Los virus transmitidos por artrópodos (arbovirus) y los transmitidos por roedores (robovirus) o por otros animales se engloban bajo el epígrafe «virus transmitidos por vector» (VTV). La mayoría de los VTV no utilizan a los humanos en su ciclo de vida, aunque algunos de ellos pueden infectarlo y causar enfermedad de distinta gravedad, que abarca desde la infección asintomática al síndrome febril, acompañado o no de enfermedad neurológica, hepática, renal, pulmonar y/o hemorrágica. Son 3 los principales virus autóctonos transmitidos por vector que producen enfermedad humana en nuestro país: el virus Toscana (TOSV), el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV) y el virus West Nile (WNV). Los 3 se han asociado a enfermedad neurológica aguda y son transmitidos por vectores con una distribución geográfica específica en nuestro territorio (flebótomos, ratón común y mosquitos Culex, respectivamente). Existen otros VTV adaptados a nuestra especie capaces de producir ciclos urbanos de transmisión; se trata de los virus dengue (DENV), de la fiebre amarilla (YFV) y chikungunya (CHIKV), que todavía no circulan en nuestro país pero de los que existe un riesgo potencial de asentamiento debido a su presencia a través de viajeros infectados procedentes de zonas endémicas (tabla 1) y a la circulación de una de las especies de mosquito que le sirven como vector, Aedes albopictus, ampliamente distribuida por la zona del mediterráneo, incluida las Islas Baleares. Un tercer grupo de los VTV engloba a los de alto riesgo biológico, productores de fiebres hemorrágicas, cuya sospecha supone una situación de alerta debido a la gravedad de la patología que producen siendo capaces de transmitirse por contacto interpersonal.

Los cambios introducidos por nuestra especie en los ecosistemas que ocupan estos virus, los cambios en el clima, y la velocidad y la frecuencia con la que viajan actualmente las personas y las mercancías están favoreciendo la rápida dispersión de los VTV, lo que provoca frecuentes amenazas a la salud pública.

Antes de entrar en las particularidades del diagnóstico de las infecciones por los VTV hay que hacer hincapié en las consecuencias que puede tener para la salud pública la detección de un virus de elevado riesgo biológico (fiebre hemorrágica viral) o que pueda iniciar un ciclo de circulación autóctona en aquellas regiones en las que está presente su vector de transmisión.

En caso de sospecha de fiebre hemorrágica viral en España se debe contactar inmediatamente con las autoridades sanitarias y con el Laboratorio Nacional de Referencia (Centro Nacional de Microbiología [CNM], Instituto de Salud CarlosIII), que orientarán sobre la toma, procesamiento y envío de las muestras al laboratorio para su diagnóstico. Recientemente se ha aprobado un Protocolo de vigilancia de las fiebres hemorrágicas víricas (FHV); así, cuando se detecte un caso probable de FHV, el servicio de Vigilancia de la comunidad autónoma lo comunicará de forma urgente al Centro de Coordinación de Alertas y Emergencias Sanitarias (CCAES) del Ministerio de Sanidad y Servicios Sociales e Igualdad y al Centro Nacional de Epidemiología. El CCAES valorará junto con las comunidades autónomas afectadas las medidas a tomar y si fuera necesario su notificación al Sistema de Alerta y Respuesta Rápida de Unión Europea y a la Organización Mundial de la Salud, de acuerdo con el Reglamento Sanitario Internacional de 2005.

Un laboratorio de microbiología debe asumir también la responsabilidad de notificar cualquier hallazgo de un virus importado en un paciente que puede haber iniciado un ciclo de transmisión autóctona en un área en la que está presente su vector de transmisión (DENV, CHIKV) y de los casos de infección por los VTV autóctonos para establecer las medidas de control de la infección. La confirmación de los resultados por parte del Laboratorio Nacional de Referencia es, además de obligatoria, de crucial importancia para las actividades de vigilancia microbiológica a escalas nacional e internacional. Finalmente, si el laboratorio no dispone de la metodología de diagnóstico del patógeno sospechado, debe enviar muestras al Laboratorio Regional o Nacional de Referencia, que se hará cargo del diagnóstico etiológico y de la notificación de los resultados. El Laboratorio Nacional de Referencia apoyará a los laboratorios de microbiología que lo demanden no solo en estos casos, sino también transfiriendo metodología para el diagnóstico de los VTV y facilitando el control de calidad de los reactivos utilizados.

En el diagnóstico de los VTV es imprescindible conocer información sobre posibles viajes realizados por el paciente, así como conocer antecedentes en la exposición a animales. Esta información orienta al laboratorio en la selección de análisis para identificación del agente causal, así como en la interpretación de los resultados de diagnóstico obtenido. Otra información muy preciada consiste en conocer la fecha de inicio de los síntomas, dado que orientará en la selección del tipo de métodos, directos o indirectos, a emplear en el laboratorio.

El papel del microbiólogo en los hospitales es esencial para reforzar no solo el diagnóstico, sino la vigilancia y el control de estas enfermedades. Dada la importancia de la vigilancia microbiológica de las enfermedades víricas transmitidas por vector, el CNM ha puesto en marcha un programa que no tiene coste para el hospital, basado en el estudio de los casos sospechosos.

La muestra de elección es el suero, y las muestras adicionales que resultan apropiadas para la investigación de los VTV se seleccionarán en función del síndrome clínico observado (tabla 2). El estudio de muestras tomadas en la fase convaleciente puede ayudar en algunos casos a establecer un diagnóstico.

El suero debe tomarse en fase aguda de la enfermedad, en los primeros días tras el inicio de los síntomas (hasta el quinto a séptimo día), y en fase convaleciente 10 a 14días después. El LCR debe tomarse en las primeras 72h tras el inicio de los síntomas y enviarse inmediatamente al laboratorio para su procesamiento.

Es imprescindible una buena conservación de las muestras hasta su análisis (a 4°C si se tarda en procesar menos de 48-72h y a –70°C si el proceso se demora más), con objeto de asegurar la infectividad de las partículas víricas y la integridad del ARN viral. Las muestras destinadas a estudios serológicos pueden conservarse a –20°C.

El aislamiento en el laboratorio de los VTV a partir de las muestras clínicas se puede realizar mediante técnicas de cultivo celular en los laboratorios con instalaciones de seguridad biológica adecuados para el virus sospechado. Así, el cultivo de los WNV, LCMV, DENV y CHIKV analizados en este documento requiere disponer de un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad (tablas 1 y 3). Sin embargo, la manipulación de muestras clínicas que no implique la replicación de los virus se puede realizar en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad, con prácticas adecuadas. El aislamiento del virus en cultivo, aparte de su interés diagnóstico permite realizar estudios de caracterización biológica, antigénica, molecular y genética de los nuevos virus que hayan sido detectados.

En el caso de emplear muestra de suero o sangre es necesario que haya sido recogida, en general, durante los 5-7primeros días de inicio de los síntomas. El LCR no es una muestra en la que sea fácil recuperar virus en cultivo dadas las bajas cargas virales y la escasa vida media de los virus envueltos en esta muestra biológica. Para alguno de los virus mencionados, como el LCMV, el rendimiento del cultivo en líneas celulares es muy bajo.

Los VTV son capaces de infectar y producir efecto citopático (ECP) en varias líneas celulares de vertebrados, como: Vero (riñón de mono verde africano), HeLa (tumor uterino humano), BHK-21 (riñón de hámster), CV-1(riñón de mono Cercopithecus aethiops) y LLC-MK2 (riñón de mono Rhesus). También se pueden aislar los VTV en ratones inoculados intracerebralmente. Para el aislamiento de los virus transmitidos por mosquitos (WNV, DENV, YFV y CHIKV) se utilizan además líneas celulares de mosquito, como son las líneas C6/36 HT (derivadas de Ae.albopictus), AP61 (derivadas de Ae.pseudoscutellaris), y para DENV, además, se utiliza la línea TRA-284, derivada de Toxorhynchites amboinensis, entre otras (tabla 3). Tras la detección de ECP, la identificación específica del virus se realiza por técnicas de biología molecular, por pruebas de neutralización del crecimiento viral o por inmunofluorescencia (IF) usando anticuerpos específicos, aunque esta última técnica tiene limitaciones en cuanto a su posible especificidad. A continuación se apuntan algunas características que han de ser consideradas ante la identificación del agente etiológico empleando técnicas inmunológicas:

Las tecnologías basadas en el reconocimiento de un componente viral (proteína o ácido nucleico) o de la partícula del virus en su totalidad son útiles en etapas tempranas de la infección, antes de que la respuesta inmune haga desaparecer las partículas virales, por lo que la fecha de la toma de muestra, principalmente suero, ha de ser, en general, entre los 5-7 primeros días de inicio de los síntomas.

Los métodos basados en la detección de antígeno presentan la ventaja de permitir obtener un resultado rápido. Como contrapartida, estos resultados pueden ser difíciles de interpretar debido a la reactividad antigénica cruzada que existe entre las especies del mismo género viral como se ha comentado anteriormente, interpretación de resultados que se complica si distintas especies del mismo género viral circulan en la misma zona geográfica (tabla 1).

Las técnicas de detección de antígeno basadas en métodos inmunohistoquímicos han sido especialmente útiles en los casos en que no se ha podido establecer el diagnóstico por otras vías o para demostrar la infección viral en síndromes complejos, como el síndrome visceral tras vacunación frente al YFV o en infecciones asociadas a trasplante de órganos por el LCMV o por el WNV.

El desarrollo y la comercialización de métodos de detección de antígeno de los VTV se han centrado principalmente en el DENV y los VTV neurotropos americanos (WNV, SLEV, virus de la encefalitis equina del este [EEEV], virus de la encefalitis equina venezolana [VEEV] y virus de la encefalitis equina del oeste [WEEV]). En Estados Unidos se comercializa un método para la vigilancia en mosquitos de la circulación de los VTV neurotropos. El método usa una tira recubierta con anticuerpos frente a los WNV, SLEV y VEEV, y es rápido y de fácil manejo, aunque menos sensible que el uso de métodos moleculares.

Para la detección de antígeno del WNV también se ha desarrollado un sistema dirigido a la proteínaE basado en el reconocimiento a partir de un nanobiosensor electroquímico utilizando una membrana de alúmina, y se ha observado que el límite de detección lo hace comparable a las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Sin embargo, actualmente, tanto para la detección del DENV como para la de otros flavivirus, el antígeno NS1 suele ser la diana de elección, por tratarse de un antígeno soluble que generalmente se encuentra de forma abundante durante la infección. En este caso, además, los ensayos suelen generar resultados específicos, con niveles muy bajos de reactividad cruzada entre los diferentes flavivirus. En el caso de la detección de la proteína NS1 del DENV puede realizarse desde el día1 hasta el día11 de inicio de los síntomas, y están disponibles numerosos equipos comerciales basados en técnicas inmunoenzimáticas así como inmunocromatográfícas (tabla 4).

Las técnicas moleculares basadas en la detección del genoma viral han supuesto un enorme avance también en el diagnóstico de las infecciones producidas por los VTV, dada la rapidez en la obtención de resultados, su especificidad y su sensibilidad. Son consideradas de elección en el diagnóstico rápido en los primeros días de la enfermedad, aunque han de ser complementadas con los resultados procedentes de los métodos serológicos, dada la corta viremia que caracteriza a la mayoría de las infecciones producidas por este grupo de virus.

Se han desarrollado numerosos métodos basados en la PCR, tanto en el formato PCR convencional o tiempo final como en el formato PCR en tiempo real. Para ambos tipos de métodos se requiere un paso de transcripción reversa, dado que se trata de virus con genoma de ARN. Este paso se puede acoplar a la PCR (one-step) o bien puede realizarse independientemente, en una reacción previa a la reacción de amplificación genómica. La PCR en tiempo real comienza a desplazar a la RT-PCR convencional, que muchas veces requiere la aplicación de una PCR secuencial (PCR anidada o nested-PCR) para alcanzar una sensibilidad similar, lo que comporta más carga de trabajo, un incremento del tiempo necesario hasta la obtención de los resultados y un mayor riesgo de contaminaciones.

Hay disponibles métodos comerciales de PCR en tiempo real para los WNV, DENV, CHIKV, JEV, hantavirus y virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, entre otros. La mayoría de ellos utilizan sondas de hibridación TaqMan como sistema de marcaje específico del producto amplificado; sin embargo, la mayoría de los métodos desarrollados siguen siendo técnicas «caseras» que ofrecen resultados óptimos de sensibilidad y especificidad. Aunque para el diagnóstico en el laboratorio la PCR en tiempo real se ha impuesto a las clásicas técnicas de PCR, para la realización de estudios de epidemiología molecular y variabilidad genética es preferible la utilización de la PCR convencional que permite la obtención de fragmentos genómicos de mayor tamaño portadores de información filogenética de contrastada calidad.

Otras estrategias metodológicas desarrolladas para la detección de genoma de los VTV utilizan técnicas de amplificación isotérmica tales como Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Transcription-Mediated Amplification (TMA) y Retrotranscription Loop-mediated isothermal AMPlification (RT-LAMP). Las técnicas NASBA y TMA consisten en la amplificación del genoma durante un proceso isotérmico, a una temperatura entre 41 y 60°C, en presencia de 3 enzimas: transcriptasa, polimerasa y RNAasa. La técnica LAMP consiste también en un proceso isotérmico en el que la síntesis de nuevas cadenas se consigue utilizando una enzima con capacidad de desplazar la hebra de ADN y 4 cebadores cuyo diseño permite la obtención de una horquilla o loop de ADN. Alguna de esta metodología se ha desarrollado para detectar los WNV, DENV y CHIKV. En Estados Unidos se ha comercializado una TMA para el análisis de la presencia de genoma del WNV en muestras de donantes de sangre y de órganos, y recientemente esta metodología se está ensayando para la detección del DENV en donantes de sangre en Puerto Rico. En la tabla 5 se muestra una selección de métodos de detección de ácidos nucleicos para los virus mencionados en el documento.

Desde pocos días después del inicio de los síntomas empieza a ser detectable una respuesta de anticuerpos específicos. En un primer momento son del isotipo IgM, anticuerpos que son de rápida aparición (normalmente entre 5 y 7días desde el comienzo de la sintomatología) y, en general, de corta duración (2-4meses), seguidos por anticuerpos del isotipo IgG, que permanecen detectables durante toda la vida. Para muchos de los VTV, dado su corto periodo de viremia, la serología basada en la detección de la respuesta de anticuerpos es el método diagnóstico de elección.

La muestra más adecuada para hacer el diagnóstico serológico es el suero, aunque en ocasiones se puede realizar sobre muestra de plasma. La detección de IgM es el marcador elegido para el diagnóstico de una infección reciente, en tanto que la respuesta IgG aislada es un indicador de una infección pasada, o de vacunación en su caso, siendo el marcador de aplicación para estudios de seroprevalencia. Cuando las muestras son tomadas muy cerca del comienzo de la enfermedad es frecuente la ausencia de respuesta detectable de IgM, por lo que es preciso analizar otra muestra tomada 7-10días después; analizando las muestras pareadas se confirma la infección demostrando seroconversión de IgM o IgG específica. La respuesta IgM puede ser detectable varios meses después de la infección por los TOSV, WNV, DENV y CHIKV, lo que origina dificultades para interpretar el resultado como una infección aguda. Los flavivirus muestran un alto grado de reacción cruzada, y la intensidad de esta reactividad depende del grado de purificación del antígeno empleado, lo que supone que con frecuencia se puedan detectar reactividades múltiples. En la interpretación de los resultados serológicos frente a los flavivirus además ha de considerarse el antecedente de vacunación frente a alguno de ellos (JEV, Tick-borne encephalitis virus [TBEV] y YFV). En estas situaciones son especialmente útiles los ensayos de avidez de IgG, de aplicación para el WNV y el DENV. De cualquier forma, para la caracterización última de la respuesta serológica específica es preciso realizar la técnica de neutralización tanto para los flavivirus como para el TOSV y los alphavirus, considerando en este último grupo de virus que tanto el CHIKV como el ONNV pueden ocasionar síndromes articulares. La técnica de neutralización se debe realizar en laboratorios expertos y adecuadamente equipados en términos de seguridad biológica, dado el nivel 3 de riesgo biológico en el que se incluyen la mayoría de estos virus (tablas 1 y 3).

Dado el tropismo neurológico de alguno de los VTV, la demostración de producción intratecal de anticuerpos es una herramienta aplicable para confirmar la infección del sistema nervioso central por los WNV, TOSV, LCMV, TBEV, DENV y para el CHIKV.

Como ya se ha comentado, la especificidad de los ensayos depende en gran medida del grado de purificación de los antígenos empleados. Básicamente, para el diagnóstico serológico de las infecciones por estos virus se emplean tanto técnicas de IFI, en general empleando células infectadas por virus, como de ELISA, con extractos de células infectadas, o más adecuadamente antígenos recombinantes. El uso de antígenos recombinantes es la aproximación más adecuada para conseguir minimizar las reactividades heterólogas, aunque no las evita totalmente.

Existen numerosos ensayos disponibles comercialmente para identificar la respuesta serológica frente a algunos de estos virus, basados en diferentes metodologías (IFI, ELISA, inmunocromatografía IC). Se carece sin embargo de métodos comerciales para otros muchos, entre ellos el LCMV; en estos casos se pueden producir reactivos caseros utilizando antígenos obtenidos en laboratorios especializados y adecuadamente equipados. En la tabla 6, que no pretende ser exhaustiva, se presenta una lista de estos ensayos que pueden estar disponibles en los laboratorios españoles. Los fabricantes de algunos de estos ensayos contemplan su aplicación no solo a la determinación de anticuerpos en muestras de suero o plasma, sino a la caracterización de la avidez de IgG específica y a la confirmación de producción intratecal de anticuerpos, mediante el ensayo de muestras de LCR. Un aspecto importante para seleccionar el método más adecuado para cada laboratorio es conocer las características de los ensayos disponibles, mediante estudios de validación realizados en laboratorios experimentados.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.