Las muestras de LCR fueron recolectadas por punción lumbar en 32 pacientes con ELA diagnosticados según los criterios de diagnóstico de El Escorial31 (25).** Fueron extraídos entre 1,5 y 3cc de cada paciente, centrifugados a 1.500rpm durante 10min, y divididos en 4 a 5 alícuotas para propósitos del estudio. Se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente. Dieciséis pacientes eran mujeres; la edad media de la serie fue de 59años al momento de la extracción del LCR. Cuatro pacientes tenían ELA familiar y el resto eran esporádicos; 11casos fueron presentados como una forma de aparición bulbar, 20 casos sufrieron el tipo de la columna vertebral, y un paciente presenta síntomas en ambos lugares. De los pacientes con ELA, solo 4 presentaban mutaciones en el gen SOD1 y uno era asintomático, lo que significa que el LCR de pacientes con un mecanismo de genética SOD1 tenía una muy baja presencia en el grupo ELA-LCR. Veinte muestras (68,7%) mostraron una citotoxicidad significativa (cELA-LCR) usando el método descrito a continuación. Las muestras de LCR utilizadas como controles (no-ELA LCR) fueron obtenidas de pacientes que sufren dolor de cabeza o convulsiones y requirieron punción lumbar durante un examen de rutina. Se obtuvo también un consentimiento informado de los controles. Las muestras de LCR se mantuvieron congeladas a −80°C hasta que fueron utilizadas.

Con la finalidad de demostrar citotoxicidad, fueron utilizados en los experimentos cultivos celulares de neuronas motoras in vitro, como ha sido descrito previamente24. Para estos experimentos, las neuronas se obtuvieron de la corteza motora cerebral de embriones de rata de 20días de edad. Las células obtenidas se sembraron a una densidad de 105células/ml en placas de 48 pocillos que contenían 0,25ml de medio neurobasal suplementado con B-27 y cultivado durante 8-10días. Después de este tiempo, los cultivos se incubaron durante 24h con 10% ELA-LCR y la viabilidad de las neuronas fue medida con ensayos MTT32. La ELA-LCR administrada a los animales fue preparada por la puesta en común de viales de LCR que exhibían efectos citotóxicos in vitro (por lo menos 20% de pérdida de las neuronas motoras), y la mayoría del LCR incluido en ese grupo fue tomado de pacientes con ELA esporádica. Las muestras de LCR control para los no-tóxicos de 3 pacientes también fueron considerados antes de la administración ICV.

Los animales fueron manipulados según los principios de cuidado de animales de laboratorio publicados por el Comité Ético Español (RD 1201/2005) y la Directiva Europea 86/609/CEE; el procedimiento fue aprobado por el Comité de Ética para el cuidado y uso de animales de investigación en el Hospital Clínico San Carlos de Madrid, España. Las 28 ratas Wistar albinas macho adultos fueron obtenidas de Charles River Laboratories. Todos los animales fueron alojados bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12h con acceso libre a comida y agua. Fueron enjaulados individualmente bajo condiciones de colonias estándar en las instalaciones de los animales Hospital Clínico San Carlos. El grupo LCR se administró a las ratas en 4 períodos. En el primer período, 14 ratas entre 1 y 5meses de edad (media de 3,25meses) y en el segundo periodo, 12 ratas entre 2,5 y 5meses de edad (media de 4,1meses) fueron inyectadas con el LCR descrito anteriormente. El intervalo entre los 4 períodos fue de aproximadamente 3meses.

Tres grupos experimentales fueron diseñados para este estudio. El grupo1 incluyó 9 ratas a las que fueron implantadas ICV minibombas llenas de LCR de pacientes no-ELA (no-ELA-LCR). El grupo2 fue compuesto por 15 ratas implantadas ICV con minibombas llenas de ELA-LCR citotóxico (cELA-LCR). Finalmente, 4 ratas implantadas ICV con minibombas llenas de solución salina fisiológica formaron el grupo3 (grupo de tratamiento simulado o sham).

Las ratas fueron anestesiadas con tribromoetanol, y se les implantó por vía subcutánea una minibomba osmótica (caudal de 0,15l/h; Alzet 2006, Alzet Palo Alto, CA, EE.UU.) entre las escápulas y permaneció allí hasta el punto final del estudio. Antes del implante, las minibombas osmóticas se llenaron con la preparación correspondiente para cada grupo experimental. Las minibombas se adjuntaron a una cánula de infusión de cerebro (Alzet) a través de un tubo de polietileno y son preparadas por inmersión en solución salina normal a 37°C durante 24h. Estos procedimientos fueron llevados a cabo en condiciones estériles. La cánula fue implantada en el ventrículo cerebral lateral derecho (−0,5mm anteroposterior, −1,4mm lateral y −3,3mm dorsoventral (coordenadas basadas en el Atlas Paxinos)33 y fueron fijadas al cráneo con cemento dental.

El volumen de depósito de las bombas asegura el bombeo al menos durante 42días. El LCR fue inyectado por vía intratecal a una tasa de 0,15l/h durante un período de 43días, excepto las ratas sacrificadas al día 20. Los animales restantes en el estudio que permanecieron hasta el día 82 fueron implantadas con un tubo de polietileno sellado mecánicamente para prevenir la irritación local debido a la continua atracción de agua a la bomba.

Los animales fueron probados clínicamente al menos un día por semana a partir de una semana después de la cirugía. Todas las pruebas se realizaron con los examinadores ciegos al grupo experimental al que pertenecía cada rata. Las evaluaciones del estudio incluyeron la medición de peso corporal, la respuesta a la prueba de plano inclinado y la escala motora Matsumoto34. Para medir el peso corporal, los animales se pesaron cada 4semanas con una escala digital. Para la prueba de plano inclinado, 20 ratas fueron colocadas lateralmente contra el eje largo del plano inclinado para medir el ángulo máximo en el que podían mantener su posición en el plano durante 5s. Para evaluar la fuerza de ambas extremidades por igual, los animales fueron colocados sobre el plano inclinado con su lado derecho del cuerpo frente a la parte descendente de la superficie inclinada, posteriormente con el lado izquierdo del cuerpo que va cuesta abajo. Una puntuación de menos de 70¿ en la prueba de plano inclinado se correlaciona bien con la aparición de debilidad muscular en ratones transgénicos SOD1-G93A34. Para determinar la escala motora de Matsumoto34 se puso a prueba la capacidad de los animales de enderezarse a sí mismos dentro de los 30s de ser manipulado a ambos lados (reflejo de enderezamiento). Las ratas que eran capaces de enderezar desde ambos lados fueron examinadas para su capacidad de permanecer en su jaula de alojamiento de forma espontánea durante 1min. Si mostraban poco movimiento en sus jaulas, se trasladaban a otra jaula para activar la motivación de exploración. Si las ratas no mostraron anomalías de acuerdo con estas evaluaciones, eran examinadas a fondo para ver si tenían algún déficit funcional observable, tal como parálisis de las extremidades o síntomas de debilidad muscular general en el campo abierto. Una puntuación de 5 significa que el animal es normal y una puntuación de 0 es una rata completamente paralizada. La escala motora de Matsumoto ha demostrado estar correlacionada con la pérdida de neuronas motoras espinales en un modelo de ratón transgénico mutado de ELA SOD1-G93A34

Un electromiograma de las ratas cELA-LCR y ratas no-ELA-LCR fue realizado al día 82 por un neurólogo experto en esta técnica. La aguja fue insertada en las extremidades delanteras y traseras y en los músculos paravertebrales para tratar de hallar signos de denervación como actividad espontánea de inserción (ondas positivas, fibrilaciones o fasciculaciones). Las ratas fueron sedadas con isoflurano al 1,5% en 0,7l/min de oxígeno durante el procedimiento.

A los 20, 45 u 82días después de la cirugía las ratas de cada grupo fueron profundamente anestesiadas con una dosis de pentobarbital (60mg/kg) y fentanilo (0,3mg/kg). En primer lugar, se inyectó 10μl de colorante de Evans azul a través de un catéter ventricular para confirmar la correcta localización. Los animales fueron sacrificados por perfusión intracadiaca con 0,9% de solución salina seguido de paraformaldehído al 4% tamponado (tampón fosfato 0,1M). Después de la perfusión, el encéfalo y la médula espinal fueron diseccionados, lavados con PB 0,1M y crioprotegidos por inmersión en 30% de sacarosa y compuesto OCT. El material se almacenó a −80°C hasta su uso. Se cortaron criosecciones (50μm) de la corteza motora y de los segmentos cervical y lumbar de la médula espinal (C5-C6 y L3-L5); los cortes fueron colocados en una solución de crioprotección que contiene etilenglicol y sulfóxido de dimetilo y es utilizado para preservación de tejidos cerebrales. De las 9 ratas en el grupo de no-ELA-LCR, una fue sacrificado al día 20, 7 a los 45días y una al día 82. De las 15 ratas en el grupo de cELA-LCR, 4 fueron sacrificados al día 20, 7 al día 45 y 6 al día 82 después del implante. Finalmente, de las 4 ratas en el grupo de tratamiento simulado, una fue sacrificada al día 20, 2 a los 45días y una a los 82días.

Se lavaron 4 cortes de tinción de inmunofluorescencia con PBS, permeabilizados con 0,1% Triton X-100 y bloqueados con 10% de suero de cabra normal. Después se aplicaron los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4°C: anti-periferina (1:200, Millipore, AB 9282); anti-S100B (1:200, Millipore, 04-1054); anti-caspasa-3 (1:200, Millipore, 04-1090); anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (1:500, DakoCytomation, Z0334); anti-GTL1 (1:200, Millipore, AB 1783); anti-GFAP (1:600, Millipore, MAB360); anti-TARDBP (1:200, Abcam, ab42474); anti-ubiquitina (1:100, Abcam ab7780); anti-transferrina-r (1:200, Abcam, ab22391); anti-colin acetiltransferasa (1:100, Abcam, ab68779); anti-metalotioneína (1:100, Abcam, ab12228); anti-Stefin (1:100, Abcam, ab68290); anti-MHC II (1:500, Abcam, ab6403); anti-Iba-I (1:1.000, Wako, desde 019-19741); anti panAKT (cell signaling 2920S) y anti fosfoAKT (cell signaling 4060S). Se lavaron los portaobjetos en PBS 3veces, y los anticuerpos primarios fueron probados con Cy3 (1:1.000, Jackson) o con anticuerpos secundarios conjugados Alexa 488, 555 o 647 (1:500, Invitrogen). Se lavaron las secciones 3veces en PBS, contrastadas con DAPI, y montadas con el reactivo Fluorsave (Calbiochem).

Las imágenes de fluorescencia fueron adquiridas con un microscopio confocal Olympus AF1000. Se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico descriptivo dentro de los 3 períodos de tiempo establecidos, un análisis de los cambios observados en los marcadores inmunohistoquímicos con el tiempo y su comparación entre los grupos control y ELA-LCR. Los análisis histológicos examinaron las áreas estrechamente relacionados con ELA, específicamente la corteza motora, bulbo raquídeo y segmentos espinales C5-C6 y L3-L5.

Los datos fueron procesados utilizando el software GraphPad Prism 5. Fueron reportados como valores medios ±error estándar de la media (SEM). Los gráficos de los resultados fueron realizados utilizando el mismo programa. El criterio para la significación estadística fue p<0,05.

No se encontraron diferencias significativas entre las ratas del grupo de cELA-LCR y los demás grupos en ninguna de las evaluaciones clínicas, incluyendo el peso corporal, el comportamiento durante la prueba de plano inclinado y las escalas de Matsumoto, que fueron todas normales. Respecto a los electromiogramas, se encontraron ondas agudas positivas en las extremidades traseras, las extremidades delanteras y los músculos paravertebrales sin potenciales de fibrilación o fasciculación en 6 de las ratas del grupo cELA-LCR a los 82días después del implante, lo que no ocurrió en los controles, aunque no se observó un patrón de denervación.

Se observó gliosis reactiva evidente, activación microglial y expresión de caspasa-3 en la corteza motora en los 3 grupos experimentales a los 20días después del implante. Estos hallazgos podrían ser atribuidos a una respuesta inflamatoria secundaria a la intervención quirúrgica. Sin embargo, a los 45días después de la cirugía se observó un importante incremento en la reactividad glial y la respuesta microglial en todas las regiones en el grupo de cELA-LCR (figs. 1 y 2). En los segmentos de la médula espinal de los animales que recibieron cELA-LCR se observó que algunas motoneuronas estaban envueltas por células microgliales. La cuantificación inmunohistoquímica del marcador IBA-1 reveló alteraciones en la morfología de la microglía, pasando de un estado en reposo caracterizado por un soma microglial con procesos finos y ramificados a una microglía activada con escasas ramificaciones. Se observaron cuerpos celulares alargados con procesos largos y más gruesos a los 20días después del implante, mientras que se encontraron las células ameboides con cuerpos redondos con procesos cortos, gruesos y robustos a los 45 y 82días, lo que indica una activación de células fagocíticas en la proximidad de las neuronas motoras. Estas células expresan MHC-II, que marca fases inflamatorias. En los grupos de tratamiento simulado y no-ELA-LCR, la expresión de MHC-II fue 3 veces inferior a la observada en el grupo de cELA-LCR (fig. 3). Un punto interesante fue la fuerte expresión de astrocitos y el descubrimiento de astrocitos hipertróficos que sobreexpresaban GFAP en las proximidades de las neuronas motoras corticales y de la médula espinal. Se observaron cambios más pronunciados a los 45días después de la cirugía. También se observó expresión de MHC-II, pero a niveles más bajos, a los 82días (fig. 3). Contrariamente a los datos observados en el grupo de cELA-LCR, se constató una disminución de la expresión de GFAP y de caspasa-3 en los otros 4 grupos, incluso a los 82días después de la cirugía. Asimismo, se observó un ligero aumento en la expresión del transportador de glutamato GTL1, que se ha relacionado con la ELA, y su expresión está modificada por ELA-LCR36. GTL1 se encontró en las proximidades de las neuronas motoras espinales del grupo cELA-LCR que se correlaciona con la expresión de GFAP como un marcador de activación de astrocitos. La sobreexpresión de S100B apareció a los 45 y 82días en el grupo de cELA-LCR solamente.

Figura 1.

A los 45 días después de la cirugía, el aumento de la reactividad glial y la respuesta microglial en el grupo de cELA-LCR en todas las regiones cerebrales estudiadas fue evidente. Por ejemplo, en el cuerno anterior (segmento lumbar) de ratas cELA-LCR, encontramos una mayor expresión de GFAP con abundantes astrocitos hipertróficos (panel C, c); además, se identificó una mayor densidad de células IBA-1 positivas con procesos agrandados, a menudo en estrecha proximidad a las neuronas motoras o incluso rodeando a estas neuronas (flechas en panel C, flechas y detalle del panel c). Estos cambios no se observaron en los grupos sham y no ELA-LCR, en los que las células de microglía aisladas se observaron ocasionalmente cerca de las neuronas motoras. Escala: A-C: 60μm; detalles a-c: 30μm.

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Figura 2.

Imagen de microscopia confocal de la corteza motora, ejemplificando los datos presentados en tablas (diferentes momentos del estudio). Es evidente el aumento de células positivas IBA-1 y GFAP en los animales del grupo cELA-LCR (C), en comparación con el grupo sham (A) y el grupo de noELA-LCR (B). Corteza motora capa 4-6, 45días después de la cirugía. Escala de barras: 50μm.

(0.41MB).

Figura 3.

A-C) Análisis cuantitativo de la expresión de MHC-II en diversas regiones del cerebro y médula espinal, en los 3 períodos de tiempo estudiados. El grupo cELA-LCR mostró un aumento significativo del número de células microgliales, que es una evidencia clara de una etapa neuroinflamatoria. D)Imagen representativa de células positivas para MHC-II en la región lumbar. Estas células también se observaron en las proximidades de las neuronas motoras. Escala: 50 m; * p<0,05; los datos se muestran como media ± DE.

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Con el fin de comprender si el incremento de caspasa-3 se acompañaba de un aumento en la expresión de proteínas estrechamente relacionadas con la supervivencia y la resistencia a la apoptosis, tales como fosfoAKT y panAKT, se llevó a cabo su cuantificación. Básicamente, el grupo de tratamiento simulado y el grupo no-ELA-LCR no mostraron cambios significativos a lo largo del estudio (20, 45 y 82días). Sin embargo, en el grupo de cELA-LCR se encontraron incrementos significativos de panAKT y fosfoAKT a los 45días, con una expresión inmunohistoquímica que era 3 veces mayor que los niveles observados en los otros grupos, pero a los 82días después de la cirugía estos datos eran similares al grupo de tratamiento simulado (fig. 4).

Figura 4.

Expresión de panAKT (AKTpan) y fosfoAKT (AKTfosfo) en varias regiones del sistema nervioso central de los 3 grupos de ratas. A)Imágenes de microscopia confocal de la expresión de panAKT, fosfoAKT y periferina (perip). B)Análisis de fosfoAKT y panAKT de cuantificación de densidades ópticas. Se observaron mayores expresiones de AKTpan y fosfoAKT a los 45días en el grupo de cELA-LCR (A y B). Un fenómeno interesante en el grupo de cELA-LCR fue el incremento en la expresión de periferina, fosfoAKT y panAKT en las neuronas (A). En el día 82 después de la cirugía, las concentraciones de AKT (pan y fosfo) fueron similares a los de los grupos sham y no ELA-LCR, la expresión se había regresado a niveles similares a los observados en los otros grupos a los 82días de la cirugía días post (B). Escala: 50μm.

(0.63MB).

La periferina juega un papel importante en el transporte axonal en las neuronas motoras espinales. Recientemente la periferina también se ha asociado con algunas neuropatologías que caracterizan la ELA esporádica, ya que se encuentra en los cuerpos Bunina37. Por lo tanto, hemos considerado relevante analizar la periferina en las neuronas motoras, ya que su expresión se relaciona con formas de ELA esporádica. Todas las secciones del grupo cELA-LCR mostraron neuronas motoras con expresión positiva de periferina (figs. 5 y 6), pero en los animales sacrificados a los 45días se observaron niveles 4 veces más altos que en los de los otros grupos y los puntos de tiempo analizados (fig. 6). Por otra parte, las células con más inmunorreactividad de periferina también co-expresaron con panAKT y fosfoAKT. Estas células mostraban el marcador de periferina con un patrón filamentoso, que se observa también en las condiciones normales; sin embargo, en el grupo de cELA-LCR también se observaron células que contenían el marcador de periferina en inclusiones citoplasmáticas que recuerdan estructuras rugosas o granulares, que posiblemente podrían desencadenar la formación de precipitados o inclusiones de proteínas (fig. 5).

Figura 5.

Expresión de periferina (peri), ubiquitina (ubiq) y transferrina después de la infusión de cELA-LCR. A los 45 y 82días después de la cirugía los animales con tratamiento cELA-LCR mostraron inclusiones en el citoplasma y tenían marcaje positivo de ubiquitina en las neuronas. Inclusiones (flechas) de ubiquitina se colocalizaron con periferina y, ocasionalmente, con transferrina. Escala A-C: 20μm; a-c y D: 2μm.

(0.27MB).

Figura 6.

Imágenes de inmunofluorescencia que muestran la expresión de periferina (peri) a lo largo del curso del estudio en el grupo de cELA-LCR (A: 20días; B: 45días; C: 82días). Se observó un aumento temporal de periferina en las neuronas motoras en el día 45, que había regresado a condiciones basales al día 82. El aumento de expresión de periferina se ha asociado con acontecimientos de lesión en columna, mientras que la expresión es baja en condiciones normales. Escala: 40μm.

(0.25MB).

En el grupo de cELA-LCR, a los 45 y 82días después de la cirugía se observaron células con una mayor expresión de la ubiquitina, transferrina (fig. 5) y cistatinaC. Estos datos están estrechamente vinculados a formas esporádicas de ELA38. Por otra parte, se observó que había una translocación de TDP-43 en el citoplasma de las neuronas motoras (fig. 7). Curiosamente, el análisis inmunohistoquímico por microscopia confocal reveló inclusiones de TDP-43, ubiquitina y cistatinaC, y estas proteínas se colocalizaron en el citoplasma de las neuronas motoras. El incremento de estas inclusiones a los 82días fue acompañado por una disminución en la expresión de periferina (fig. 6).

Figura 7.

Imágenes en las que se observa que los animales tratados con cELA-LCR mostraron inclusiones citoplasmáticas de TDP-43 en las neuronas de la médula espinal (flechas). En el detalle se observan las inclusiones (cabezas de flecha). Escala: 40μm.

(0.16MB).

Como algunos estudios han sugerido que la homeostasis del cobre y del cinc podría contribuir a la patogénesis de la ELA, se estudió la expresión de metalotioneína39,40. La expresión de metalotioneínas estaba relacionada con el curso temporal de los cambios después de la cirugía (45 y 82días) y solo se produjo en el grupo de cELA-LCR, en el que se observó en las neuronas motoras que co-expresaban ubiquitina y transferrina. El aumento de la S100B medido a los 45 y 85días después de la cirugía estaba estrechamente relacionado con el aumento de la periferina en las proximidades de las neuronas motoras. Las células que expresan S100B correspondieron al fenotipo de astrocitos (GFAP+) de neutrófilos adyacentes a neurona motora. Los astrocitos que expresan S100B están estrechamente relacionados con el equilibrio de calcio, cinc y cobre. S100B es una proteína de unión a calcio expresada exclusivamente por las células gliales.