Diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Bordetella pertussis

Codina Grau, M.G.; Ferrer Marcellés, A.

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Después de 7 a10 días de incubación a 37 °C en atmósfera normal en cámara para evitar la desecación, las colonias sospechosas se identifican con tinción de Gram, oxidasa y aglutinación con anticuerpos específicos.En el año 2000 comenzamos a trabajar amplificando el gen de 190 bp de la B. pertussis toxin operon region1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional, y 3 años más tarde estudiamos una técnica en tiempo real que amplifica un fragmento de 202 bp del genoma de B. pertussis y simultáneamente otro fragmento de 240 bp del gen de la betaactina (BACT) como control interno (tabla 1). La detección se realiza con sondas de hidrólisis marcadas con FAM (diana) y Texas red (control interno). La amplificación y la lectura de la fluorescencia se llevan a cabo con un aparato Smart Cycler, y los parámetros son 15 min a 95 °C para activar la polimerasa (Quantitect probe PCR Master Mix, Qiagen), seguido de 40 ciclos a 94, 62 y 72 °C de 30 s cada uno. La óptica se activa durante la fase de extensión. Después de aplicar las dos técnicas descritas de la PCR en 163 muestras de sendos pacientes con clínica compatible con tos pertusoide, comprobamos que los resultados obtenidos eran superponibles (20 muestras con resultado positivo y 143 negativo) y no encontramos inhibición de la reacción en ningún caso. Por ello, y también porque la amplificación en tiempo real presenta ventajas apreciables en cuanto a rapidez y simplificación de los procedimientos, decidimos introducir la amplificación por PCR en tiempo real en la sistemática del laboratorio, juntamente con el cultivo.<img src="72v10n02-13141177fig1.jpg" alt="TABLA 1 Iniciadores y sondas para la PCR en tiempo real"></img>Entre mayo de 2004 y mayo de 2005 se procesaron 233 muestras respiratorias de pacientes con sintomatología clínica compatible, y 202 de contactos convivientes. Las conclusiones que presentamos se basan en los resultados obtenidos en estos pacientes con las técnicas de cultivo y PCR en tiempo real.Utilizando la PCR en tiempo real se obtiene un número mayor de resultados positivos que con el cultivo, tanto en los posibles casos como en los contactos (tabla 2).<img src="72v10n02-13141177fig2.jpg" alt="TABLA 2 Rendimiento de las técnicas diagnósticas"></img>La confirmación microbiológica se consigue con más frecuencia en los pacientes no vacunados o con vacunación incompleta (tabla 3), y también en los niños menores de 1 año (tabla 4).<img src="72v10n02-13141177fig3.jpg" alt="TABLA 3 Relación entre el cumplimiento vacunal y la confirmación microbiológica"></img><img src="72v10n02-13141177fig4.jpg" alt="TABLA 4 Relación entre la edad y la confirmación microbiológica"></img>El número de cultivos positivos es inversamente proporcional al tiempo transcurrido desde el inicio de la tos, pero esto no se cumple con la PCR, con la cual se observa una estabilidad hasta transcurridos 30 días de sintomatología clínica (tabla 5). Desconocemos cuánto tiempo más allá de un mes desde la infección aguda se pueden seguir encontrando amplificaciones positivas, aunque con otros microorganismos no viables se ha descrito la eliminación de ácidos nucleicos durante meses3, lo cual también podría aplicarse a este caso.<img src="72v10n02-13141177fig5.jpg" alt="TABLA 5 Relación entre los resultados microbiológicos y el tiempo transcurrido desde el inicio de la tos"></img>La PCR en tiempo real es la técnica que nos permite hacer el diagnóstico con mayor rapidez y sensibilidad, si bien los resultados necesariamente deben interpretarse considerando la clínica del paciente, pues un resultado positivo puede traducir una infección pasada.En los pacientes con mayor riesgo de sufrir una infección grave (lactantes no vacunados), el cultivo puede tener una sensibilidad aceptable, sobre todo si estudiamos muestras recogidas en los primeros días del inicio del cuadro y que han sido transportadas rápidamente al laboratorio para asegurar la viabilidad del microorganismo. Esta técnica presenta otras ventajas adicionales inherentes al aislamiento de la cepa, como pueden ser los estudios epidemiológicos. Se han tipificado4 211 aislamientos realizados entre los años 1986 y 2004, y se observa que las cepas predominantes han cambiado de forma evidente (fig. 1). Se infiere, por tanto, que para poder controlar las cepas que circulan en la comunidad es imprescindible disponer de microorganismos viables capaces de crecer en cultivo, lo que supone un valor añadido de esta metodología.<img src="72v10n02-13141177fig6.jpg" alt="Figura 1. Resultados de la tipificación de las cepas de Bordetella pertussis."></img>Figura 1. Resultados de la tipificación de las cepas de Bordetella pertussis.<hr></hr>Correspondencia: M.G. Codina Grau. Servicio de Microbiología. Hospital Universitari Vall d'Hebron. Universitat Autònoma de Barcelona. 08025 Barcelona. España. Correo electrónico: <a href="mailto:mgcodina@vhebron.net" class="elsevierStyleCrossRefs">mgcodina@vhebron.net</a>" "pdfFichero" => "72v10n02a13141177pdf001.pdf" "tienePdf" => true "multimedia" => array:6 [ 0 => array:8 [ "identificador" => "tbl1" "etiqueta" => "TABLA 1" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "copyright" => "Elsevier España" "tabla" => array:1 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:1 [ "tablaImagen" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagenFichero" => "72v10n02-13141177fig1.jpg" "imagenAlto" => 666 "imagenAncho" => 975 "imagenTamanyo" => 114074 ] ] ] ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Iniciadores y sondas para la PCR en tiempo real" ] ] 1 => array:8 [ "identificador" => "tbl2" "etiqueta" => "TABLA 2" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "copyright" => "Elsevier España" "tabla" => array:1 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:1 [ "tablaImagen" => array:1 [ 0 => array:4 [ 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ISSN: 1576-9887

Revista Oficial de la Asociación Española de Vacunología (AEV) Vacunas tiene como objetivo contribuir a la difusión de los avances científicos en el campo de las vacunaciones preventivas de aplicación en seres humanos, tanto en el ámbito de la investigación básica como aplicada. Se pone especial énfasis en los aspectos relacionados con la planificación y evaluación (epidemiología de las enfermedades vacunables, desarrollo de programas de vacunaciones, evaluación de la eficacia, efectividad y eficiencia de las vacunaciones). La revista publica, en su versión en español y en inglés, Editoriales, Artículos originales, Artículos especiales, Revisiones, Estrategias y Programas vacunacionales. Hay también apartados sobre recensiones bibliográficas, noticias y congresos relacionados con su temática principal.

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