGF (Invitrogen), 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ng/ml bFGF (Invitrogen) y 1% penicilina-estreptomicina a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C y atmósfera del 5% de CO<span class="elsevierStyleInf">2</span>.</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Preparación y análisis de ácido ribonucleico y proteínas</span><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El ARN total se extrajo siguiendo las recomendaciones del fabricante (Illustra™ RNAspin Mini Isolation Kit, GE Healthcare). La síntesis de ARN y su análisis cuantitativo por reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un equipo 7300 Real-Time PCR System de 96 pocillos (Applied Biosystems), según se ha detallado previamente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>. Los <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> utilizados fueron: Sox2, <span class="elsevierStyleItalic">forward primer</span> (5’-3’): GCACATGAACGGCTGGAGCAACG, <span class="elsevierStyleItalic">reverse:</span> TGCTGCGAGTAGGACATGCTGTAGG; receptor de progesterona (PR), <span class="elsevierStyleItalic">forward:</span> CGCGCTCTACCCTGCACTC, <span class="elsevierStyleItalic">reverse:</span> TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT; control 36B4, <span class="elsevierStyleItalic">forward:</span> GTGTTCGACAATGGCAGCAT, <span class="elsevierStyleItalic">reverse:</span> GACACCCTCCAGGAAGCGA. Las condiciones fueron 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C, 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C y 60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s a 65<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C. Así mismo, en ese trabajo se podrán encontrar detalles del análisis de proteínas por <span class="elsevierStyleItalic">western blotting</span> e inmunohistoquímica. Para el análisis por <span class="elsevierStyleItalic">western blotting</span> las células fueron extraídas directamente en solución Laemmli (Sigma). Los anticuerpos empleados fueron los siguientes: beta-actina (Sigma, AC-15/A5441), PR (Novocastra, PGR-312), Sox2 (Santa Cruz, sc-17320), HER2 (Cell Signaling, 2165). Para el estudio inmunohistoquímico, las muestras de carcinomas, fijadas en formalina y embebidas en parafina, fueron procesadas empleando el sistema Leica Bond-III y los tampones de Novocastra. Se siguió un paso de precalentamiento para el desenmascaramiento (20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min, 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C), y las secciones fueron lavadas e incubadas con el anticuerpo contra Sox2 (Stem Cells Technologies) durante 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a temperatura ambiente. La peroxidasa fue bloqueada durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min, seguida de HRP y DAB con hematoxilina para el contraste. Los controles negativos incluyeron la omisión del primer anticuerpo y el uso de un anticuerpo control IgG.</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Cuantificación y aislamiento de las poblaciones de células madre</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para medir la actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa en las células se llevó a cabo el ensayo ALDEFLUOR™ de acuerdo con el protocolo de la compañía (Stemcell Technologies). Para el fenotipo SP y las tinciones con anticuerpos de superficie contra EMA (BD, 559774) y CALLA (Dako, SS2/36) (DP) se siguieron los protocolos empleados previamente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>. Para la tinción del fenotipo CD44/CD24 se emplearon los anticuerpos: CD44-APC (BD, G44-26) y CD24-PE (BD, ML5)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>. Todas las muestras se examinaron en un citómetro de flujo FACSAria™. Los resultados se analizaron utilizando el programa FACSDiva™.</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Ensayo de proliferación</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las células MCF-7 y T47D fueron sembradas por triplicado en placa de 96 pocillos y tratadas con crecientes concentraciones de ICI 182,720 (Fulvestrant) y etanol como vehículo del fármaco. Después de 5 días, las células fueron lavadas y fijadas con una solución de cristal violeta y metanol, y la concentración de cristal violeta retenida fue cuantificada en un espectrofotómetro a 595<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm. Los resultados son mostrados como <span class="elsevierStyleItalic">fold change proliferation</span>, es decir, el cambio en la proliferación celular producido como consecuencia del tratamiento hormonal con respecto al efecto en las células tratadas con el vehículo solo (MCF-7, n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>7, T47D, n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>5; <span class="elsevierStyleItalic">p</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05).</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Análisis estadístico</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Datos de por lo menos 3 experimentos independientes fueron expresados como media<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>DE. El test de la t de Student fue empleado para determinar las diferencias estadísticamente significativas, y <span class="elsevierStyleItalic">p</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05 fue considerado significativo.</p></span></span></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Resultados</span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Las células epiteliales de mama responden a los tratamientos hormonales</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para estudiar la respuesta de la mama a los tratamientos hormonales se determinó la actividad transcripcional del receptor de estrógeno (ER) en células de mama sana. Las células epiteliales fueron tratadas con diferentes hormonas: 17-beta-estradiol (estrógeno), 4-hidroxitamoxifeno (tamoxifeno), el antagonista completo ICI 182,780 (Faslodex<span class="elsevierStyleSup">®</span>, nombre genérico: fulvestrant), o el control (etanol) durante un periodo de 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h. La activación del receptor por el estrógeno dio lugar a niveles de expresión más elevados de genes diana dependientes de estrógeno, como la ciclina D1, y redujo la expresión de AIB1 y HER2 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A). Por otra parte, los antagonistas tamoxifeno y fulvestrant ejercieron el efecto contrario, dando lugar a una reducción de los niveles de ciclina D1 y un incremento en los niveles de AIB1 y HER2. Es interesante destacar que en las células de cáncer de mama MCF-7, empleadas como control positivo y estudiadas con frecuencia en los laboratorios como modelo de cáncer de mama ER-positivo, se obtuvo la misma respuesta. Además, se analizó la actividad transcripcional de ER empleando el ensayo de la actividad luciferasa. Estos ensayos mostraron una mayor actividad de ER en respuesta al estrógeno, mientras que los antagonistas no tuvieron ningún efecto (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>B). En conjunto, estas observaciones demuestran que las células epiteliales de la mama sana responden a través del receptor de estrógeno a los tratamientos hormonales.</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">La población de células madre cancerosas se enriquece con los tratamientos antiestrogénicos</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para examinar los niveles de expresión de ER en los diferentes tipos celulares en la mama sana, las células epiteliales fueron separadas por <span class="elsevierStyleItalic">fluorescence activated cell sorting</span>, lo que permite aislar los diferentes tipos celulares basándose en el marcaje celular diferencial con un marcador de fluorescencia. En este caso, se aislaron las células diferenciadas en base a la expresión de proteínas de superficie específicas: EMA<span class="elsevierStyleSup">+</span>, que identifica las células luminales, y CD10 o CALLA<span class="elsevierStyleSup">+</span>, a las células mioepiteliales; por otro lado, se sortearon las células madre con fenotipo SP<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>. Se observó que aproximadamente el 25% de las células luminales (EMA<span class="elsevierStyleSup">+</span>) expresaban ER (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>A). Sin embargo, las células madre con fenotipo SP no expresaban ER, así como tampoco las células mioepiteliales (CALLA<span class="elsevierStyleSup">+</span>). Estos resultados confirman la ausencia de ER en las células madre de mama sana.</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A continuación se investigó la influencia de las hormonas sobre diferentes poblaciones de células madre. El tratamiento con estrógeno redujo de forma significativa el porcentaje de células madre en la mama sana, mientras que tamoxifeno ejercía el efecto contrario, y estos efectos se observaron con varios fenotipos diferentes, incluyendo formación de mamoesferas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>B) y porcentaje de células DP (EMA<span class="elsevierStyleSup">+</span>, CALLA<span class="elsevierStyleSup">+</span>) (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>C). Igualmente, en las células de cáncer de mama aisladas de tumores primarios, el estrógeno reducía de forma significativa el porcentaje de CSC, mientras que se observaba un enriquecimiento de la población de CSC en respuesta a tamoxifeno (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>D). Estas observaciones indican que el estrógeno reduce la población de células madre sanas y cancerosas en la mama.</p></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Los tumores resistentes a tamoxifeno contienen más células madre cancerosas, y expresan niveles más elevados de Sox2 y más reducidos de receptor de progesterona</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La observación de que la población de células madre se enriquece en respuesta a tamoxifeno daba lugar a la pregunta sobre sus consecuencias en el contexto del desarrollo de resistencia al mismo. Para examinar el papel de las CSC en este proceso se empleó un modelo de resistencia a tamoxifeno desarrollado a partir de 2 líneas celulares de cáncer de mama, MCF-7 y T47D, que desarrollaron resistencia a tamoxifeno tras varios meses de exposición a la terapia<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>. Estas células expresan ER, pero el receptor es menos activo a nivel transcripcional, como se puede inferir por los niveles muy reducidos de expresión de uno de sus genes diana más empleado en la clínica, el PR (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>A). De hecho, observamos que el cultivo de las células de cáncer MCF-7 en mamoesferas, es decir, en condiciones de enriquecimiento de CSC, es suficiente para reducir considerablemente los niveles de expresión de PR (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>B).</p><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para examinar el contenido de CSC se analizaron los niveles de expresión de Sox2, un marcador de células madre, y se observó que las células resistentes a tamoxifeno expresan niveles más altos de Sox2 que las células de cáncer parentales. Además, cuando las CSC fueron separadas del resto de las células tumorales, se observó que Sox2 se expresa de forma claramente mayoritaria en las CSC con respecto al resto de las células (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>C). Estos resultados alentaron el análisis retrospectivo de los niveles de Sox2 en muestras tisulares de 55 pacientes con cáncer de mama. Los niveles de Sox2 eran apenas detectables en los tumores de aquellas pacientes que respondieron al tratamiento con tamoxifeno (un ejemplo representativo lo observamos en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3</a>D, como «Responde»). Sin embargo, los tumores primarios de pacientes que, más tarde, desarrollaron resistencia a tamoxifeno ya presentaban niveles significativos de Sox2 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>D, «No responde. Tumor primario»). Además, las recidivas de estas pacientes presentaban niveles de Sox2 aún más elevados (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>D, «No responde. Tumor recidiva»). Estas observaciones confirman que los tumores resistentes a tamoxifeno presentan un mayor contenido de CSC, niveles reducidos de PR y elevada expresión de Sox2, lo cual sugiere que Sox2 podría ser un marcador de resistencia a tamoxifeno.</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">Las células madre cancerosas resistentes a tamoxifeno también lo son a fulvestrant</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha planteado el uso de fulvestrant como tratamiento alternativo a tamoxifeno cuando este falla como terapia endocrina. En primer lugar, se trataron células de cáncer de mama T47D con fulvestrant y se examinó el porcentaje de CSC con fenotipo positivo para aldehído deshidrogenasa. Como resultado de este tratamiento el porcentaje de CSC se incrementó (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>A). Por otra parte, el tratamiento con fulvestrant de células MCF-7 parentales y MCF-7 resistentes a tamoxifeno resultó en una fuerte reducción de los niveles de PR, indicando que el antagonista destruye el ER (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>B y datos no mostrados). Para determinar la respuesta a fulvestrant de las células resistentes a tamoxifeno se realizaron ensayos de viabilidad celular en presencia de concentraciones crecientes de fulvestrant. Ambos modelos celulares de resistencia a tamoxifeno, bien derivados de las células MCF-7 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>C), bien de las T47D (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>D), mostraron que las células resistentes a tamoxifeno también lo son a fulvestrant.</p><elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalmente, los análisis del marcador Sox2 demostraron que los niveles de expresión de Sox2 se mantienen incrementados en las células resistentes a tamoxifeno tratadas con fulvestrant (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>E), indicando que el contenido de CSC es muy alto en estas condiciones. Estos resultados evidencian que el tratamiento con fulvestrant mantiene el elevado porcentaje de CSC en las células resistentes a tamoxifeno, razón por la cual estos tumores son también resistentes a fulvestrant.</p></span></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0140">Discusión</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Tamoxifeno ha sido empleado como tratamiento contra tumores ER-positivos durante muchos años. Sin embargo, la resistencia a tamoxifeno se desarrolla en un gran número de pacientes<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">15,16</span></a>. Con este trabajo hemos evaluado la respuesta de las células madre de la mama a los tratamientos hormonales y su implicación en la resistencia a tamoxifeno. Observamos que a pesar de que las células epiteliales de mama responden al tratamiento hormonal, las células madre pueden eludir sus efectos debido a la ausencia de ER. El estrógeno reduce la población de células madre, mientras que tamoxifeno la incrementa, lo que puede explicar el elevado contenido de Sox2, un marcador de CSC, y la notable reducción de los niveles de expresión de PR. Por otra parte, el tratamiento de las células resistentes a tamoxifeno con fulvestrant no elimina la población de CSC, lo que explica la resistencia a sus efectos antiproliferativos.</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Tamoxifeno funciona como un antagonista de ER en la mama, uniéndose a dicho receptor y bloqueando su actividad transcripcional, mientras que fulvestrant degrada al receptor. Fulvestrant se puede emplear cuando el tratamiento con tamoxifeno, o con inhibidores de aromatasa, ha fallado. La posible utilidad de combinar fulvestrant con otros tratamientos está siendo investigada en ensayos clínicos, aunque algunos resultados preliminares son controvertidos, con frecuentes recidivas y pronósticos pobres<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0140"><span class="elsevierStyleSup">17–19</span></a>. Es posible que algunos de estos resultados poco prometedores puedan ser explicados por la observada capacidad de las células de resistir a los efectos de fulvestrant y el mantenimiento de la población de CSC, a pesar del tratamiento.</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha especulado que con los tratamientos anticancerosos actuales, una subpoblación de células, las CSC o células iniciadoras del tumor, pueden reiniciar el crecimiento de este después de la terapia en un considerable número de pacientes. Nuestros resultados coinciden con las observaciones obtenidas en varios laboratorios, que muestran que los tratamientos actuales eliminan la mayoría de la masa tumoral, resultando en un enriquecimiento del contenido de CSC, debido al hecho de que estas células pueden ignorar sus efectos y no verse afectadas por estos tratamientos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0005"><span class="elsevierStyleSup">1,20</span></a>.</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las células madre en la mama sana son las responsables de la formación de nuevas células epiteliales dependiendo de las necesidades del organismo. Varios grupos de investigación, incluyendo el nuestro, han demostrado previamente que las células madre no expresan ER, o lo hacen a niveles muy bajos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9,21</span></a>. En el caso de las células tumorales tratadas con tamoxifeno, la ausencia de ER en las células madre facilita que las CSC se vuelvan insensibles a los efectos antiproliferativos de tamoxifeno (o de fulvestrant) y seguir creciendo, mientras las células más diferenciadas, que expresan ER, desaparecen, dando lugar a un tumor con mayor contenido de CSC y, por lo tanto, más agresivo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>. En consonancia con estas observaciones, Sox2 también ha sido implicado en el mantenimiento de la población de CSC y en la resistencia a terapia en varios tipos de carcinomas, incluyendo glioblastoma<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>, cáncer de próstata<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a> y melanomas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>. La elevada expresión de Sox2 en las muestras clínicas de pacientes con recidivas confirma observaciones previas, que mostraban tumores de mama pobremente diferenciados con una incrementada expresión de genes normalmente enriquecidos en células madre embrionarias<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a> y con una mayor proporción de CSC que los tumores bien diferenciados<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>, apoyando la noción de que el contenido de CSC refleja la malignidad del tumor<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>.</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La correlación detectada entre los niveles de Sox2 y el desarrollo de resistencia a la terapia garantiza una sólida base para un estudio más detallado y amplio sobre el uso de Sox2 como marcador de resistencia a tamoxifeno, en los carcinomas de mama. La posible aplicación práctica de nuestros resultados es que la combinación de terapia endocrina para eliminar las células ER-positivas, junto con un inhibidor de Sox2 para atacar a las células madre, podría suponer una nueva estrategia terapéutica para prevenir la recurrencia en determinados grupos de pacientes con cáncer de mama.</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En conclusión, el desarrollo de resistencia a tamoxifeno en cáncer de mama implica un incremento en el contenido de células madre cancerosas. El tratamiento con el antagonista fulvestrant no disminuye de forma significativa la población de células madre cancerosas. Sox2 podría ser un biomarcador de resistencia a tamoxifeno en el cáncer de mama.</p></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0145">Responsabilidades éticas</span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0150">Protección de personas y animales</span><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.</p></span><span id="sec0095" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0155">Confidencialidad de los datos</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.</p></span><span id="sec0100" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0160">Derecho a la privacidad y consentimiento informado</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.</p></span></span><span id="sec0105" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0165">Conflicto de intereses</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.</p></span></span>" "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:12 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "xres375294" "titulo" => array:5 [ 0 => "Resumen" 1 => "Objetivo" 2 => "Métodos" 3 => "Resultados" 4 => "Conclusiones" ] ] 1 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec354433" "titulo" => "Palabras clave" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "xres375293" "titulo" => array:5 [ 0 => "Abstract" 1 => "Objective" 2 => "Methods" 3 => "Results" 4 => "Conclusions" ] ] 3 => array:2 [ "identificador" => 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class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0020">Resultados</span><p id="spar0015" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Las células epiteliales y las células madre de la mama respondieron de forma diferente a los tratamientos hormonales. Las células resistentes a tamoxifeno presentaban un mayor contenido de células madre cancerosas y expresaban niveles de Sox2 más elevados, mientras que los niveles de expresión del receptor de progesterona eran muy bajos. Las células resistentes a tamoxifeno eran, además, más resistentes al tratamiento con fulvestrant.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Conclusiones</span><p id="spar0020" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">El desarrollo de resistencia a tamoxifeno está asociado con un incremento en el contenido de células madre cancerosas. El tratamiento con fulvestrant no parece disminuir la población de células madre cancerosas. Sox2 podría ser un biomarcador de resistencia a tamoxifeno en el cáncer de mama.</p>" ] "en" => array:2 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "<span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Objective</span><p id="spar0025" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">To determine the influence of various hormones (estrogen, tamoxifen and fulvestrant) on cell proliferation and differentiation in normal and cancer breast stem cells.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Methods</span><p id="spar0030" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Primary tissue samples, breast cancer cell lines and tamoxifen-resistant cells were used to analyze the effects of hormones on cell proliferation and differentiation.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Results</span><p id="spar0035" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Breast epithelial cells and stem cells responded differentially to hormone treatments. Tamoxifen-resistant cells showed increased cancer stem cell content and expressed higher Sox2 levels, while progesterone receptor levels were very low. Tamoxifen-resistant cells were resistant to fulvestrant treatment.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Conclusions</span><p id="spar0040" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">The development of tamoxifen resistance is associated with an increase in cancer stem cell content. Treatment with fulvestrant does not appear to reduce the cancer stem cell population. Sox2 could represent a biomarker of tamoxifen resistance in breast cancer.</p>" ] ] "multimedia" => array:4 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 1593 "Ancho" => 2216 "Tamanyo" => 259717 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0045" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Las células epiteliales de la mama responden al tratamiento hormonal. A. Análisis por Western blot de los niveles de expresión de ciclina D1, AIB1 y HER2 en organoides aislados de tejido mamario sano y en células de cáncer de mama MCF-7. B. Actividad transcripcional del receptor de estrógeno en células epiteliales de mama transfectadas con un gen reportero de luciferasa y tratadas con 10<span class="elsevierStyleSup">−8</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M estrógeno (E<span class="elsevierStyleInf">2</span>), 10<span class="elsevierStyleSup">−7</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M tamoxifeno (Tam) o 10<span class="elsevierStyleSup">−7</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M fulvestrant (ICI 182,780, ICI).</p>" ] ] 1 => array:7 [ "identificador" => "fig0010" "etiqueta" => "Figura 2" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr2.jpeg" "Alto" => 1703 "Ancho" => 1612 "Tamanyo" => 142818 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0050" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">La población de células madre se enriquece en respuesta al tratamiento con tamoxifeno. A. Expresión de ER (mARN) en células epiteliales de mama sana a nivel unicelular, representado como el porcentaje de cada tipo de células que expresa ER, EMA<span class="elsevierStyleSup">+</span> (luminales), CALLA<span class="elsevierStyleSup">+</span> (mioepiteliales) y SP <span class="elsevierStyleItalic">(stem cells)</span>. B. Fotografía representativa de las mamoesferas formadas por células MCF-7 tratadas con estrógeno (E<span class="elsevierStyleInf">2</span>), tamoxifeno (Tam) o el control (OH). C. Porcentaje de células madre (SC) con fenotipo DP en células de mama sana tratadas con estrógeno o tamoxifeno. D. Porcentaje de células madre cancerosas (CSC) con fenotipo CD44<span class="elsevierStyleSup">+</span>CD24<span class="elsevierStyleSup">−/low</span> en células de cáncer de mama tratadas con estrógeno o tamoxifeno.</p>" ] ] 2 => array:7 [ "identificador" => "fig0015" "etiqueta" => "Figura 3" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr3.jpeg" "Alto" => 2298 "Ancho" => 2307 "Tamanyo" => 488049 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0055" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Mayor contenido de CSC en células resistentes a tamoxifeno. A. Análisis por Western blot de los niveles de expresión del receptor de progesterona (PR) en células MCF-7 y T47D parentales (c) o resistentes a tamoxifeno (TamR). GAPDH es el control de carga. B. Niveles de expresión de PR a nivel de ARN en células adherentes (barra gris) o en mamoesferas durante varios días en cultivo (barras negras). C. Análisis de los niveles de Sox2 por Western blot (izquierda) o ARN (derecha) en células CSC con fenotipo CD44<span class="elsevierStyleSup">+</span>CD24<span class="elsevierStyleSup">−/low</span> o no <span class="elsevierStyleItalic">stem</span>. GAPDH y 36B4 se emplearon como controles en cada caso. D. Estudio por inmunohistoquímica de la expresión de Sox2 en muestras de cáncer de mama ER-positivo. Izquierda, ejemplo representativo de muestra de tumor que respondió al tratamiento hormonal («Responde»); centro, ejemplo de muestra del tumor primario de una paciente que no respondió a tamoxifeno («No responde. Tumor primario); derecha, ejemplo de muestra de la recidiva desarrollada después del fallo de la terapia hormonal («No responde. 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Ensayo de proliferación de células MCF-7 y MCF-7-TamR (C) y células T47D y T47D-TamR (D) tratadas con concentraciones crecientes de fulvestrant (p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05). E. Niveles de expresión de Sox2 en células MCF-7 y resistentes a tamoxifeno en presencia o ausencia de fulvestrant.</p>" ] ] ] "bibliografia" => array:2 [ "titulo" => "Bibliografía" "seccion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "bibs0005" "bibliografiaReferencia" => array:25 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "bib0005" "etiqueta" => "1" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "contribucion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "titulo" => "Cancer stem cells in the human mammary gland and regulation of their differentiation by estrogen" "autores" => array:1 [ 0 => array:2 [ "etal" => false "autores" => array:2 [ 0 => "B.M. 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Vivanco agradece especialmente el apoyo otorgado por varios proyectos: FIS del Instituto de Salud Carlos III (PI11/02251), del Departamento de Sanidad del Gobierno de la Comunidad Autónoma del País Vasco (PI2009-7) y de la Sociedad Española de Senología y Patología Mamaria.</p>" "vista" => "all" ] ] ] "idiomaDefecto" => "es" "url" => "/02141582/0000002700000004/v1_201410110158/S0214158214000577/v1_201410110158/es/main.assets" "Apartado" => array:4 [ "identificador" => "7622" "tipo" => "SECCION" "es" => array:2 [ "titulo" => "Originales" "idiomaDefecto" => true ] "idiomaDefecto" => "es" ] "PDF" => "https://static.elsevier.es/multimedia/02141582/0000002700000004/v1_201410110158/S0214158214000577/v1_201410110158/es/main.pdf?idApp=UINPBA00004N&text.app=https://www.elsevier.es/" "EPUB" => "https://multimedia.elsevier.es/PublicationsMultimediaV1/item/epub/S0214158214000577?idApp=UINPBA00004N" ]
año/Mes | Html | Total | |
---|---|---|---|
2024 Noviembre | 21 | 2 | 23 |
2024 Octubre | 136 | 14 | 150 |
2024 Septiembre | 137 | 22 | 159 |
2024 Agosto | 147 | 18 | 165 |
2024 Julio | 123 | 9 | 132 |
2024 Junio | 167 | 16 | 183 |
2024 Mayo | 164 | 29 | 193 |
2024 Abril | 145 | 15 | 160 |
2024 Marzo | 195 | 30 | 225 |
2024 Febrero | 172 | 44 | 216 |
2024 Enero | 210 | 23 | 233 |
2023 Diciembre | 146 | 21 | 167 |
2023 Noviembre | 203 | 45 | 248 |
2023 Octubre | 222 | 42 | 264 |
2023 Septiembre | 139 | 18 | 157 |
2023 Agosto | 159 | 16 | 175 |
2023 Julio | 174 | 11 | 185 |
2023 Junio | 148 | 30 | 178 |
2023 Mayo | 154 | 32 | 186 |
2023 Abril | 120 | 17 | 137 |
2023 Marzo | 145 | 23 | 168 |
2023 Febrero | 98 | 15 | 113 |
2023 Enero | 81 | 7 | 88 |
2022 Diciembre | 68 | 9 | 77 |
2022 Noviembre | 90 | 6 | 96 |
2022 Octubre | 79 | 13 | 92 |
2022 Septiembre | 79 | 16 | 95 |
2022 Agosto | 90 | 12 | 102 |
2022 Julio | 40 | 10 | 50 |
2022 Junio | 65 | 13 | 78 |
2022 Mayo | 105 | 17 | 122 |
2022 Abril | 61 | 11 | 72 |
2022 Marzo | 76 | 13 | 89 |
2022 Febrero | 66 | 6 | 72 |
2022 Enero | 148 | 17 | 165 |
2021 Diciembre | 81 | 14 | 95 |
2021 Noviembre | 167 | 12 | 179 |
2021 Octubre | 235 | 21 | 256 |
2021 Septiembre | 78 | 8 | 86 |
2021 Agosto | 101 | 11 | 112 |
2021 Julio | 52 | 9 | 61 |
2021 Junio | 72 | 15 | 87 |
2021 Mayo | 112 | 12 | 124 |
2021 Abril | 244 | 24 | 268 |
2021 Marzo | 105 | 31 | 136 |
2021 Febrero | 57 | 17 | 74 |
2021 Enero | 68 | 35 | 103 |
2020 Diciembre | 65 | 37 | 102 |
2020 Noviembre | 68 | 40 | 108 |
2020 Octubre | 38 | 20 | 58 |
2020 Septiembre | 67 | 17 | 84 |
2020 Agosto | 70 | 18 | 88 |
2020 Julio | 60 | 19 | 79 |
2020 Junio | 53 | 18 | 71 |
2020 Mayo | 63 | 26 | 89 |
2020 Abril | 47 | 6 | 53 |
2020 Marzo | 79 | 10 | 89 |
2020 Febrero | 71 | 22 | 93 |
2020 Enero | 53 | 18 | 71 |
2019 Diciembre | 39 | 21 | 60 |
2019 Noviembre | 49 | 21 | 70 |
2019 Octubre | 72 | 23 | 95 |
2019 Septiembre | 69 | 26 | 95 |
2019 Agosto | 38 | 10 | 48 |
2019 Julio | 40 | 16 | 56 |
2019 Junio | 110 | 43 | 153 |
2019 Mayo | 244 | 42 | 286 |
2019 Abril | 95 | 26 | 121 |
2019 Marzo | 42 | 9 | 51 |
2019 Febrero | 42 | 9 | 51 |
2019 Enero | 42 | 11 | 53 |
2018 Diciembre | 37 | 6 | 43 |
2018 Noviembre | 67 | 9 | 76 |
2018 Octubre | 99 | 7 | 106 |
2018 Septiembre | 94 | 10 | 104 |
2018 Agosto | 35 | 5 | 40 |
2018 Julio | 41 | 8 | 49 |
2018 Junio | 91 | 4 | 95 |
2018 Mayo | 46 | 6 | 52 |
2018 Abril | 42 | 3 | 45 |
2018 Marzo | 38 | 4 | 42 |
2018 Febrero | 36 | 2 | 38 |
2018 Enero | 50 | 1 | 51 |
2017 Diciembre | 36 | 3 | 39 |
2017 Noviembre | 42 | 3 | 45 |
2017 Octubre | 44 | 2 | 46 |
2017 Septiembre | 43 | 13 | 56 |
2017 Agosto | 42 | 6 | 48 |
2017 Julio | 54 | 6 | 60 |
2017 Junio | 53 | 11 | 64 |
2017 Mayo | 85 | 28 | 113 |
2017 Abril | 56 | 11 | 67 |
2017 Marzo | 58 | 48 | 106 |
2017 Febrero | 41 | 7 | 48 |
2017 Enero | 45 | 3 | 48 |
2016 Diciembre | 67 | 9 | 76 |
2016 Noviembre | 73 | 4 | 77 |
2016 Octubre | 61 | 9 | 70 |
2016 Septiembre | 88 | 13 | 101 |
2016 Agosto | 68 | 6 | 74 |
2016 Julio | 46 | 1 | 47 |
2016 Junio | 45 | 19 | 64 |
2016 Mayo | 79 | 37 | 116 |
2016 Abril | 40 | 27 | 67 |
2016 Marzo | 51 | 24 | 75 |
2016 Febrero | 33 | 23 | 56 |
2016 Enero | 45 | 35 | 80 |
2015 Diciembre | 40 | 19 | 59 |
2015 Noviembre | 50 | 15 | 65 |
2015 Octubre | 115 | 40 | 155 |
2015 Septiembre | 27 | 18 | 45 |
2015 Agosto | 42 | 8 | 50 |
2015 Julio | 46 | 8 | 54 |
2015 Junio | 30 | 12 | 42 |
2015 Mayo | 43 | 15 | 58 |
2015 Abril | 44 | 23 | 67 |
2015 Marzo | 42 | 19 | 61 |
2015 Febrero | 36 | 14 | 50 |
2015 Enero | 56 | 18 | 74 |
2014 Diciembre | 59 | 19 | 78 |
2014 Noviembre | 65 | 22 | 87 |
2014 Octubre | 21 | 6 | 27 |