Fisiopatología de la lesión hepática por isquemia-reperfusión

Resumen

El fenómeno de isquemia-reperfusión subyace a la lesión hepática que acontece en situaciones clínicas tales como la cirugía de resección hepática, el trasplante hepático y los estados de shock. Esta lesión se ha atribuido clásicamente a la acción deletérea conjunta de neutrófilos y especies reactivas de oxígeno. Sin embargo, diversos estudios llevados a cabo en la última década han mostrado un papel cada vez más relevante de los linfocitos T en los fenómenos de isquemia-reperfusión, que activan el reclutamiento de células inflamatorias y causan daño en los tejidos afectados. El objeto de esta revisión es mostrar los mecanismos moleculares y celulares implicados en la fisiopatología de esta lesión.

Abstract

Hepatic ischemia-reperfusion injury is an underlying complication that occurs in clinical conditions such as hepatic resection surgery, liver transplantation and the states of shock. Such injury has classically been attributed to the joint deleterious action of both neutrophils and reactive oxygen species. However, there is increasing evidence that T lymphocytes are also key players in the acute reperfusion injury of diverse organs. They seem to act mainly by promoting the recruitment of inflammatory cells. The purpose of this review is to summarize the molecular and cellular mechanisms that participate in the pathophysiology of liver reperfusion injury.

Introducción

La isquemia-reperfusión (I-R) hepática es causa de una significativa morbimortalidad en 3 situaciones principales:

• 1.

  En caso de resecciones hepáticas mayores (acompañadas en muchas circunstancias de una reducción completa del flujo sanguíneo mediante la maniobra de Pringle)^1,2.

• 2.

  En el trasplante hepático, llevado a cabo en hígados que han tenido un período variable de isquemia fría, con temperaturas entre 1–4 °C durante la preservación del injerto^3,4. La lesión por I-R está estrechamente relacionada con el desarrollo de fallo primario del injerto (ocurre en menos del 5% de los trasplantes) y con la disfunción primaria de éste (ocurre en el 10–30% de los casos)⁵ debido a lesión celular y de la matriz extracelular⁶, lo que ocasiona una mayor incidencia de rechazo inmunitario y favorece la pérdida del hígado trasplantado^7,8.

• 3.

  Cuando se producen situaciones que originan hipoxia sistémica o bien aquellas que implican un bajo flujo sanguíneo, da como resultado una insuficiente perfusión hepática. Dentro de este grupo se pueden incluir las siguientes entidades: shock séptico, hipovolémico o cardiogénico⁹, en cirugía cardiovascular con circulación extracorpórea¹⁰, cirugía laparoscópica^11,12 y en el síndrome compartimental abdominal¹³.

Los 2 tipos celulares más afectados por la lesión isquémica son los siguientes: a) los hepatocitos, con mayor sensibilidad a la isquemia caliente, y b) las células endoteliales sinusoidales a la isquemia fría, de tal forma que después de 48 h de preservación del hígado seguidas de reperfusión, el 40% de las células endoteliales no son viables, lo que ocasiona daño sinusoidal y las consiguientes alteraciones en la microcirculación, lo que da como resultado lesión hepatocitaria y disfunción del órgano¹⁴.

Como consecuencia de la hipoxia, se altera la función de la cadena respiratoria mitocondrial y se reducen las enzimas mitocondriales, por lo que se produce la inhibición del proceso de fosforilación oxidativa con la subsiguiente reducción en la síntesis del ATP¹⁵.

Esta reducción del ATP celular ocasiona alteraciones en el transporte de iones a través de la membrana. La inhibición del ATP-asa Na⁺-K⁺ provoca la entrada de sodio intracelular y se acumula en la célula, con el correspondiente edema celular y muerte¹⁶. Además se produce un aumento en el calcio citosólico, lo que provoca la activación de las fosfolipasas de la membrana celular y se produce la degradación de los fosfolípidos y la disrupción de esta membrana¹⁷. Por tanto, la acumulación de calcio intracelular está estrechamente implicada en el desarrollo de la lesión isquémica y se considera de crucial importancia en la evolución a daño irreversible¹⁸. Este aumento de calcio desempeña un importante papel en la producción de radicales libres de oxígeno (O₂) consecutivos a la reperfusión, mediante la activación de la xantina óxidoreductasa¹⁹.

La lesión de las células del hígado, después de cualquier tipo de isquemia, se produce fundamentalmente en el período de reperfusión, cuando se restablece el aporte de O₂ y elementos sanguíneos.

Durante los últimos 20 años se ha mantenido la discusión sobre los mecanismos moleculares de la lesión por reperfusión. Se aceptó que cualquier estrés oxidativo postisquémico conducía a la muerte celular por peroxidación lipídica. Sin embargo, la peroxidación lipídica es cuantitativamente insuficiente para explicar la grave lesión celular durante la reperfusión²⁰.

Etapas lesionales en el daño hepático por reperfusión

En la fisiopatología de la lesión por I-R está implicada una compleja red de mecanismos intrahepáticos y extrahepáticos. La evidencia experimental muestra que existen 2 fases distintas en la lesión hepática por reperfusión:

• 1.

  Fase precoz o aguda: comprende en el tiempo las primeras 3 a 6 h después de la reperfusión. El principal acontecimiento en esta fase es la activación de las células de Kupffer^21,22. Esta activación se lleva a cabo por la acción previa de componentes activados del sistema del complemento, el reclutamiento y la activación de los linfocitos T CD4⁺²³.

• 2.

  Fase tardía o subaguda: se caracteriza por infiltración masiva de neutrófilos, alcanza su máximo a las 18–24 h de la reperfusión. Estos neutrófilos activados liberan especies reactivas de O₂ (ERO) y proteasas, causantes ambos del estrés oxidativo y de la lesión hepatocelular que se produce en esta fase de la lesión por reperfusión^24,25, que supera en gravedad a la de la fase precoz. El secuestro de polimorfonucleares (PMN) en el hígado tras I-R es tan acusado que la reducción aguda de su recuento periférico se ha propuesto como marcador intraoperatorio precoz de la lesión por reperfusión del injerto hepático²⁶.

El reclutamiento de PMN se debe a una compleja serie de mecanismos secundarios a la isquemia, tanto en el parénquima hepático como en sus vasos, que alteran las características adherentes de los PMN. Entre estos cambios pueden desempeñar un papel importante:

• a)

  La liberación de factores quimiotácticos tales como las ERO por parte del endotelio o los hepatocitos²⁷ y por parte de los propios PMN activados²⁸, que perpetuarían de este modo el quimiotactismo de células proinflamatorias.

• b)

  La producción de mediadores inflamatorios tales como el factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa^28–30, la interleucina (IL)-1³¹ y el factor activador plaquetario³² por parte de las células de Kupffer o por los propios hepatocitos³³.

• c)

  Cambios en la expresión por parte de las células endoteliales de antígenos de superficie tales como moléculas de adhesión intercelular y complejo mayor de histocompatibilidad clase ii³⁴.

• d)

  Lesión del lecho microvascular, que crean fenómenos de «ausencia de reflujo», que pueden atrapar PMN y prolongar la situación de isquemia³⁵.

Por otro lado, es indudable que los PMN representan un papel central en la I-R. La activación endotelial producida por citocinas y ERO aumenta la adherencia endotelial hacia PMN, lo que favorece la producción local de proteasas y más ERO que alteran la microcirculación e incrementan la lesión^36,37.

Aunque se han diseñado diversos estudios con el fin de desentrañar los mecanismos de selección de PMN tras la I-R hepática, este fenómeno sigue sin conocerse por completo.

Mecanismos moleculares de la lesión por reperfusión

Lesión hepática inducida por factor de necrosis tumoral α

En el hígado el TNF-α desempeña un papel dual, ya que no sólo actúa como un mediador de muerte celular, sino que también induce proliferación hepatocitaria y regeneración hepática³⁸.

La inhibición de la señal del TNF-α por antisuero anti-TNF o mediante inactivación genética del receptor 1 del TNF atenúa la lesión hepática por reperfusión y prolonga la supervivencia en ratones. Varias vías de señalización intracelulares se inducen después de la I-R, incluyendo el factor nuclear κ-B y la Jun N-terminal Kinase (JNK). Se ha demostrado que al bloquear la producción hepática de ERO por sobreexpresión de superóxido dismutasa-1 se puede prevenir casi por completo la activación de la JNK hepática y la producción de la correspondiente lesión, lo que indica un papel importante de las ERO en la activación de la JNK y la lesión por I-R^29,39. Por tanto, después de la I-R hepática, las células de Kupffer generarían ERO, las que, a su vez, activarían la JNK y aumentaría la secreción de varias quimiocinas y citocinas incluyendo el TNF-α. Este TNF liberado por las células de Kupffer puede a su vez activar a los receptores de TNF de los hepatocitos para inducir a la JNK y a las cinasas de I κ B y la producción de más ERO. Mientras que las ERO y la JNK producen la muerte celular de los hepatocitos, la activación de las cinasas de I κ B favorece la infiltración leucocitaria del hígado³⁰.

Recientes estudios que utilizan hígados perfundido ex vivo indican que, en las situaciones clínicas habitualmente asociadas a hiperproducción hepática de TNF-α, el causante más probable de la liberación endógena de esta citocina sería el cambio en el flujo sanguíneo a través del lecho vascular hepático, más que la isquemia o reperfusión en sí mismas. Además, este incremento en el TNF-α se ha visto asociado de hecho a una mejora transitoria en la función hepática⁴⁰ e indicaría que la disfunción hepática secundaria a la reperfusión se debería a mecanismos moleculares alternativos, probablemente la generación de ERO. Por tanto, a pesar de la abundancia de resultados experimentales al respecto, el verdadero papel del TNF-α en la lesión hepática por I-R permanece aún por definirse.

Especies reactivas de oxígeno en la lesión hepática por isquemia-reperfusión

Aunque el O₂ es la molécula más importante para el mantenimiento de la vida, es también la fuente principal para la formación de radicales libres debido a su alta disponibilidad. Los radicales biológicamente relevantes son el anión superóxido, el radical hidroxilo y el óxido nítrico (NO). En condiciones normales alrededor del 1 al 3% del O₂ que se metaboliza en la mitocondria se convierte en anión superóxido⁴¹.

Otras especies son intermedias en el metabolismo de O₂ y del NO pero no son radicales, ya que no contienen electrones desapareados. Estas especies intermedias junto con los radicales libres se denominan, respectivamente, ERO y especies reactivas de nitrógeno (ERN)⁴².

Los ejemplos más representativos de ERO no radicales son el peróxido de hidrógeno y el ácido hipocloroso. En el caso de las ERN el no radical más representativo es el peroxinitrito⁴³.

Las ERO y las ERN son la causa de la lesión hepática inducida por I-R, al menos en parte, con concomitante consumo de antioxidantes endógenos^25,44.

Bajo condiciones de estrés oxidativo, la mitocondria es el principal lugar de producción de grandes cantidades de superóxido. Este estrés puede conducir, en su fase final, a la formación de poros de permeabilidad transitoria mitocondrial y provocar la rotura de la membrana mitocondrial y la muerte celular⁴⁵.

El acúmulo de neutrófilos activados dentro del parénquima hepático causa daño tisular a través de la producción de ERO y la liberación, por los gránulos azurófilos, de proteasas, fundamentalmente elastasa y catepsina G. En condiciones normales, el NADPH (fosfato de nicotinamida adenosín dinucleótido) oxidasa existe como subunidades inactivas localizadas en la membrana celular y en el citoplasma. La activación celular origina translocación de las subunidades citosólicas a la membrana celular y da como resultado un complejo multimérico que exhibe actividad oxidasa. La enzima activa oxida el NADPH y el electrón liberado reduce el O₂ molecular, con lo que se forma un anión superóxido⁴⁶. La reducción del anión superóxido origina peróxido de hidrógeno que puede difundir al interior de los hepatocitos y generar estrés oxidativo, a menos que la glutatión peroxidasa que usa al glutatión como donante de electrones lo detoxifique.

Por otra parte, la mieloperoxidasa secretada por los gránulos azurófilos de los neutrófilos genera ácido hipocloroso, que, después de difundir al interior de los hepatocitos, puede formar clorinato de tirosina, residuo de proteínas intracelulares o generar otras proteínas modificadas por ácido hipocloroso³⁶.

En mamíferos, el sistema xantina-oxidasa (XO) se considera una de las mayores fuentes de generación de ERO tras lesión por I-R⁴⁷ y es muy abundante tanto en el hígado como en el intestino⁴⁸. Durante la fase hipóxica de la I-R se acumula hipoxantina debido a la depleción del ATP, ya que disminuye el nivel total de energía. En un proceso paralelo, la hipoxia activa las enzimas proteolíticas que convierten a la xantina-deshidrogenasa en XO⁴⁹. Los crecientes niveles de XO oxidan la hipoxantina a urato una vez que se recupera el flujo sanguíneo en la fase de reperfusión. En esta reacción molecular, el O₂ se transforma en radicales superóxidos⁵⁰.

Aunque la mayor parte de la XO se encuentra en las células endoteliales, se ha comprobado la existencia de XO en otras zonas del organismo, lo que contribuye a la formación de ERO en lugares distales al sitio inicial de la lesión por I-R. La importancia del papel que desempeña la XO circulante se pone de manifiesto por el efecto protector que ejercen los scavengers (barrenderos) de los radicales libres, tales como la enzima superóxido dismutasa y la catalasa⁵¹.

Por último, se estima que los peroxisomas son causantes del 10–30% del consumo de O₂ total celular en el hígado y son importantes lugares de producción de ERO. Tanto los sistemas productores de ERO (XO y sistema de hidroxilación del citocromo P450) como los sistemas antioxidantes (catalasa/enzima superóxido dismutasa) se localizan en los peroxisomas^52,53, y estos orgánulos podrían desempeñar un papel significativo en la modulación del estado redox de la célula⁵⁴.

En la lesión hepática por I-R las ERO son causantes de las siguientes acciones:

• 1.

  Aumento de la expresión de genes proinflamatorios (TNF-alfa, IL-1, IL-8 o moléculas de adhesión celular)^46,55.

• 2.

  Inducción de los factores de transcripción: factor nuclear kappa-B y activador de proteína-1^56,57.

• 3.

  Lesión celular directa mediante oxidación y degradación proteica, peroxidación lipídica y lesión del ADN²⁵.

• 4.

  Inducción directa y regulación de la muerte celular, tanto apoptótica como necrótica⁵⁸.

• 5.

  Inactivación de antiproteasas²⁵.

• 6.

  Inducción de genes protectores de estrés en los hepatocitos⁵⁹.

• 7.

  Formación de mediadores implicados en la regulación del flujo sanguíneo sinusoidal y la regeneración hepática⁶⁰.

El NO es un radical sintetizado mediante oxidación de la L-arginina por la nitrógeno sintasa (NOS). Existen 2 isoformas de NOS en el hígado: la NOS endotelial (eNOS) y la NOS inducible (iNOS). La eNOS se expresa constitutivamente, y su actividad es dependiente del calcio y la calmodulina⁶¹. Las células endoteliales, los hepatocitos y las células de Kupffer sintetizan la iNOS y su actividad es independiente del calcio. La iNOS no se encuentra constitutivamente presente en el hígado normal, pero puede inducirse por mediadores proinflamatorios tales como citocinas y lipopolisacárido o durante I-R, shock, traumatismo o infección, y dan lugar a la producción de grandes cantidades de NO.

Bajo condiciones fisiológicas solamente la eNOS está presente en el hígado y los niveles bajos de NO producido regulan la perfusión hepática, previenen la adhesión plaquetaria y la trombosis, el acúmulo de células PMN y la secreción de mediadores inflamatorios⁶². El NO induce vasodilatación a nivel sinusoidal y presinusoidal y mantiene un equilibrio con vasoconstrictores tales como la endotelina⁶³.

La inducción de iNOS puede tener tanto efectos tóxicos como protectores. Los efectos dependen del tipo de agresión, el nivel y la duración de la expresión de iNOS y la producción simultánea de anión superóxido⁶⁴.

En la I-R hepática la expresión del ARN mensajero de iNOS comienza una hora después de la reperfusión, con actividad iNOS aumentada 5 h posreperfusión⁶⁵. Diversos estudios han mostrado que, mediante la inhibición de iNOS con un inhibidor específico, podría prevenirse la lesión hepática por I-R en el hígado de la rata^66,67.

Algunos de los resultados publicados sobre el efecto de iNOS en la lesión hepática por I-R son contradictorios. Mientras unos estudios indican que la expresión de iNOS tiene efectos perjudiciales sobre la función hepática⁶⁸, otros autores indican que es beneficiosa⁶⁹, e incluso que no tiene efecto alguno⁷⁰.

Papel de los linfocitos en la lesión hepática por isquemia-reperfusión

Se calcula que un hígado humano contiene alrededor de 10¹⁰ linfocitos, que se encuentran tanto dispersos entre los hepatocitos como en los tractos portales. Existe evidencia de un papel patogénico de estos linfocitos pasajeros en la lesión por reperfusión tras isquemia fría⁷¹. Sin embargo, no está claro el papel de los linfocitos residentes frente a los linfocitos periféricos ni la interrelación entre éstos. Se sabe que los linfocitos circulantes de la rata poseen propiedades similares a los PMN humanos, en el sentido de liberar proteasas y ERO⁷². Se ha observado adherencia de linfocitos circulantes a los sinusoides hepáticos precozmente tras la reperfusión, posiblemente reclutados a través de un aumento en la expresión de moléculas de adhesión por parte del endotelio⁷³, y a estos linfocitos se les ha atribuido un papel importante en el deterioro de la función hepática tras períodos prolongados de isquemia fría⁷². Además, ratas esplenectomizadas previamente a la isquemia hepática muestran disminución en la infiltración por PMN y protección del hígado frente a los efectos de la reperfusión⁷⁴.

Existe abundante información acerca de cómo las células T y B pueden interaccionar durante la respuesta inmunitaria y se ha observado una participación de los linfocitos B en la lesión por I-R en el músculo esquelético⁷⁵, el intestino⁷⁶ y el riñón^77,78. Sin embargo, es en el año 1997 cuando se produce una aportación que abre una nueva frontera en el conocimiento de la fisiopatología de la lesión por I-R. Zwacka et al⁷⁹ describieron que la fase aguda se inicia con la activación previa de los linfocitos T CD4⁺, y que es este hecho el que pone en marcha toda la sucesión de acontecimientos que se producen en esta primera etapa lesional y que a su vez desencadena la subsiguiente fase subaguda. Mediante la utilización de ratones desnudos («nude»), genéticamente definidos con déficit de linfocitos T, se observó una significativa reducción de esta respuesta inflamatoria en el ratón nu/nu, comparado con el ratón BALB/c a los que se les ha inyectado las cepas BALB/c generadoras de tumores, linfocito T competente, y se comprobaron los niveles séricos inferiores de aminotransferasa glutámico pirúvica y menor porcentaje de necrosis hepatocelular e infiltración neutrofílica en los primeros. En el mismo estudio se pudo comprobar que el efecto protector se reproducía con depleción de linfocitos T CD4⁺, pero no se observó este efecto cuando la depleción afectó a los linfocitos T CD8⁺. Además, la entrada en el hígado de los linfocitos T CD4⁺ después de la isquemia ocurrió dentro de la primera hora de la reperfusión, lo que indica que este tipo celular actúa como mediador de procesos iniciales en la activación de la cascada inflamatoria subaguda. Este efecto no se vio con la entrada en el hígado de las células T CD8⁺, lo que indicó que las células T CD4⁺ eran un importante mediador en la respuesta inflamatoria inducida por la I-R.

Los autores del estudio descrito⁷⁹ avanzaron una hipótesis acerca de cómo se sucederían los acontecimientos tras I-R hepática, que lograra explicar los hallazgos obtenidos. En primer lugar, el propio estímulo de la lesión por I-R produciría la directa activación de los linfocitos T CD4⁺ residentes en el hígado. Una vez activados, los linfocitos pueden segregar una serie de citocinas, tales como IFN-γ (interferón gamma), TNF-β (factor de necrosis tumoral beta) y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos), que tanto directa como indirectamente (a través de las citocinas secundarias secretadas por las células de Kupffer) activarían los neutrófilos para infiltrar el hígado. El estímulo de la I-R podría activar directamente las células de Kupffer dentro del hígado, que a su vez activarían a las células T CD4⁺ a través de las citocinas secretadas y, por tanto, existiría una activación recíproca entre las células de Kupffer y los linfocitos T CD4⁺ durante la I-R hepática⁸⁰.

Posteriormente han ido apareciendo diversos trabajos que confirman la importancia de los linfocitos T CD4⁺ en el reclutamiento de neutrófilos en la lesión hepática por I-R. Le Moine et al⁷¹ encontraron que los linfocitos T residentes en el hígado desempeñan un papel fundamental en los acontecimientos precoces después de la reperfusión de hígados preservados en frío. Anselmo et al⁸¹ observaron la reducción de la lesión hepática por I-R a través de la inhibición de la infiltración de los linfocitos T en isquemia caliente mediante el tratamiento previo con FTY720 (2-amino-2-[2-{4-octifenil} etil]-1,3-hidrocloruro de propanediol).

Caldwell et al⁸² observaron que después de la I-R, los linfocitos T CD4⁺ se reclutaron muy rápidamente en el hígado, se produjo el pico máximo dentro de la primera hora de la reperfusión y se mantuvo un número aumentado de linfocitos T CD4⁺ después de 4 h, lo que indica atrapamiento o infiltración de éstas células en el hígado. Sin embargo, no encontró evidencia de reclutamiento de linfocitos T CD8⁺ en ningún momento de la I-R, como, por otra parte, ya habían constatado otros autores⁷⁹.

Clásicamente los linfocitos T CD4 se han diferenciado funcionalmente en células Th1 (que producen INF-γ, linfotoxina y TNF-α) y Th2 (que producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13)^83,84. Posteriormente se ha añadido a estas subpoblaciones una nueva denominada Th17^85,86, con efectos sobre la infiltración de PMN. Esta subpoblación se ha implicado sobre todo en la defensa de superficies epiteliales frente a patógenos y desempeña presumiblemente un papel secundario en la lesión hepática por reperfusión. Existen datos que indican que un patrón inflamatorio de predominio Th1 incrementa la lesión por reperfusión, mientras que el patrón Th2 muestra un efecto protector frente a ésta⁸⁷; es pues el equilibrio Th1/Th2 el que determina en gran medida las consecuencias de la I-R⁸⁸.

Conclusión

La lesión hepática por I-R representa un proceso global que afecta a diversas vías, tanto moleculares como celulares. La inhibición de la producción de citocinas proinflamatorias y de ERO seguirán siendo estrategias prioritarias en el desarrollo de tratamientos contra la lesión por I-R hepática, si bien deberán reconsiderarse algunos aspectos.

Un delicado equilibrio entre células linfoides con función activadora de los procesos inflamatorios y otras con capacidad para inhibirlos parece desempeñar un papel decisivo en la lesión secundaria a la reperfusión de diversos órganos, incluyendo el hígado. Los estudios encaminados a definir de una forma precisa esta sucesión de acontecimientos tendrán una aplicación clínica de vital importancia, ya que permitirán diseñar estrategias de protección que potencien y mejoren las ya existentes, facilitarán la prevención de esta lesión y evitarán sus graves consecuencias.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Financiación

La ayuda BFU2007-65520 del Ministerio de Ciencia e Innovación ha financiado en parte este trabajo.