Introducción
La atorvastatina (ATV) es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa que hasta el momento ha mostrado una gran eficacia en la reducción de las concentraciones de colesterol y triglicéridos en pacientes con hiperlipemia primaria (familiar y no familiar) o hiperlipidemia combinada1. El régimen de dosificación de esta estatina varía entre 10 y 80 mg cada 24 h.
Aunque se ha descrito en la bibliografía algún método de determinación de atorvastatina en comprimidos2 y en plasma mediante técnicas de cromatografía líquida asociada a espectrometría de masas3-6, así como para otros fármacos del grupo, estas técnicas resultan muy complejas y económicamente inaccesibles para muchos grupos de investigadores.
La atorvastatina posee una propiedad química intrínseca que le confiere una gran utilidad, la fluorescencia; es decir, si una solución acuosa de atorvastatina es irradiada a una determinada longitud de onda, las moléculas del fármaco emitirán una radiación fluorescente directamente proporcional a la concentración de fármaco que se encuentre en el medio. Esta característica puede utilizarse para determinar las concentraciones de atorvastatina en muestras biológicas mediante las correspondientes técnicas cromatográficas de separación a través de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un detector de fluorescencia, técnica ya descrita para la atorvastatina7,8 y otras estatinas, como la fluvastatina9,10.
El objetivo de este estudio ha sido desarrollar y validar un método de determinación de atorvastatina en plasma, obtenido de un biomodelo experimental de arteriosclerosis en pollos a través de la técnica de HPLC con un detector de fluorescencia.
Métodos
Productos y reactivos
La atorvastatina cálcica pura fue proporcionada por Pfizer Pharmaceuticals (Madrid, España). Todos los reactivos utilizados fueron de alto grado de pureza (Sigma-Aldrich, España): acetonitrilo, hidrogenosulfato de tetrabutilamonio, metanol y polietilenglicol 200.
Soluciones patrón estándar
Las soluciones patrón de atorvastatina cálcica se prepararon a una concentración de 20 mg/l en una mezcla entre agua y metanol de 80:20, que fueron utilizadas como soluciones patrón madre, y posteriormente se añadirían al plasma blanco para la ulterior determinación de la precisión, la recuperación, la exactitud y el límite de cuantificación de la técnica. Estas soluciones patrón fueron protegidas de la luz en todo momento.
Método analítico
A 300 µl de plasma se les adicionó 300 µl de acetonitrilo para conseguir la precipitación de las proteínas del plasma. A continuación se sometió durante 5 min a un baño de ultraso-
nidos y, posteriormente, se centrifugó durante 10 min a 1.500 g. Se extrajeron 300 µl del sobrenadante que se introdujeron en los viales del autoinyector para su posterior procesamiento tras la inyección de 50 µl en el sistema.
El sistema HPLC está formado por una bomba LC-10Asvp, un detector de fluorescencia RF-10Axl y un autoinyector SIL-10Advp (Shimadzu, Kyoto, Japón). Todo el sistema está conectado al programa Shimadzu Class-VPTM Chromatography Data System programme (Shimadzu, Columbia, Estados Unidos). La separación cromatográfica se realizó mediante una columna de fase reversa Discovery C18, 150 * 4,6 mm, 5 µm (Supelco, Bellefonte, Estados Unidos). La fase móvil empleada consistió en una mezcla de acetonitrilo (40%) y una solución acuosa de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (5 g/l; pH = 3) (60%), y se utilizó un método isocrático con una velocidad de flujo constante de 1,0 ml/min. Con estás condiciones el pico correspondiente a la ATV en el cromatograma apareció aproximadamente a los 16,3 min.
Estudio de fluorescencia de atorvastatina
Previamente a la puesta en marcha del método, se realizó un estudio de fluorescencia de la molécula de ATV con el fin de establecer si ésta poseía propiedades fluorescentes, como era de esperar a la vista de su estructura química, y en caso afirmativo, establecer las longitudes de onda de excitación y de emisión a utilizar, ya que en la bibliografía no se encontraron datos al respecto. Mediante un espectrofluorímetro Shimadzu FP-6500 (Tokio, Japón) se establecieron los espectros de excitación y de emisión de la ATV, con unas longitudes de onda de excitación y de emisión óptimas:
*ex = 310 nm; *em = 386 nm
Calibración del método
La curva de calibración del método se realizó mediante la adición de cantidades adecuadas de la solución madre a muestras de plasma blanco para obtener concentraciones finales de ATV de 5, 25, 50 y 100 µg/ml. Estas muestras fueron procesadas del modo anteriormente descrito. La curva de calibración se obtuvo representando las áreas de los picos correspondientes a la ATV en los cromatogramas frente a las concentraciones estándares a que correspondería cada pico, realizando una regresión lineal a través de la cual se obtuvo una ecuación que permite calcular las concentraciones de ATV en función del área del pico obtenido.
Recuperación, precisión y exactitud
La recuperación del método se calculó mediante la determinación de ATV añadida a las mismas concentraciones estándares en la fase móvil utilizada. La precisión del método se realizó mediante ensayos repetidos (n = 5) interdía e intradía (3 días consecutivos) de 3 concentraciones estándares. La exactitud del método se calculó mediante la comparación de las concentraciones medidas frente a los valores reales añadidos.
Determinación de atorvastatina en el biomodelo de arteriosclerosis en el pollo
Se extrajo aproximadamente 1 ml de sangre de la vena braquial derecha del grupo experimental E (dieta aterogénica y administración de atorvastatina) a 5 animales del grupo. La muestra se extrajo justo antes de la administración de la dosis diaria de ATV con el fin de que correspondiera a la concentración mínima en el estado estacionario. La muestra de sangre se centrifugó (1.500 g, 10 min) y se extrajo el plasma, que fue procesado el mismo día de su extracción mediante el método descrito anteriormente.
Resultados
En la tabla 1 se muestran los coeficientes de recuperación de atorvastatina de las muestras utilizadas como control en plasma.
El análisis mediante regresión lineal de las concentraciones empleadas como patrón mostraron linealidad en el rango utilizado en nuestro estudio, con un coeficiente de correlación para todas las curvas realizadas >= 0,999, y se obtuvo la ecuación lineal mediante la cual es posible calcular las concentraciones de ATV en función del área del pico correspondiente.
Los análisis realizados con el fin de determinar la precisión (medida como coeficiente de variación [CV] intradía e interdía) y la exactitud11,12 (medida a través de la diferencia entre la concentración medida y la teórica esperada) se muestran en las tablas 2 y 3. Para todas las concentraciones utilizadas el CV y la exactitud fue < 5%, lo cual indica que el método es fiable, reproducible y exacto. Así, no es necesario utilizar un estándar interno.
El límite de cuantificación de esta técnica para la ATV se estableció como la concentración más baja de la curva de calibración obtenida, lo que garantiza que siempre se hallen concentraciones fiables al aplicar la ecuación obtenida.
Las media ± desviación estándar de las concentraciones obtenidas tras el procesamiento de las muestras de los animales fue de 6,3 ± 0,1 µg/ml.
Discusión
El desarrollo de un método de HPLC basado en la detección de fluorescencia requiere, en primer lugar, que la molécula analizada posea intrínsecamente la propiedad de fluorescencia cuando es excitada mediante una radiación a una longitud de onda determinada. La existencia de ciclos insaturados aromáticos con propiedades resonantes hacía pensar que la ATV posee propiedades de fluorescencia, lo cual fue corroborado mediante el estudio llevado a cabo, en el cual se obtuvieron sus espectros de emisión y excitación correspondientes que marcaron las longitudes de onda óptimas que debían utilizarse en la excitación (310 nm) y emisión (386 nm). Esto supone una gran ventaja, ya que no precisa derivar. El siguiente paso corresponde a la elección de la fase móvil más adecuada. Tras realizar diversas pruebas con distintos compuestos13, se observó que las mejores condiciones se alcanzaban con la mezcla acetonitrilo-hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (5 g/l) en una proporción del 40-60%, utilizando un método isocrático. Asimismo, tras probar distintas columnas, los resultados óptimos se alcanzaron con la de 150 * 4,6 mm y 5 µm de tamaño de partícula.
Por otro lado, el método elegido para procesar las muestras está basado en la precipitación de las proteínas con acetonitrilo y el posterior baño de ultrasonidos, aunque se pudo observar que no se conseguía precipitar la totalidad de las proteínas, a la vista de los picos que aparecían en los primeros tiempos de elucción (2-5 min), que podrían corresponder a la detección de los aminoácidos triptofano, fenilalanina y tirosina de las proteínas que tienen la capacidad de fluorescencia a determinadas longitudes de onda. Pero esta precipitación incompleta no supone ningún problema en nuestro estudio, ya que el pico correspondiente a la ATV apareció sobre los 16,3 min, muy alejado, por tanto, de esa contaminación inicial en los primeros tiempos; así se demuestra la buena selectividad del método, capaz de separar la ATV en el plasma del resto de componentes que pudieran aparecer. En estas condiciones, la precisión, la exactitud, la linealidad y la recuperación obtenidas garantizan unos buenos resultados al aplicar este método. Sin embargo, cabe destacar que el límite de cuantificación obtenido por la técnica, situado en 5 µg/ml, no es demasiado bajo, hecho que debe tenerse en cuenta a la hora de extrapolar este método al análisis de ATV en otros biomodelos animales, así como en el plasma humano, ya que las concentraciones obtenidas en las muestras de plasma del biomodelo de pollo están por encima de nuestro límite de cuantificación, lo cual valida nuestro método solamente en este biomodelo14. Por consiguiente, para aplicar este método a otro biomodelo o a seres humanos, habría que estudiar de nuevo todos los factores descritos en este estudio para saber si en otros casos el método resulta válido. A estos efectos, hay que resaltar que la disponibilidad de técnicas que nos permitan medir las concentraciones plasmáticas de atorvastatina u otros fármacos en biomodelos animales, es de un gran importancia a la hora de diseñar e interpretar los resultados obtenidos. Con frecuencia, las dosis utilizadas son extrapoladas erróneamente de las dosis utilizadas en seres humanos, con lo que las concentraciones del fármaco que se obtendrán en el biomodelo correspondiente con frecuencia difieren considerablemente de las alcanzadas en humanos. Este problema puede evitarse realizando un estudio farmacocinético previo con el fin de conocer los principales parámetros farmacocinéticos en el biomodelo animal concreto, como el aclaramiento plasmático, el tiempo de vida media y la biodisponibilidad; de este modo se puede diseñar un adecuado régimen de dosificación en función de nuestro biomodelo. El primer paso para ello ha sido establecer un sistema de detección de atorvastatina en plasma mediante una técnica de HPLC, que en nuestro estudio ha mostrado unos buenos resultados en cuanto a su facilidad, bajo coste y buena reproducibilidad.