El desarrollo de terapias frente a la isquemia cerebral se basa en el concepto teórico de la posibilidad de actuación precoz sobre un volumen de tejido cerebral sometido a una reducción de flujo sanguíneo en el que no se ha producido un daño irreversible de sus células, y en el que se puede potencialmente restablecer su homeostasis bioquímica y neurofisiológica6. El problema es cómo identificar espacial y temporalmente ese volumen de tejido sometido a condiciones de penumbra isquémica, cuya definición precisa sigue debatiéndose en la actualidad. La medición del flujo sanguíneo cerebral (FSC) en el tejido nervioso no es suficiente por sí misma para identificar la zona de tejido en condiciones de penumbra. Estudios realizados en primates demostraron que el valor umbral de flujo sanguíneo capaz de causar una alteración metabólica y funcional crítica de las neuronas se sitúa en un rango entre 10 y 15ml/100g/min, y que el daño del tejido depende no sólo de la intensidad de la disminución del FSC sino también de su duración y de otras variables tanto anatómicas (patrón de circulación colateral) como fisiológicas (temperatura tisular, el nivel de glucosa)7,8. Los estudios metabólicos realizados en modelos experimentales de isquemia cerebral han establecido una definición dinámica de la penumbra isquémica, que sería aquella zona de tejido con un FSC reducido y un consumo aumentado de glucosa que se metaboliza anaeróbicamente9. Los estudios histológicos siempre muestran un límite preciso entre la zona de tejido con un daño estructural irreversible -zona infartada o core- y el tejido cerebral sin alteraciones estructurales, no identificando ninguna franja intermedia correspondiente a la zona de penumbra10. Sin embargo, la identificación del volumen de tejido potencialmente salvable en pacientes que han sufrido un daño isquémico es muy difícil de realizar con precisión. Se ha recurrido a secuencias específicas de resonancia magnética (RM) para diferenciar la zona de penumbra de la zona infartada11,12. Considerando que el fallo de los gradientes iónicos transmembrana conducen a un swelling o hinchazón celular rápido y a la consiguiente reducción del espacio extracelular y de la movilidad de las moléculas de agua que lo ocupan, se ha definido la zona infartada como aquella que muestra una perfusión reducida y una alteración de la señal en las secuencias potenciadas en difusión13. La zona de penumbra se ha diferenciado del tejido infartado por presentar un mismatch o “desajuste” entre ambas secuencias de RM, es decir por mostrar una perfusión reducida pero sin asociar alteraciones de señal en las imágenes potenciadas en difusión14. Este concepto “neurorradiológico” de la penumbra no puede equipararse de forma directa con el concepto metabólico definido mediante técnicas de autorradiografía de glucosa marcada en modelos experimentales, y por otro lado, el correlato fisiopatológico celular de una alteración de señal en los estudios de RM potenciados en difusión no se conoce con exactitud. Se han observado casos en los que la zona identificada como infartada en los estudios de RM puede revertirse parcial o totalmente horas después de la oclusión tras una reperfusión inducida o espontánea. Esto sugiere que las alteraciones precoces en el coeficiente de difusión aparente medido en las secuencias de difusión no permiten definir de forma infalible el destino de un área isquémica15–18. Por otro lado, se ha observado que una reducción de flujo en imágenes de RM de perfusión no supone siempre una alteración del aporte tisular de oxígeno19. Por ello, la definición de la zona de penumbra en los estudios experimentales no puede extrapolarse directamente a los estudios clínicos; asimismo, la delimitación espacio-temporal del volumen de tejido potencialmente recuperable tras un ictus puede ser muy variable en cada paciente por múltiples factores anatómicos, fisiológicos y biomoleculares, lo que no permite una reproducibilidad inmediata de los resultados terapéuticos obtenidos en condiciones de laboratorio.

Frente al concepto tradicional de que las neuronas sometidas a un déficit del aporte de oxígeno y sustratos energéticos mueren exclusivamente por necrosis, actualmente se sabe que en la isquemia cerebral coexisten la muerte por necrosis y la muerte por apoptosis –siendo esta última además la predominante en la zona de penumbra20. El descubrimiento de que la muerte por apoptosis se produce mayoritariamente a las 24-48h del daño isquémico21 abrió la posibilidad de nuevas dianas terapéuticas. Estudios experimentales realizados en ratones genéticamente modificados y deficientes en caspasa 3 (un tipo de enzima implicada en la via final de apoptosis) o en receptor del factor de necrosis tumoral (una superfamilia de receptores que regulan la activación de caspasas) han mostrado que estos animales son más resistentes al daño isquémico. Sin embargo, estos hallazgos no se han corroborado en otros modelos de isquemia, probablemente por la contribución en el proceso de apoptosis de otras cascadas bioquímicas caspasa-independientes tales como las activadas por nucleasas mitocondriales22,23 o por ciertas proteasas de tipo no-caspasa24. De hecho, el papel de las endonucleasas mitocondriales en la apoptosis está cobrando cada vez más importancia y se están buscando dianas mitocondriales para bloquear el swelling mitocondrial que precede a la ruptura de estas organelas y la liberación al citosol de sus enzimas apoptóticas. El principal foco de atención es el poro de transición de la membrana mitocondrial, un canal ensamblado entre la membrana interna y la externa de la mitocondria cuya apertura puede bloquearse con fármacos como la ciclosporina A, con la que se han obtenido resultados muy prometedores tanto en daño cerebral traumático como isquémico25,26.

Clásicamente los estudios de isquemia cerebral se han focalizado en el efecto de la isquemia sobre las neuronas. Sin embargo, se está reconociendo en las últimas dos décadas el papel esencial desempeñado por las células gliales tanto en la progresión como en la recuperación del daño cerebral isquémico27. Actualmente también está en duda el clásico dogma de la resistencia superior de las celulas gliales a las condiciones de isquemia. Aunque los estudios iniciales realizados in vitro sobre cultivos de celulas gliales mostraron que los astrocitos eran comparativamente más resistentes al daño isquémico que las neuronas28, estudios realizados en condiciones in vivo han mostrado que la muerte de los astrocitos puede incluso preceder a la muerte neuronal10. Por otro lado, tras identificarse en los años 70 la compleja organización tridimensional de los astrocitos a través de uniones intercelulares de tipo gap, no está claro todavía si la comunicación entre células de glia a través de estas uniones resulta beneficiosa o perjudicial tras un daño isquémico. Algunos investigadores sugieren que las uniones de tipo gap pueden propagar y amplificar el daño, y proponen que este mecanismo podría explicar la muerte neuronal observada en zonas lejanas al territorio vascular ocluido29,30. Sin embargo, otros estudios recientes realizados in vivo respaldan el efecto beneficioso de las uniones gap en la supervivencia de las neuronas tras un daño isquémico. Ratones genéticamente deficientes en conexina-43 (proteína elemental en la estructura de las uniones gap) sufren infartos de mayor volumen que los ratones normales31–33. Por otro lado, la causa más frecuente de muerte en los pacientes que han sufrido un infarto maligno es el edema citotóxico o celular, que se desarrolla fundamentalmente en los astrocitos, por ser éstas las células encargadas del aclaramiento de K+ y glutamato del medio extracelular34,35. Recientemente ha surgido una gran expectación en torno al papel desempeñado por la acuaporina 4 (AQP4) -el principal canal de intercambio de agua en los astrocitos- tras observarse que el grado de edema asociado a un infarto cerebral es significativamente menor tanto en ratones deficientes en AQP436 como en aquellos carentes de α–sintropina, la proteína encargada del anclaje de la AQP4 a la membrana celular37. Sin embargo, la posible manipulación genética o farmacológica de la expresión de AQP4 es un objetivo terapéutico de difícil consecución pues el papel fisiológico desempeñado por este canal de agua varía en función de la fase concreta de evolución del daño cerebral. Mientras que un aumento de la expresión de AQP4 parece resultar perjudicial en las fases iniciales del desarrollo del edema isquémico, contribuyendo en esta fase al incremento del edema, podría por el contrario resultar beneficioso en las fases posteriores ayudando a la resolución del mismo38. Este es un ejemplo paradigmático de la complejidad de acción de una molécula (en este caso un canal) cuya activación o bloqueo puede resultar beneficioso o perjudicial en función de la fase temporal del proceso patológico.

Existe por otro lado una gran controversia sobre el papel de los astrocitos reactivos en la isquemia cerebral y especialmente sobre las consecuencias del desarrollo de una cicatriz glial tras un daño isquémico. Actualmente se tiende a considerar que la astrogliosis tiene aspectos positivos y negativos dependiendo de la fase temporal de evolución del daño cerebral39. En fases iniciales la cicatriz glial puede proporcionar múltiples beneficios, estabilizando el frágil tejido nervioso que ha sufrido un daño isquémico al evitar que neuronas inicialmente no dañadas se expongan a un ambiente con elevada concentración de glutamato y radicales libres40. Por otro lado, la barrera física de inhibición del crecimiento axonal que supone la cicatriz glial representa más que un obstáculo una propiedad esencial para preservar la citoarquitectura global del tejido cerebral, pues permitir el crecimiento axonal dentro de un ambiente caótico y metabólicamente inestable puede causar más daño que beneficio41. Alternativamente, diversos estudios recientes han mostrado que los astrocitos reactivos expresan receptores de endotelinas o de factor de crecimiento vascular endotelial, implicados en la modulación del desarrollo neuronal, el crecimiento axonal y la vasculogénesis42,43, que podrían facilitar la recuperación de la zona cerebral dañada.

El daño adicional que se produce en el tejido isquémico cuando se recupera su flujo normal, sobre todo a expensas de la formación de radicales libres y de la apertura de la barrera hematoencefálica (BHE), ha sido un destacado tema de investigación desde la introducción de las terapias trombolíticas44. De hecho, recientemente se ha propuesto el uso sinérgico de agentes neuroprotectores y trombolíticos para tratar de aminorar los efectos dañinos de la reperfusión45–48. Entre los diversos efectos de los radicales libres se está dando especial relevancia a la activación de la enzima poli-ADPribosa-polimerasa (PARP1) en respuesta al daño oxidativo del ADN. Esta enzima, que se encarga de reparar el ADN dañado, consume al activarse el coenzima NAD+-necesario para producir ATP-, algo que agrava todavía más la crítica situación bioenergética del tejido nervioso sometido a isquemia49. De hecho, se han obtenido resultados muy prometedores con inhibidores de la enzima PARP en ratones sometidos a un daño cerebral isquémico50.

Otro de los efectos más importantes de la reperfusión es la rotura de la BHE y el edema vasogénico asociado a la misma, un foco de estudio muy interesante por sus posibles implicaciones terapéuticas. En animales con una oclusión transitoria de la arteria cerebral media durante 90 minutos, la BHE se abre justo al comenzar la reperfusión y luego permanece cerrada hasta pasadas 24-48 horas51. Se ha observado que la apertura de la BHE se debe fundamentalmente al efecto de las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMP), que degradan las proteínas que forman la estructura de las uniones estrechas entre las células endoteliales y las proteínas de la lámina basal. Animales genéticamente modificados deficientes en un tipo de MMP (la isoforma MMP-9) muestran menor daño de la BHE y presentan infartos de menor tamaño en modelos experimentales de isquemia52. Una vez más, la modulación farmacológica de las MMP no es sencilla, puesto que a pesar de su efecto perjudicial inicial, son enzimas que contribuyen de forma importante en la fase de recuperación, facilitando la angiogénesis y neurogénesis53.

Otro factor fundamental a tomar en consideración en el daño cerebral isquémico son las diferentes respuestas fisiopatológicas de la sustancia gris y la sustancia blanca, cuyas características estructurales y funcionales son radicalmente diferentes29. A pesar de que ambas son esenciales para el funcionamiento normal del cerebro, la mayoría de los estudios de isquemia cerebral se han centrado exclusivamente en la sustancia gris. Sin embargo, el daño de la sustancia blanca es un factor que probablemente contribuye significativamente a los pobres resultados obtenidos en la mayoría de los ensayos clínicos. La pobreza del aporte vascular colateral a nivel de la sustancia blanca la hace especialmente vulnerable a la disminución del FSC. A nivel de la sustancia blanca, los dos elementos estructurales fundamentales son los axones de las neuronas y los oligodendrocitos, células gliales responsables de la mielinización y función normal de los axones. El déficit energético induce la liberación de calcio desde las organelas axonales, que puede conducir a una pérdida de la homeostasis iónica y de la función fisiológica de transporte axonal54.

Respecto a los oligodendrocitos, se ha observado que estas células son muy vulnerables a la isquemia in vivo, y su daño está mediado fundamentalmente por los receptores de glutamato de tipo AMPA55,56. La alteración de la síntesis de mielina por los oligodendrocitos es un factor fundamental del daño isquémico, e incluso en ausencia de muerte celular la disfunción metabólica de los oligodendrocitos impide la remielinización de los axones. El obstáculo al crecimiento axonal se debe no sólo a la cicatriz glial, sino al efecto inhibidor de ciertos componentes de la mielina57. Es muy complicado que se pueda conseguir en un futuro estimular la regeneración axonal en un tejido dañado, ya que los axones en crecimiento requieren una estructura tridimensional de la mielina en forma de túnel capaz de guiar el avance longitudinal de los conos de crecimiento axónico58,59. Sólo se ha observado crecimiento axonal en tractos parcialmente denervados, donde los túneles mielinizados y el esqueleto asociado de astroglía ha sobrevivido41. Entender mejor los mecanismos que conducen a la muerte de los oligodendrocitos y su interacción con los axones puede ayudar a buscar nuevas terapias para el tratamiento de la isquemia cerebral.

La mayoría de los genes y proteínas implicados en el crecimiento neuronal, sinaptogénesis y proliferación de espinas dendríticas tienen su máxima expresión durante el desarrollo precoz del cerebro y disminuyen significativamente con la edad60. Datos recientes sugieren un gran paralelismo entre los mecanismos de plasticidad en el tejido nervioso en desarrollo y los que tienen lugar en el cerebro adulto que ha sufrido un infarto61,62. La plasticidad cerebral en adultos que han sufrido un infarto se basa en diferentes grados de compensación proporcionados por dos mecanismos básicos: a) la sorprendente cantidad de conectividad difusa y redundante que existe en el cerebro y que permite esculpir nuevos circuitos en función de su actividad; b) la formación de nuevos circuitos funcionalmente activos entre regiones corticales no dañadas estructuralmente, fenómeno conocido como “remapping”63. Sin embargo, la capacidad de remodelación de un cerebro que ha sufrido un infarto, en un paciente adulto y normalmente hipertenso, es menor que la de un cerebro en desarrollo, debido al daño de la microvascularización, la inflamación crónica y otros procesos que dificultan la plasticidad. A pesar de las limitaciones del cerebro adulto, se ha observado un período temporal concreto tras un infarto cerebral en el que hay un aumento de la expresión de los genes implicados en la plasticidad cerebral64. Tras un infarto de tamaño pequeño la recuperación funcional depende fundamentalmente del tejido perilesional, que asume funciones similares a las del tejido dañado62, mientras que tras un infarto de tamaño grande, el tejido con una capacidad funcional similar puede encontrarse sólo en áreas distantes o incluso en el hemisferio contralateral65. Se ha demostrado en estudios realizados en ratas que existe un período crítico para la recuperación y que si la rehabilitación se demora excesivamente la mejoría es significativamente menor66. Actualmente existe un gran interés para prolongar la ventana de tiempo durante la que están aumentados los procesos de neuroplasticidad que caracterizan la fase semiaguda tras un infarto63.

A pesar de los importantes conocimientos sobre la isquemia cerebral proporcionados por los estudios realizados en modelos experimentales, el fracaso de las diversas terapias neuroprotectoras que se habían mostrado eficaces en estudios experimentales ha producido una enorme decepción67. Hay multitud de factores que pueden contribuir a la disparidad de resultados entre estudios experimentales y clínicos. En primer lugar, a nivel macroscópico llama la atención que las ratas y los ratones poseen un cerebro lisencefálico. Debería considerarse la posibilidad de investigar el efecto de las terapias en animales superiores girencefálicos antes de dar el salto a los ensayos clínicos. Otra diferencia evidente es que los animales empleados suelen ser jóvenes y sin comorbilidades. En la última década se ha propuesto el uso de animales ancianos y con enfermedades asociadas -obesidad, hipertensión o diabetes-, con el objetivo de que reproduzcan mejor la enfermedad humana19,68. Otro factor a analizar es la diferencia en el modo de evaluar el efecto de las terapias; pues mientras que los estudios experimentales suelen cuantificar la necrosis celular postisquemia, los estudios clínicos valoran el pronóstico funcional de los pacientes. Finalmente queremos llamar la atención sobre el gran número de fármacos que han sido probados en ensayos clínicos sin haber demostrado resultados suficientemente sólidos en modelos experimentales. Muchos de los agentes ensayados en el ámbito clínico habían mostrado tan sólo un efecto modesto en los estudios experimentales, sin que se remarcara la significativa variabilidad existente. Tomemos a modo de ejemplo lo que ha sucedido con el nimodipino, un agente neuroprotector que bloquea los canales de calcio y sobre el que se han realizado un gran número de estudios. Por un lado, de los más de 250 estudios experimentales sólo 20 eran estudios controlados en los que el fármaco se administró tras la inducción de la isquemia. De esos 20, sólo la mitad de los trabajos mostraron que el nimodipino tenía un efecto positivo, habiéndose administrado el fármaco en la mayoría de ellos durante los primeros 15 minutos tras inducir la isquemia69. Sin embargo, frente al beneficio limitado y la inconsistencia de los resultados, se han realizado más de diez ensayos clínicos, cinco de ellos randomizados y doble ciego70–74. Además, resulta llamativo que los pacientes recibieron el fármaco a las 24-48h del inicio de los síntomas, es decir transcurrido un periodo de tiempo muy superior a la ventana terapéutica identificada en los estudios experimentales. Parece que la presión de las compañías farmacéuticas para iniciar ensayos clínicos sin unos sólidos resultados experimentales puede ser un factor implicado en los fracasos terapéuticos observados en los pacientes. Existe asimismo un sesgo importante al no publicarse o hacerse en formatos cortos aquellos trabajos experimentales con resultados negativos. Obviar la complejidad del cerebro es probablemente el error más común en el diseño de ensayos de terapias dirigidas a las diversas patologías que afectan a este extraordinario órgano.

La terapia con células madre es uno de los campos que más rápidamente está avanzando en los últimos años y se ha promocionado como la gran esperanza para la reparación del daño isquémico cerebral75,76. La terapia con células madres se ideó inicialmente como una terapia de reemplazamiento celular para reconstruir los circuitos cerebrales dañados y poder recuperar las funciones perdidas. Sin embargo, ni el implante de células madre ni la estimulación de la neurogénesis en mamíferos son una garantía para aumentar el número de neuronas funcionales, ya que para ello es imprescindible que se integren sinápticamente dentro de un circuito cerebral. Quizás se han creado demasiadas expectativas puesto que el objetivo final de estas terapias es sumamente ambicioso. La reparación de un tejido con células madre requiere de dos procesos independientes: a) las células muertas deben reemplazarse por otras nuevas generadas; b) las células nuevas deben diferenciarse y organizarse en un patrón complejo que idealmente restaurará la estructura original del tejido. Resulta evidente que dada la reducida capacidad del tejido nervioso adulto para la sustitución celular endógena y la dificultad de restablecimiento de conexiones neuronales ordenadas a larga distancia, es aún prematuro crear expectativas acerca de la terapia celular como panacea para la recuperación de las lesiones cerebrales de origen isquémico77. Hasta el momento se han implantado directamente en el cerebro o administrado por vía sistémica una gran variedad de tipos celulares, incluyendo células madre neuronales, trasplantes fetales, células de líneas inmortalizadas o células de médula ósea78. El uso de células exógenas es complejo y se desconocen los factores que a nivel molecular controlan la migración, diferenciación y conectividad de estas células. Por ello el uso de precursores endógenos está atrayendo cada vez más interés. En los años 70 se abolió el dogma de que el cerebro de mamífero adulto no puede repararse a sí mismo gracias al descubrimiento de la neurogénesis, fenómeno que consiste en el nacimiento de neuronas nuevas en cerebros adultos. Sin embargo, el grado de neurogénesis posnatal disminuye conforme aumenta la complejidad cerebral79. Sólo se ha observado que la neurogénesis persiste a nivel de la zona subgranular del giro dentado del hipocampo y en la zona subventricular en los mamíferos adultos80. Estudios experimentales han demostrado que la neurogénesis se activa tanto en el hipocampo de ratas y primates81,82 como a nivel cortical en roedores adultos en los que se induce un daño cerebral isquémico83,84. Sin embargo, la mayoría de las nuevas neuronas mueren y sólo algunas son capaces de migrar al tejido dañado. La microreparación cerebral resultante no parece ser suficiente para revertir un déficit funcional. Por esta razón, los proyectos más recientes tratan de estimular con factores de crecimiento el fenómeno fisiológico de la neurogénesis, un procedimiento no exento de riesgos. Por un lado, se ha visto que algunas formas de epilepsia son debidas a que las células madre neuronales realizan más divisiones que las que deberían y dan lugar a circuitos con una función aberrante85. Por otro lado, la administración de factores de crecimiento por encima de los niveles habituales del cerebro puede inducir la formación de tumores cerebrales86. Finalmente, aunque todavía no está claro cuáles son los mecanismos que explican los beneficios observados a nivel experimental con el uso de terapias celulares, cada vez está más aceptada la idea de que sus efectos podrían deberse a la capacidad de estas células para liberar ciertas sustancias neuroprotectoras o immunomoduladoras87. El elegante estudio publicado recientemente por Kolb et al88, que consistió en la estimulación farmacológica de la neurogénesis fisiológica tras la inducción de un infarto cortical y la posterior extirpación quirúrgica del área cortical regenerada, fue el primero en demostrar el efecto modulador de las células madre. Este trabajo mostró que las ratas empeoraron funcionalmente al séptimo día de extirpar la corteza regenerada pero curiosamente no en el primer día tras la cirugía. El hecho de que tuvieran que pasar varios días hasta objetivarse un empeoramiento neurológico sugiere que el tejido nervioso regenerado actúa como un promotor de la plasticidad o manteniendo la homeostasis en las áreas corticales adyacentes y no a través de una integración neurofisiológica efectiva en el área dañada.

En conclusión, creemos que el objetivo fundamental de los estudios realizados en modelos experimentales de isquemia cerebral ha de ser la obtención de conocimientos básicos acerca de los procesos patobiológicos subyacentes al daño isquémico. Su empleo no debería restringirse a la mera demostración de un beneficio terapéutico como fase previa a la realización de ensayos clínicos. Dichos ensayos no deberían iniciarse con agentes terapéuticos cuyos beneficios hayan sido escasos o inconsistentes en los estudios experimentales. La isquemia cerebral supone la activación en paralelo de múltiples procesos fisiopatológicos que tienen lugar en el órgano más complejo del cuerpo humano y que interactúan entre sí temporalmente haciendo impredecible el pronóstico funcional del área afectada en cada individuo. Parece evidente que la adopción de enfoques de tipo reduccionista, centrados en procesos bioquímicos o moleculares concretos considerados de forma unívoca como beneficiosos o perjudiciales a lo largo de toda la evolución temporal del daño isquémico es insuficiente. El diseño de nuevos abordajes terapéuticos para la isquemia cerebral debe basarse en una integración previa del enorme volumen de conocimientos aportados por los modelos experimentales sobre la fisiopatología del daño cerebral isquémico, asumiendo la complejidad estructural y funcional del órgano que sufre dicho daño.