Haemophilus parainfluenzae es un microorganismo que coloniza de manera habitual el tracto respiratorio superior. Como patógeno se asocia cada vez con más frecuencia con infecciones importantes como endocarditis, infecciones osteoarticulares, respiratorias y ORL1-3. Además, el uso creciente de métodos moleculares en muestras clínicas ha permitido asociar esta bacteria a un mayor número de infecciones4. La determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos presenta interés para dirigir el tratamiento, pero además permite identificar mecanismos de resistencia en esta especie que pueden servir como modelo para el estudio de la resistencia en Haemophilus influenzae, la especie con mayor impacto clínico. En H.parainfluenzae la resistencia a quinolonas es poco frecuente. Un estudio realizado en Japón entre los años 1998 y 2000 mostraba una prevalencia del 3,4%, y en nuestro país un estudio localizado en el área de Madrid (2000-2004) no encontró ninguna cepa con estas características5,6. La base molecular de esta resistencia, como ocurre en otros microorganismos, reside en mutaciones de la región QRDR de los genes gyrA y parC7,8.
En este trabajo se describe la caracterización molecular de la resistencia de alto nivel a quinolonas en una cepa clínica de H.parainfluenzae aislada a partir de una muestra respiratoria (esputo). La identificación se llevó a cabo siguiendo los procedimientos habituales con el APINH y el estudio de la dependencia de los factores X y V en Mueller-Hinton agar. Para el estudio de la sensibilidad se determinaron los valores de CMI siguiendo los métodos estandarizados mediante E-test en HTM agar (Haemophilus Test Medium agar) en atmósfera de 5% CO29. Se utilizó la cepa H.influenzae ATCC49247 como cepa control. Los resultados se muestran en la tabla 1. Para la caracterización molecular de la resistencia se utilizó el ADN genómico de la cepa para estudiar mediante PCR y secuenciación las mutaciones en los genes gyrA, gyrB, parC y parE con iniciadores utilizados previamente8. Como cepa de referencia para el estudio de las mutaciones se utilizó la cepa H.parainfluenzae T3T1 (disponible en la base de datos del GenBank NC_015964). Se encontraron mutaciones en GyrA (Ser84Phe y Asp88Tyr) y en ParC (Ser84Tyr, Ser138Thr y Met198Leu). No se encontraron mutaciones en GyrB o ParE. Las posiciones Ser84 y Asp88 en GyrA y Ser84 en ParC son las posiciones donde residen con mayor frecuencia las mutaciones encontradas en bacterias gramnegativas resistentes a quinolonas. En nuestro caso, el patrón de mutaciones observado en GyrA coincide exactamente con el patrón observado en estudios previos de H.parainfluenzae; sin embargo, a nivel de ParC, aunque las posiciones sustituidas son exactamente las mismas que se han descrito en estudios previos, la sustitución Ser84Tyr no se había observado anteriormente en ningún aislado de H.parainfluenzae o H.influenzae. Se descartó mediante PCR la presencia de mecanismos de resistencia transferibles por plásmidos (qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, aac[6′]-Ib-cr, qepA, oqxAB) que pudieran contribuir a la resistencia, fenómeno que se ha observado recientemente en otras cepas de Haemophilus spp.10
CMI de quinolonas y otros antimicrobianos en H.parainfluenzae 004460 y H.influenzae ATCC 49247
| Antimicrobiano | H. parainfluenzae | H. influenzae ATCC 49247 |
| Quinolonas | ||
| Ácido nalidíxico | >256 | 1 |
| Norfloxacino | >32 | 0,06 |
| Ofloxacino | >32 | 0,03 |
| Ciprofloxacino | >32 | 0,015 |
| Levofloxacino | >32 | 0,015 |
| Moxifloxacino | >32 | 0,015 |
| Otros | ||
| Ampicilina | 1,5 | 2 |
| Amoxicilina-clavulánico | 0,5 | 1 |
| Cefuroxima | 0,5 | 1 |
| Cefotaxima | 0,03 | 0,125 |
| Claritromicina | 16 | 8 |
| Cotrimoxazol | 0,5 | 0,06 |
| Cloranfenicol | 1 | 0,5 |
Resultados expresados en μg/ml.
Este trabajo caracteriza una cepa H.parainfluenzae con alto nivel de resistencia a quinolonas y ha permitido describir una mutación nueva (Ser84Tyr en ParC). La importancia de este estudio reside en el hecho de que este microrganismo produce con cierta frecuencia infecciones respiratorias en la comunidad, patología en la que esta clase de antimicrobianos se consideran fármacos de primera línea. Una prevalencia elevada de este tipo de cepas podría plantear limitaciones a las quinolonas como opción de tratamiento frente a H.parainfluenzae que empieza a emerger como patógeno a tener en cuenta con el advenimiento de técnicas moleculares de diagnóstico. Recientemente nuestro grupo realizó el primer estudio molecular completo sobre la resistencia a quinolonas de alto nivel en esta especie utilizando un aislamiento clínico8. El hallazgo de otra cepa en tan corto espacio de tiempo podría indicar que la resistencia a quinolonas en esta especie está aumentando con respecto a datos previos, corroborado por la aparición de nuevas mutaciones cromosómicas en la región QRDR no descritas hasta ahora6. Podría ser útil realizar un estudio epidemiológico para conocer la prevalencia actual de este tipo de cepas en nuestro país con el objetivo de valorar adecuadamente las opciones terapéuticas frente a esta bacteria.
FinanciaciónEste trabajo fue financiado por el Ministerio de Sanidad y Consumo, Instituto de Salud Carlos III (PI11-00934), y por el Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III, y cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional «Una manera de hacer Europa» FEDER, Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI RD12/0015).
