Se estudiaron 167 aislamientos de Candida spp., provenientes de diversas muestras clínicas procesadas en los hospitales de la Red de Micología de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires entre el 1 de septiembre de 2009 y el 31 de mayo de 2010.

Se incluyeron, además, 5 cepas de Candida spp., de identidad y sensibilidad conocidas, pertenecientes a la colección de cultivos del Hospital de Infecciosas Dr. Francisco J. Muñiz y del Hospital General de Agudos Dr. Juan A. Fernández.

Los aislamientos clínicos correspondieron a hemocultivos (42), catéteres (10), retrocultivos (4), líquidos de punción (10), hisopados de fauces (19), esputos (8), uñas (12), flujos vaginales (10), urocultivos (41), biopsias (7) y otros sitios (4).

Se utilizaron como control de calidad las cepas Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida krusei ATCC 6258, y las cepas de referencia Candida glabrata ATCC 90030 y Candida albicans ATCC 64548.

Todas las levaduras fueron identificadas con una probabilidad ≥ 90 % por medio del equipo API 20C Aux o API ID32C (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en el hospital de origen y se remitieron en un criovial con agua destilada estéril, donde se mantuvieron hasta ser utilizadas en el presente estudio.

Se analizaron en total 176 cepas: 32 C. parapsilosis, 29 Candida tropicalis, 28 C. glabrata, 27 C. krusei, 26 C. albicans, 24 Candida guilliermondii y 10 Candida dubliniensis.

Con el objetivo de confirmar la identidad y pureza del material recibido, todas las cepas se sembraron en agar cromogénico para levaduras CHROMagar Candida (CHROMagar Company Ltd., Francia) y se estudió la micromorfología de cada una de ellas en agar harina de maíz con Tween 80 (corn-meal agar, Oxoid, Reino Unido)13.

Se utilizaron como pruebas presuntivas adicionales para diferenciar entre C. albicans y C. dubliniensis crecimiento a 42°C, desarrollo en medio con NaCl 11 %, agar opacidad, agar tabaco y asimilación de D-xilosa26. Para confirmar los resultados de estos ensayos se realizó la identificación molecular de ambas especies por medio de PCR convencional, en la que se amplificó la región codificante completa del gen hwp1, que codifica una adhesina de superficie. Se utilizaron las siguientes secuencias de primers: Fwd 5′-GCTACCACTTCAGAATCATCATC-3′ y Rv 5′-GCACCTTCAGTCGTAGAGACG-3′. La detección de los productos amplificados se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. El tamaño de los fragmentos esperados era 941 pb (C. albicans) y 569 pb (C. dubliniensis)29.

• 1)

  Método de microdilución en caldo

  Se realizó el método de microdilución en caldo, según lo establecido en el documento M27-A35. Se utilizaron placas de microtitulación de 96 pocillos, fondo en U, estériles (Cellstar, Greiner Bio-One, Alemania). Los antifúngicos probados fueron AMB (Sigma, EE.UU.), FCZ (Pfizer, Reino Unido) y VCZ (Pfizer, Reino Unido); las soluciones madre de estas drogas fueron preparadas según lo indicado en el documento. No se incluyó en este estudio a la 5-fluorocitosina por ser una droga que no se comercializa en nuestro país. Como medio de cultivo se utilizó RPMI 1640 (Gibco, EE.UU.) con glutamina y sin bicarbonato de sodio, tamponado a pH 7 con ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) (Sigma, Argentina). El inóculo se preparó según se indica luego. Las placas se incubaron a 35°C y se leyeron visualmente a las 24 y 48h de incubación.

• 2)

  Vitek 2

  • a.

    Paneles de microdilución. Las tarjetas del sistema Vitek 2 AST YSO1 contienen una serie de diluciones seriadas de AMB (0,25 a 16μg/ml), VCZ (0,125 a 8μg/ml) y FCZ (1 a 64μg/ml), provistas por el fabricante. Estas se conservaron a 2-8°C hasta el momento de ser utilizadas.

  • b.

    Inóculo para microdilución y Vitek 2. Cada aislamiento se subcultivó en agar Sabouraud glucosado y se incubó durante 48h a 35°C, para asegurar su pureza y viabilidad. Se realizó luego un segundo repique en el mismo medio de cultivo, que fue incubado 24h a 35°C.

    El inóculo para realizar el método de microdilución (CLSI) se preparó a partir de una suspensión de colonias de levaduras crecidas durante 24h en agar Sabouraud glucosado en 5ml de solución fisiológica estéril. La suspensión se ajustó a una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de McFarland, y se realizó una dilución posterior 1/1000 en RPMI para obtener una concentración 1–5 × 103 UFC/ml (doble de la concentración final).

    El inóculo para el sistema Vitek 2 fue preparado a partir de una suspensión de levaduras en 3ml de solución fisiológica-agua destilada (1:1), hasta una turbidez equivalente a 1,8-2,2 de McFarland, utilizando el instrumento DensiCheck® (bioMérieux). Cada suspensión fue diluida apropiadamente, transfiriendo 280μl a un tubo con 3ml de solución fisiológica-agua destilada (1:1).

  • c.

    Siembra de las tarjetas AST YSO1. El inóculo preparado se dispensó en la tarjeta AST YSO1 a través de un tubo de poliestireno estéril. Los cassettes fueron colocados en el instrumento Vitek 2; las tarjetas se llenaron e incubaron en el equipo y luego se leyeron por espectrofotometría. El tiempo de incubación varió de 11,7 a 26,5h (promedio 15,5h), en función de la tasa de crecimiento en el pocillo libre de droga. Los resultados de CIM se expresaron en μg/ml, de acuerdo a lo procesado por el software del aparato.

Los resultados de CIM obtenidos por Vitek 2 se compararon con los obtenidos por el método de referencia leídos a las 24h y a las 48h de incubación.

Se consideró que hubo concordancia esencial (essential agreement, EA) cuando el resultado de la CIM obtenido por el sistema Vitek 2 no varió en más de dos diluciones (2 pocillos) respecto del obtenido mediante el método de referencia23,24.

Se utilizaron los puntos de corte propuestos por el CLSI para C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis y C. krusei (M27-S4)4 a fin de obtener los porcentajes de concordancia por categoría (categorical agreement, CA)23,24. El CLSI no ha establecido puntos de corte para AMB, ni para evaluar la sensibilidad de C. guilliermondii ni de C. dubliniensis, por lo que en estos casos solo se determinó el EA.

Las discrepancias entre los resultados fueron categorizadas como errores muy mayores cuando el método de referencia lo clasificaba como resistente y la CIM obtenida por el Vitek 2 como sensible; como errores mayores cuando el aislamiento era clasificado como resistente por el Vitek 2 y sensible por el método de referencia, y como errores menores cuando el resultado de uno de los métodos era sensible o resistente y el otro era sensible dosis dependiente (SDD).

Los resultados de cada ensayo se validaron en función de los datos correspondientes a las cepas control. Se observó una alta reproducibilidad con los dos métodos analizados.

Se corroboró la identificación original de las 176 cepas utilizadas en este estudio. En todos los casos, el color y el aspecto de las colonias en agar cromogénico y la micromorfología observada en el agar harina de maíz fue el esperado para cada especie. Todos los aislamientos de C. albicans y C. dubliniensis fueron confirmados mediante las pruebas fisiológicas, morfológicas y moleculares.

En la tabla 1 se detallan los resultados de CIM de FCZ, AMB y VCZ para las 176 cepas analizadas, ordenadas por especie, determinados con el sistema Vitek 2 y con el método de referencia leído a las 24h y a las 48h, y también los porcentajes de EA.

Se registró un EA entre el sistema Vitek 2 y la microdilución a las 24h y a las 48h > 90 % para todas las combinaciones de Candida y antifúngico analizadas, con la excepción de C. glabrata y VCZ (85,7 % y 64,3 % a las 24 y 48h, respectivamente) y C. krusei y FCZ a las 48h (70,3 %), aunque se debe mencionar que este dato carecería de relevancia clínica puesto que C. krusei es una especie con resistencia intrínseca a esta droga.

Los resultados globales de EA a las 24h fueron de 98,9 % en el caso del FCZ, del 98,3 % al evaluar la AMB y del 97,7 % para el VCZ; a las 48h los valores fueron, en el mismo orden, 94,3 %, 98,9 % y 93,7 %

La especie que presentó menor EA fue C. krusei, aunque superó el 90 % con AMB y VCZ. Frente al FCZ presentó también una concordancia > 90 % a las 24h, pero a las 48h alcanzó solo el 70,3 %.

Se compararon las CIM50 y CIM90 (concentraciones que inhiben al 50 % y al 90 % de los aislados, respectivamente) obtenidas por cada método con cada combinación especie-antifúngico, y se observó que estas se encontraban en un rango de ± 2 diluciones en todos los casos, lo que indica que los métodos analizados fueron comparables.

El tiempo promedio para obtener los resultados con Vitek 2 fue 15,5h (rango: 11,7-26,5h). Solo un aislamiento clínico de C. parapsilosis no creció lo suficiente en el sistema Vitek 2, por lo que fue eliminado del estudio.

En la tabla 2 se observan los resultados de CIM de FCZ y VCZ según los criterios del CLSI-M27-S4 para C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata y C. krusei. Se indica también el CA y los porcentajes de errores muy mayores, mayores y menores encontrados.

Al analizar todos los aislamientos en conjunto en relación con cada antifúngico, el CA fue de 92,2 % con FCZ y de 89,5 % con VCZ a las 24h, en tanto que a las 48h se registraron CA de 93,0 % y 80,7%, respectivamente.

El CA observado entre el sistema Vitek 2 y la microdilución a las 48h fue ligeramente menor que a las 24h, dato que coincide con lo informado en otros trabajos.

Se encontró solo 1 error muy mayor con C. parapsilosis (3,1 %) al analizar los resultados de FCZ a las 24h. No se observaron errores mayores en ninguna de las cepas analizadas en la evaluación del FCZ y el VCZ. Con el primero de los citados antifúngicos se detectaron 7,8 % de errores menores a las 24h y 6,1% de errores menores y 0,9% de errores muy mayores a las 48h; con el segundo, se registraron 10,5 % y 19,3 % de errores menores a las 24h y a las 48h, respectivamente.

Con respecto a C. guilliermondii, solo una de las 24 cepas analizadas presentó una diferencia mayor de 2 diluciones con FCZ a las 24 y a las 48h, y en otra cepa se registró una diferencia de 3 diluciones al comparar la CIM del Vitek 2 y la lectura realizada a las 48h. Con VCZ, todas las cepas presentaron valores de CIM dentro del rango esperado.

En C. dubliniensis se observaron valores de CIM en un rango de +/− 2 diluciones al evaluar FCZ y VCZ.

En el ensayo de la AMB, de las 176 cepas analizadas solo tres presentaron una CIM elevada con el sistema Vitek 2: dos de C. krusei (CIM = 2μg/ml) y una C. albicans (CIM = 8μg/ml). En todos los casos, por el método de referencia se obtuvieron CIM ≤ 1μg/ml a las 24h y 48h.

Con respecto al FCZ, se encontró 12,5 % de resistencia en C. parapsilosis; 7,2 % en C. glabrata; 10,3 % en C. tropicalis y 34,6 % en C. albicans. Para el VCZ, los niveles de resistencia fueron 6,9 % en C. tropicalis y 11,5 % en C. albicans. No se observó resistencia a esta droga en C. parapsilosis ni en C. krusei.

Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.