Lysyl oxidase expression in smooth muscle cells determines the level of intima calcification in hypercholesterolemia-induced atherosclerosis

Abstract

Introduction

Cardiovascular calcification is an important public health issue with an unmeet therapeutic need. We had previously shown that lysyl oxidase (LOX) activity critically influences vascular wall smooth muscle cells (VSMCs) and valvular interstitial cells (VICs) calcification by affecting extracellular matrix remodeling. We have delved into the participation of LOX in atherosclerosis and vascular calcification, as well as in the mineralization of the aortic valve.

Methods

Immunohistochemical and expression studies were carried out in human atherosclerotic lesions and experimental models, valves from patients with aortic stenosis, VICs, and in a genetically modified mouse model that overexpresses LOX in CMLV (TgLOX^CMLV). Hyperlipemia and atherosclerosis was induced in mice through the administration of adeno-associated viruses encoding a PCSK9 mutated form (AAV-PCSK9^D374Y) combined with an atherogenic diet.

Results

LOX expression is increased in the neointimal layer of atherosclerotic lesions from human coronary arteries and in VSMC-rich regions of atheromas developed both in the brachiocephalic artery of control (C57BL/6 J) animals transduced with PCSK9^D374Y and in the aortic root of ApoE^−/− mice. In TgLOX^CMLV mice, PCSK9^D374Y transduction did not significantly alter the enhanced aortic expression of genes involved in matrix remodeling, inflammation, oxidative stress and osteoblastic differentiation. Likewise, LOX transgenesis did not alter the size or lipid content of atherosclerotic lesions in the aortic arch, brachiocephalic artery and aortic root, but exacerbated calcification. Among lysyl oxidase isoenzymes, LOX is the most expressed member of this family in highly calcified human valves, colocalizing with RUNX2 in VICs. The lower calcium deposition and decreased RUNX2 levels triggered by the overexpression of the nuclear receptor NOR-1 in VICs was associated with a reduction in LOX.

Conclusions

Our results show that LOX expression is increased in atherosclerotic lesions, and that overexpression of this enzyme in VSMC does not affect the size of the atheroma or its lipid content, but it does affect its degree of calcification. Further, these data suggest that the decrease in calcification driven by NOR-1 in VICs would involve a reduction in LOX. These evidences support the interest of LOX as a therapeutic target in cardiovascular calcification.

Resumen

Introducción

La calcificación cardiovascular es un importante problema de salud pública para el que no se dispone de estrategias farmacológicas eficaces. Previamente habíamos demostrado que la actividad lisil oxidasa (LOX) influye de manera determinante en la calcificación de las células musculares lisas de la pared vascular (CMLVs) y las células intersticiales valvulares (VICs) a través de su impacto en el remodelado de la matriz extracelular. Hemos profundizado en la participación de la LOX en la aterosclerosis y la calcificación asociada, así como en la mineralización de la válvula aórtica.

Métodos

Se realizaron análisis inmunohistoquímicos y de expresión en lesiones ateroscleróticas humanas y de modelos experimentales, válvulas de pacientes con estenosis aórtica, VICs y estudios en un modelo de ratón modificado genéticamente que sobreexpresa LOX en CMLV (TgLOX^CMLV), en el que se indujo hiperlipemia y aterosclerosis mediante la administración de virus adenoasociados que codifican para una forma mutada de la PCSK9 (AAV-PCSK9^D374Y) y dieta aterogénica.

Resultados

La expresión de la LOX se incrementa en la neoíntima de lesiones ateroscleróticas de arterias coronarias humanas y en regiones ricas en CMLV de las placas de ateroma desarrolladas tanto en la arteria braquiocefálica de animales control (C57BL/6 J) transducidos con PCSK9^D374Y como en la raíz aórtica de ratones ApoE^−/−. En ratones TgLOX^CMLV, la transducción con PCSK9^D374Y no alteró significativamente el incremento de la expresión aórtica de genes implicados en el remodelado de la matriz, la inflamación, el estrés oxidativo y la diferenciación osteoblástica. La transgénesis de LOX no afectó al tamaño ni al contenido lipídico de las lesiones ateroscleróticas del arco aórtico, la arteria braquiocefálica y la raíz aórtica, pero exacerbó la calcificación de la íntima de las lesiones. Entre los isoenzimas de la familia de lisil oxidasas, la LOX es el miembro más expresado en válvulas de pacientes muy calcificadas, detectándose en células VICs positivas para RUNX2. La menor deposición de calcio y la disminución de RUNX2 causadas por la sobreexpresión del receptor nuclear NOR-1 en VICs, se asoció a una reducción de los niveles de proteína de LOX.

Conclusiones

Nuestros resultados muestran que la expresión de LOX está aumentada en lesiones ateroscleróticas, y que la sobreexpresión de este enzima en CMLV no afecta al tamaño ni al contenido lipídico de las lesiones pero sí a su grado de calcificación. Además, sugieren que la disminución de la calcificación inducida por NOR-1 en VICs estaría mediada por una reducción en nivel de LOX. Estas evidencias apoyan el interés de la LOX como diana terapéutica en la calcificación cardiovascular.