Durante años, la identificación bacteriana en el laboratorio de Microbiología Clínica se ha venido llevando a cabo, de manera rutinaria, de acuerdo a características fenotípicas de los microorganismos (morfología, estructura de la pared puesta de manifiesto mediante diferentes tinciones, capacidad del microorganismo para crecer en diferentes medios de cultivo y en distintas condiciones de atmósfera y temperatura, capacidad para degradar o utilizar mediante distintas vías bioquímicas sustratos diversos y, en algunos casos, características concretas de sensibilidad a ciertos antimicrobianos). Algunas de estas pruebas no han sufrido una evolución tecnológica significativa en décadas. Otras han evolucionado en lo relativo a la miniaturización de las baterías de pruebas y la automatización de su realización y lectura, y han experimentado mejoras sensibles en lo relativo al tiempo de respuesta.

Sin embargo, la mayor parte de las técnicas microbiológicas convencionales continúan basándose en principios y pruebas que requieren el crecimiento del microorganismo, lo que hace que la identificación pueda retrasarse desde horas hasta varias semanas tras la recepción de la muestra. Por otra parte, estas técnicas tienen limitaciones evidentes en cuanto a su aplicabilidad y fiabilidad cuando se trata de microorganismos que crecen con dificultad, o no crecen en absoluto en medios de cultivo, o que muestran una actividad bioquímica muy limitada.

Hace ya años, se empezaron a desarrollar diferentes metodologías, basadas sobre todo en técnicas genéticas, dirigidas a salvar estas limitaciones. Estas técnicas han supuesto una aportación importante en algunos aspectos, como fiabilidad de la identificación y, en algunos casos, diagnóstico directo a partir de la muestra sin cultivo previo. Sin embargo, estas técnicas solo han conseguido hasta el momento imponerse a las técnicas clásicas en algunos casos, debido a diferentes problemas como complejidad técnica, disponibilidad solo para ciertos microorganismos y relación coste/beneficio. En conjunto, la irrupción de las técnicas genéticas ha tenido una repercusión muy importante en virología clínica, mientras en bacteriología, micología y parasitología esta repercusión ha sido, por el momento, menor.

La espectrometría de masas (EM), en sus distintas modalidades técnicas, ha sido una técnica muy utilizada para la identificación de moléculas en diferentes ramas de la ciencia durante buena parte del siglo XX. Hasta la década de 1990 las proteínas se habían resistido a su análisis por espectrometría de masas debido fundamentalmente a la dificultad de generar iones a partir de estas moléculas grandes no volátiles. A finales de los ochenta se presentaron dos métodos que permitirían la ionización de las proteínas. Estos eran la ionización por pulverización eléctrica (electrospray ionization, ESI) y la desabsorción/ionización por láser con ayuda de una matriz (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI). A partir de ese momento la espectrometría de masas pudo utilizarse para estudios de proteínas.

La espectrometría de masas MALDI-TOF. Se trata de un método que, mediante la aplicación de energía laser a una muestra embebida en una matriz, consigue vaporizar e ionizar esa matriz, que eventualmente puede arrastrar en esa vaporización e ionizar a su vez a una muestra representativa de las proteínas contenidas en la muestra. Esas proteínas ionizadas son sometidas a aceleración en un campo eléctrico y a una migración a través de un tubo de vacío hasta un detector. El tiempo que transcurra desde su vaporización/ionización hasta su detección dependerá del cociente masa/carga (m/z) de esa proteína, y ese cociente m/z permitirá determinar la masa exacta de la proteína de manera extremadamente fiable. En el caso de los microorganismos, se genera de esta forma un perfil de proteínas con diferentes cocientes m/z, que se comporta como una huella dactilar, permitiendo identificar con gran fiabilidad al microorganismo a partir de dicho perfil.

La primera descripción del uso de la espectrometría de masas para la identificación bacteriana data de 1975. En aquella época el rango de masas estaba limitado a pequeñas moléculas, lo que restringía las aplicaciones de la EM a lípidos bacterianos1–4. Las proteínas tienen un orden de magnitud mayor, y su análisis por EM tuvo que esperar a la llegada de las técnicas suaves de ionización como el MALDI. A partir de ese momento el MALDI-TOF comenzó a utilizarse en la identificación bacteriana por grupos de investigación. En el 2004, se describió la primera base de datos completa para la identificación bacteriana, basada en el análisis de moléculas de superficie, pero no fue bien acogida para ser utilizada como identificación rutinaria, ya que necesitaba una estandarización muy rigurosa debido a la variación de las proteínas de superficie. Sin embargo, el cambio de matriz permitió la ionización de proteínas, fundamentalmente ribosómicas, más conservadas que las anteriores, lo cual se consideró más adecuado para la identificación rutinaria de bacterias, ya que parecía que las condiciones de cultivo no variaban los resultados de la identificación. A partir de ese momento se desarrollaron sistemas comerciales con bases de datos y programas de manejo sencillo, empezando a usarse la EM MALDI-TOF como un método rápido y fiable para la identificación bacteriana5. Se habían efectuado estudios parciales sobre su efectividad para la identificación de determinados microorganismos en condiciones controladas6–8, pero recientemente han empezado a aparecer numerosos trabajos relativos a su efectividad en la identificación de aislamientos clínicos, sometidos a esta prueba directamente desde los medios de cultivo rutinarios y sin condiciones especiales9.

Desde el punto de vista técnico, la incorporación de esta tecnología a la identificación rutinaria supone en muchos casos un aumento en la fiabilidad y en la rapidez de la misma, fundamentalmente cuando la identificación convencional depende de sistemas que requieren crecimiento del microorganismo, ya que este sistema permite la identificación en unos minutos. La mejora en tiempo y fiabilidad es relativamente modesta en aquellos casos en que la identificación convencional es aceptablemente rápida (18-24 horas como máximo) y fiable, lo cual es cierto que ocurre con buena parte de los patógenos más habituales. Supone, en cambio, una mejora importante en tiempo y fiabilidad cuando se trata de microorganismos en los que la identificación convencional requiere periodos de tiempo más largos, o cuando la fiabilidad de los métodos convencionales es menor. Ello afecta a un número no despreciable de especies, como numerosos bacilos gram negativos no fermentadores, bacilos gram positivos aerobios, bacterias anaerobias, y probablemente la mayor parte de las micobacterias, aunque con algunos de estos grupos la experiencia es todavía reducida.

Por otra parte, diferentes aportaciones técnicas van facilitando el procedimiento, ya inicialmente sencillo. Existen dos métodos de aplicación de la muestra: mediante extensión de la muestra directamente en la placa del espectrómetro de masas y adición sobre la misma de la matriz (aplicación directa), o mediante un paso previo de extracción proteica de la muestra con acetonitrilo y ácido fórmico. Hasta el momento, numerosos microorganismos se identificaban correctamente mediante el método de aplicación directa, mientras que los microorganismos más complejos (hongos, micobacterias, algunos anaerobios) requerían con frecuencia el paso de extracción, que aunque sencillo, introduce una complejidad algo mayor en la preparación de la muestra. Sin embargo, estudios recientes sugieren que la simple adición de 1ml de ácido fórmico a la muestra aplicada directamente en la placa mejora los resultados hasta cifras similares a las de la extracción convencional, simplificando de este modo este procedimiento cuando se considere necesario51.

En cuanto a la relación coste/beneficio, uno de los extremos más controvertidos ha sido el precio por identificación. Los equipos de EM tienen un coste de adquisición alto, pero en contrapartida el gasto en fungible es muy reducido. Otros sistemas de identificación, como es el caso de los sistemas de identificación bioquímica automatizados, también requieren la amortización de uno u otro modo (compra, alquiler, etc.) de equipos costosos, y el gasto en fungible es sensiblemente mayor. Seng et al9 han estimado que el coste de la identificación por MALDI-TOF (incluyendo consumibles, gastos de personal y amortización de equipos) estaría en torno al 25% del coste de la identificación bioquímica convencional (2,44 € frente a 4,6-13,9 €). Cherkaoui et al12 llegan a una conclusión similar, cuando afirman que en su estudio sobre 720 aislados, el coste de la identificación por MALDI-TOF, incluyendo el de la reidentificación por métodos convencionales de los aislados que la EM MALDI-TOF no consiguió identificar, sería como media del 25% del coste de la identificación bioquímica sistemática de todos los aislados, y el tiempo requerido, en torno al 20%. Un estudio reciente muestra asimismo que el sistema es coste efectivo en la identificación de levaduras42. A ello hay que añadir otra serie de cuestiones quizá menores pero que, en conjunto, influyen de forma importante en el flujo y la carga de trabajo del personal técnico. Es el caso de los subcultivos frecuentemente necesarios para descartar enteropatógenos en coprocultivos, que con esta metodología pueden descartarse directamente a partir de una sola colonia, o los tipos respiratorios y aislamientos en bacterias anaerobias, que esta tecnología hace en muchos casos innecesarios.

Un valor añadido, que podría convertirse en decisivo a la hora de propiciar la implantación definitiva de esta tecnología en los laboratorios de Microbiología Clínica, es su capacidad para la identificación de microorganismos directamente a partir de muestras biológicas o de hemocultivos.

Un área en la que puede ejercer también una influencia notable esta tecnología, y en la que probablemente se ha hecho poco hincapié hasta el momento, es la del reconocimiento de nuevos patógenos, o el cambio de consideración de algunas especies desde el punto de vista de su papel como patógenos.

Sobre todo en los primeros estudios, algunas discrepancias entre la EM y la identificación convencional derivaban de la incapacidad de la EM para diferenciar determinadas especies, o de la ausencia de algunas especies en las bases de datos del espectrómetro. Mientras las primeras limitaciones, con una notable trascendencia clínica, se mantienen en su mayor parte (identificación errónea de Shigella spp. como E. coli, identificación errónea de S. mitis como S. pneumoniae), las segundas se han ido haciendo menos frecuentes, a medida que las bases de datos se han ido ampliando en número de especies y número de espectros por especie. Actualmente, un porcentaje considerable de las discrepancias entre los métodos bioquímicos automatizados y la EM son debidas a que, bien por limitaciones de los métodos bioquímicos rutinarios para la identificación fiable de determinados géneros y especies (bacilos gram negativos no fermentadores, corinebacterias, bacterias anaerobias, etc.) o por insuficiencias o inexactitudes de sus bases de datos, algunos microorganismos se identifican simplemente a nivel de género, o si se hace a nivel de especie, es en muchas ocasiones con una fiabilidad relativa. Sin embargo, la disponibilidad de esta nueva metodología está permitiendo identificar con mayor fiabilidad estos aislamientos, lo cual está, en algunos casos, cambiando conceptos relativos al papel etiológico de diferentes microorganismos. Así, en el estudio de Mellmann et al17 sobre 80 aislamientos clínicos de bacilos gram negativos no fermentadores obtenidos en diferentes centros de Estados Unidos en 2004, la EM MALDI-TOF identifica aislamientos de especies que difícilmente hubieran podido ser identificadas por la metodología convencional, como Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas fulva, Pseudomonas savastanoi o Pseudomonas monteilii, todos ellos corroborados mediante secuenciación de rRNA 16S. En otros estudios11,16 se identifican con relativa frecuencia aislamientos de especies (Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei, P. monteilii, Pseudomonas corrugata) que no se recogen en las bases de datos de algunos de los sistema de identificación bioquímica más habituales, de modo que estos sistemas los informan a nivel de género, o los asimilan a especies con comportamientos bioquímicos similares (p.e. E. asburiae y E. hormaechei como Enterobacter spp. o E. cloacae, P. monteilii como P. putida o P. fluorescens). En otros casos, determinados géneros, pese a estar recogidos en las bases de datos de los sistemas de identificación bioquímica, en ocasiones no son capaces de identificarlos adecuadamente, de modo que se informa una identificación errónea (p.e. Klebsiella spp. en lugar de Raoultella ornithinolytica). Es cierto que en muchos casos, a la luz de los conocimientos actuales, se trata de diferencias con poca significación clínica14, desde luego menor que la de algunas de las carencias conocidas de la EM MALDI-TOF18, pero no cabe duda que una identificación más exacta es siempre deseable, y eventualmente puede llevarnos a cambiar los conceptos actuales sobre prevalencia y patogenicidad de determinadas especies.

A las carencias conocidas derivadas de la similitud en los proteomas de algunos microorganismos, ya citadas, hay que añadir déficits con indudable repercusión clínica en nuestro medio, como son la ausencia de microorganismos como Brucella, Francisella tularensis, B. anthracis o ciertas especies de Clostridium toxigénicos, en algunas de las bases de datos utilizadas para la identificación de microorganismos por EM MALDI-TOF.

Esta posibilidad de identificación fiable de especies hasta ahora infrecuentemente identificadas, o incluso de nuevas especies, se hace aún más explícita en el caso de las bacterias anaerobias como han demostrado recientemente La Scola et al25. Un estudio reciente realizado por nuestro grupo confirma esta impresión, aunque también demuestra que las bases de datos no son todavía óptimas en este área ya que, sobre 132 aislamientos de bacterias anaerobias estudiados, en los seis casos en que la EM MALDI-TOF no obtuvo una identificación fiable, se debía a que la especie, identificada posteriormente por secuenciación de rRNA 16S (2 Bacteroides cellulosilyticus, 1 Negativicoccus succinivorans, 1 Olsenella spp., 2 Bacteroides ureolyticus) no estaban incluidas en dichas bases de datos78. Algo similar ocurre con algunas especies de levaduras, como es el caso del grupo Candida ortho- meta- y parapsilosis, indiferenciables mediante la metodología bioquímica convencional, y que son en cambio diferenciadas con gran exactitud con esta metodología79.

La disponibilidad en un número amplio de centros de equipos que puedan identificar con fiabilidad todo este espectro de microorganismos de forma rutinaria puede, a medio plazo, obligarnos a modificar conceptos sobre patogenicidad y frecuencia de algunas de ellas.

Las posibilidades de la EM MALDI-TOF en Microbiología Clínica no se ciñen a la mera identificación, área en la que esa utilidad está ya contrastada. Estudios recientes abren nuevas perspectivas sobre su utilidad en otras áreas.

Un área en la que está empezando a ser aplicada es la de los estudios epidemiológicos. Con frecuencia, el perfil proteico que generan los microorganismos es más complejo que lo que el software desarrollado por los diferentes fabricantes necesita para llevar a cabo la identificación. Existirían así una serie de picos característicos de género o de especie, que podríamos denominar perfil primario, y que serían los principalmente valorados de cara a la identificación. Existirían además una serie de picos secundarios, más variables dentro de la especie, con lo que su utilidad para la identificación es menor, pero que podrían configurar un perfil secundario, cuya similitud fuera paralela a la proximidad genética de los microorganismos. Ello permitiría establecer niveles de proximidad entre los aislamientos equiparables a los que se establecen actualmente mediante diferentes técnicas genéticas (REP-PCR, PFGE, etc.). El planteamiento es atractivo ya que, de ofrecer resultados similares, se trataría de un método significativamente más rápido y barato que las técnicas genéticas vigentes. No obstante, se trata de un área en la que casi todo se mueve aun en el terreno de la hipótesis, ya que hay pocos estudios contrastados que lo avalen.

Entre 2000 y 2005 se publicaron varios trabajos que sugerían la posibilidad de diferenciar S. aureus sensibles y resistentes a meticilina mediante EM MALDI-TOF, e incluso de subtiparlos80–82. Sin embargo, no se han realizado trabajos posteriores con la metodología actual, que corroboren estos resultados y, sobre todo, que comparen los datos de proximidad entre aislamientos con los obtenidos por las técnicas genéticas de referencia. Del mismo modo, algunos autores han sido capaces de subtipar aislamientos de S. pneumoniae en función de diferencias en los perfiles proteicos83.

Del mismo modo Barbuddhe et al35, en 2008, demuestran no solo la eficacia de la EM MALDI-TOF para la identificación de 146 aislamientos de Listeria, sino que es capaz de establecer un subtipado completamente superponible al que se obtenía mediante PFGE.

Existen también algunos datos relativos a Salmonella. En 2003, Leuschner et al84 publican un estudio en el que, mediante EM-MALDI-TOF, son capaces de encontrar en 22 aislamientos de Salmonella pertenecientes a seis serotipos, perfiles específicos para los seis serovars estudiados (Enteritidis, Typhimurium, Virchow, Hadar, Derby y Anatum). Posteriormente, Dieckmann et al85 han sido capaces de clasificar 126 aislamientos de Salmonella, mediante MALDI-TOF, a nivel de subespecie. No deja de ser llamativo que estos autores consigan estos resultados con Salmonella, que es precisamente una de las enterobacterias que presentan mayores limitaciones para su identificación por EM-MALDI-TOF usando los parámetros convencionales de EM, sobre todo en cuanto a tamaño de proteínas detectadas (2-20kDa). Usando estos parámetros, se consigue una identificación muy fiable a nivel de género, pero la identificación por debajo de este nivel es muy poco fiable16. Estos autores establecen unos parámetros definidos de forma específica para su estudio, obteniendo unos perfiles proteicos más complejos. Probablemente este sea unos de los campos en que queda más trabajo por desarrollar. Es previsible que los parámetros que se usan para identificación sean útiles solamente en este aspecto, pero los estudios epidemiológicos requerirán del establecimiento de parámetros específicos, que abarquen mayores rangos de peso molecular y generen perfiles proteicos más complejos y con mayor capacidad de discriminación.

Existe también algún estudio que sugiere la posible aplicación de la espectrometría de masas al diagnóstico de enfermedades infecciosas, pero no a través de la identificación del microorganismo, sino a través de alteraciones generadas en la composición proteica de diferentes fluidos. Así, un estudio reciente sugiere la posibilidad de diagnóstico de la infección por H. pylori a través del estudio por EM-MALDI-TOF del peptidoma urinario. El peptidoma urinario de pacientes infectados por H. pylori presentaba dos proteínas con m/z de 6788 y 1912. Mientras la primera no pudo ser identificada, la segunda correspondía a una fracción de fibrinógeno que, por motivos no aclarados, está aumentada en la infección por H. pylori86.

Otro campo en que se han sugerido aplicaciones de la EM MALDI-TOF es el de la detección de factores de patogenicidad. Algunos estudios han demostrado la existencia de picos masa/carga en algunos perfiles que podrían relacionarse con la presencia de algunos de estos factores. Así, un estudio sobre más de 200 S. aureus productores de proteína de Panton-Valentine, y un número similar de cepas no productoras, ha sugerido la asociación entre la aparición de un pico m/z de 4.448Da y la producción de dicha leucocidina, con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 90,6%87. Sin embargo, estudios posteriores desmienten esta asociación88.

Uno de los campos en los que más actividad se ha registrado en los últimos meses es el de la detección de la resistencia a antimicrobianos. Se trata de un área en la que, desde el punto de vista teórico, la utilidad de la EM-MALDI-TOF se veía inicialmente problemática, ya que la obtención de un volumen de información con trascendencia clínica equiparable al que se obtiene con un antibiograma convencional tenía, a priori, grandes dificultades. Requeriría la detección de numerosísimas proteínas, con muy diferentes localizaciones dentro de la estructura bacteriana, producidas en cantidades muy variables y con un espectro de peso molecular muy amplio, pero en el que al mismo tiempo, pequeñas diferencias de peso molecular, asociadas a variaciones en un solo aminoácido, podrían generar perfiles de resistencia radicalmente distintos.

No obstante, ya hace algunos años aparecieron estudios que sugerían que la EM MALDI-TOF podía permitir detectar la resistencia a meticilina en S. aureus89–92. Sin embargo, se trataba de estudios con metodologías heterogéneas, bajo número de cepas, y esta capacidad de discriminación no terminó de quedar demostrada. Algún estudio reciente vuelve a sugerir esta posibilidad93, pero vuelve a tratarse de estudios con un número de cepas excesivamente corto (23 S. aureus sensibles a meticilina [MSSA] y 11 resistentes [MRSA] en este caso), por lo que los resultados son todavía escasamente fiables. Dada su trascendencia clínica y epidemiológica, la posibilidad de discriminar con fiabilidad entre cepas de MSSA y MRSA, en especial si fuera posible hacerlo directamente en hemocultivos, resulta enormemente atractiva, pero se requieren estudios prospectivos mucho más amplios, que establezcan una metodología bien estandarizada y determinen la sensibilidad y especificidad del método, y la posibilidad de que desplace al menos en parte a los métodos actualmente aceptados.

Algunos artículos recientes avalan la posibilidad de usar la EM MALDI-TOF para diferenciar entre Bacteroides fragilis portadores y no portadores del gen cfiA, que codifica una carbapenemasa de clase B (metalo β-lactamasa), basándose en que las cepas productoras y no productoras son genotípicamente distintas94,95. Sin embargo, en este caso no se trata de estudios de sensibilidad propiamente dichos, puesto que lo que permite la EM es deducir la presencia o no de este gen a partir de la pertenencia de la cepa a una u otra división, que tienen huellas proteómicas distintas.

Los estudios de sensibilidad propiamente dichos están empezando a ponerse en marcha con otra estrategia. Aunque algunos estudios iniciales parecían detectar la presencia de la β-lactamasa en el perfil proteico como un pico m/z de en torno a 26-27.00096, en general, lo que se busca es la huella proteómica derivada de la hidrólisis de antimicrobiano, que será distinta de la que deja el antimicrobiano intacto, y por tanto revela la existencia de enzimas capaces de producir esta hidrólisis97. Así, un estudio publicado este mismo año encuentra que este método es capaz de detectar la producción de carbapenemasas en enterobacterias y Pseudomonas aeruginosa con una sensibilidad y especificidad superiores al 95%98.

En relación con los estudios de sensibilidad a antifúngicos, también Marinach et al99 proponen en 2009 una metodología para determinar la sensibilidad de C. albicans a fluconazol, basándose en el espectro generado por el microorganismo creciendo a diferentes concentraciones de antifúngico.

Además, se han ideado otras estrategias sobre las que están apareciendo diferentes estudios. Diversos estudios están empezando a plantear la utilización de la EM MALDI-TOF pero no sobre péptidos, sino sobre fragmentos genómicos y sobre amplificados con dos aplicaciones:

Como método de identificar mutaciones asociados a resistencia a antimicrobianos

Como método de tipado con una fiabilidad aparentemente muy alta.

Ya hace algunos años se empezó a usar este planteamiento en diversos aspectos diagnósticos, tanto en bacteriología como en virología. Así, en 2005, algunos autores, mediante polimorfismo de nucleótidos simples y EM MALDI-TOF, consiguen caracterizar mutaciones en las subunidades A de las topoisomerasas de Neisseria gonorrhoeae resistentes a fluoroquinolonas con una excelente correlación con los métodos de secuenciación100 y en 2007, con una metodología similar identifican mutaciones asociadas a resistencia a fluoroquinolonas en S. pneumoniae101. En 2006 se usó asimismo la combinación de amplificación y MALDI-TOF para caracterizar BLEEs del grupo SHV, aparentemente con buenos resultados102. Varios estudios publicados entre 2004 y 2006 demostraron asimismo que la EM MALDI-TOF de amplificados permitía detectar mutantes YMDD, resistentes a lamivudina, del virus de la hepatitis B, tanto cuando constituían una población mayoritaria como cuando constituían subpoblaciones tan reducidas como un 5%, dentro de una población mixta103–105. Posteriormente, un estudio de 2010 parece confirmar los estudios preliminares para detectar mutaciones asociadas a resistencia en S. pneumoniae, en este caso en relación con mutaciones en las PBP106.

En este aspecto del uso de la EM MALDI-TOF no sobre proteínas, sino sobre fragmentos genómicos o sobre amplificados, la tecnología más desarrollada en este momento es la basada en el polimorfismo de nucleótidos simples (single-nucleotide polymorphisms, SNP), determinado a través de un método de extensión de base simple (single-base extension) combinada con EM MALDI-TOF (iPLEX Gold, Sequenom, San Diego [CA], EE.UU.). Se trata de un método que, mediante PCR múltiple, amplifica determinadas áreas del genoma que pueden presentar polimorfismos y determinados genes binarios, analizando después el conjunto de amplificados obtenidos y su tamaño mediante MALDI-TOF. Este método se ha demostrado en estudios recientes como un método prometedor para el tipado de MRSA107 y para la identificación y tipado epidemiológico de Mycobacterium tuberculosis complex.108, así como para detección de mutaciones asociadas a resistencia a antivíricos en virus de la hepatitis B109 y para la detección de variantes del virus con una alta sensibilidad110.

La EM, por sus características de rapidez y fiabilidad, está llamada a convertirse en una técnica básica de identificación bacteriana y micológica en los laboratorios de Microbiología Clínica, desplazando en una parte muy importante a las técnicas rutinarias actuales. Aunque las técnicas genéticas probablemente sigan siendo la referencia, su uso se verá reducido en el aspecto de la identificación a partir de colonia a las muestras en las que no se consiga una identificación fiable mediante EM. Aunque se ha discutido mucho sobre la capacidad de esta técnica para identificar determinados grupos de microorganismos (bacterias anaerobias, hongos filamentosos), cada vez existen menos dudas respecto a que el problema principal, en estos casos, deriva fundamentalmente de carencias en las bases de datos, y no se debe a limitaciones de la EM para generar espectros proteicos característicos. Estas limitaciones, en general, se van subsanando con rapidez.

La aplicación de la EM MALDI-TOF sobre muestra directa, hoy por hoy, se restringe fundamentalmente a los hemocultivos positivos en los que, una vez se va estableciendo un protocolo homogéneo, los resultados son muy positivos. Su uso en orina, aunque factible en orinas con alto recuento bacteriano, probablemente va a ser más difícil de integrar en la rutina del laboratorio al menos a corto plazo.

Sin embargo, otras aplicaciones se van abriendo paso. Así, su uso en epidemiología, como alternativa a la epidemiología molecular, es muy prometedor, y se empiezan a plantear alternativas para determinar la producción de factores de patogenicidad y orientar la sensibilidad a los antimicrobianos aunque, sobre todo en este último caso, estamos probablemente todavía lejos de que esta tecnología pueda desplazar a los métodos actuales.

Por último, la tecnología que asocia diferentes métodos de amplificación génica y minisecuenciación a la EM MALDI-TOF empieza a mostrarse como una tecnología prometedora en diversos aspectos del diagnóstico microbiológico, incluido un campo, como el de la virología, que hasta ahora le estaba prácticamente vetado.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.