Fundamento: Se analizó comparativamente la carga viral del virus de la hepatitis C (VHC) mediante dos métodos de cuantificación, bDNA-2.0 y Amplicor Monitor, con dos objetivos: en primer lugar, determinar la relación carga viral-genotipo del VHC, y en segundo lugar, evaluar la carga viral en muestras seriadas de suero, en pacientes con valores persistentemente normales o < 2 veces los valores normales de transaminasas o con transaminasas elevadas (> 2 veces los valores normales) en un área con una elevada prevalencia del genotipo 1.
Resultados: Se observó correlación (r = 0,7) entre ambos métodos de cuantificación, si bien la carga viral es menor (9 veces) por Monitor que por bDNA-2.0 (p < 0,0001) e independiente del genotipo. La relación Monitor/bDNA-2.0 es menor (10,4 veces) en los pacientes con genotipo no-1 que en los pacientes con genotipo 1a y 1b (p = 0,01 y p = 0,005, respectivamente). La carga viral es similar en muestras seriadas de suero. Las características virológicas (genotipo y carga viral) son similares en los pacientes con transaminasas normales o discretamente elevadas y en los pacientes con transaminasas elevadas (> 2 veces lo valores normales). La carga viral por ambos métodos no se relaciona con la edad, sexo, duración conocida de la infección, modo de transmisión ni con el índice de actividad histológica.
Conclusión: La carga viral es independiente del genotipo. La determinación de la carga viral en una muestra única de suero refleja adecuadamente la carga viral en los pacientes con infección crónica por VHC. El genotipo VHC y la carga viral es similar en los que presentan transaminasas normales que en los que presentan transaminasas elevadas.
Background: Two standardized techniques, Quantiplex (bDNA-2.0) and Amplicor Monitor have been evaluated for the quantification of virus load of HCV with these objectives: a) determinate the relationship between virus load and genotype, and b) evaluate the virus load in serial serum samples and in patients with normal or slightly increased liver enzymes in an area with a high prevalence of genotype 1.
Results: A significant correlation of 0.7 (p < 0.0001) in virus load has been observed by both methods, but the virus load is smaller by Monitor than by Quantiplex and does not depend on genotype. The relationship Monitor/Quantiplex is smaller in patients with non-1 genotype than in patients with genotype 1a (p = 0.01) and 1b (p = 0.005). Virus characteristics are similar in patients with normal or slightly increased enzymes than in patients with high enzymes. Virus load by both methods is not related to the age, sex, know duration of the infection, transmission manner of the infection neither to the hystologic activity index.
Conclusion: The virus load not depends on genotype. The determination of virus load in a single serum sample adequately reflects the virus load are in several serum samples in patients with chronic HCV infection. The genotype and the virus load are similar in patients with normal enzymes than in patients with high enzymes.
Introducción
La mayoría de los estudios señalan que el genotipo del virus de la hepatitis C (VHC) es un factor predictivo importante en la respuesta al tratamiento con interferón (IFN)1-8, mientras que existen discrepancias respecto a si la carga viral4-14 también es factor predictivo. Se cuestiona, pues, si la carga viral es dependiente o no del genotipo del virus. Estas discrepancias pueden deberse, al menos en parte, a los diferentes métodos de cuantificación viral utilizados15-17.
Por otra parte, cabe preguntarse si la carga viral es estable en muestras seriadas de suero18-21, si los pacientes con transaminasas persistentemente normales o mínimamente elevadas tienen características virológicas (genotipo y carga viral) similares a los pacientes con transaminasas elevadas22-29 y si la carga viral se correlaciona con la severidad de la lesión histológica y/o con las transaminasas11,20-27,30-34. Obtener una respuesta a estas cuestiones nos ayudará a definir si este grupo de pacientes es subsidiario de inclusión en las indicaciones del tratamiento con IFN.
Por ello, es importante disponer de técnicas fiables en la cuantificación del ARN-VHC35 que nos permitan conocer la relación entre la carga viral y el genotipo, su influencia en la severidad y progresión de la lesión hepática, así como su valor predictivo en la respuesta al tratamiento.
Los objetivos de este estudio fueron: a) evaluar dos técnicas, Quantiplex (bDNA-2.0) y Amplicor Monitor, estandarizadas para la cuantificación de la carga viral del VHC; b) analizar la carga viral en muestras de suero seriadas de pacientes con infección crónica por VHC y determinar el grado de fluctuación de la misma; c) analizar la relación de la carga viral con el genotipo del VHC, y d) determinar las características virológicas (genotipo y carga viral) de pacientes con infección crónica por VHC con transaminasas persistentemente normales o poco elevadas en nuestro medio, que presenta una elevada prevalencia del genotipo 1.
Pacientes y métodos
Se han incluido 63 pacientes, 30 varones y 33 mujeres, con infección crónica por VHC (positivos para anti-VHC y ARN-VHC) y negativos para anti-VIH. Los pacientes se distribuyeron en dos grupos: grupo A, con 17 pacientes con transaminasas (GPT) persistentemente normales o poco elevadas, es decir, < 2 veces los valores normales (mediana: 38; rango: 21-77 U/l, valores normales: ¾ 40 U/l) con un seguimiento de 48 meses (límites: 12-69 meses), no tratados con IFN, y grupo B, con 46 pacientes con GPT > 2 veces los valores normales en tres determinaciones durante al menos 12 meses (mediana, 118; límites, 46-361 U/l) y que posteriormente fueron tratados con IFN. El valor de la GPT se estableció mediante la mediana del número de determinaciones pretratamiento (GPT: 4 límites 2-8).
Las características basales de los pacientes se expresan en la tabla 1.
Los pacientes del grupo A fueron monitorizados cada 3 meses durante el primer año de seguimiento y cada 6 meses posteriormente, mientras que los pacientes del grupo B fueron monitorizados cada 3 meses hasta iniciar el tratamiento antiviral. La monitorización consistió en una evaluación clínica, determinación de las pruebas de función hepática mediante un autoanalizador (GOT, GPT, GGT, albúmina y colesterol), recuento y fórmula leucocitaria, recuento de plaquetas y se obtuvo una muestra de suero que fue conservada a 80 °C en partes alícuotas (de 3 a 5) de aproximadamente 1 ml. La congelación de las muestras de suero se realizó como máximo a las 2-3 h de la extracción de sangre.
Detección del ARN-VHC
El método utilizado consistió en una doble amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mediante el uso de iniciadores derivados de la región 5'UTR del genoma viral36,37. Las reacciones pre-PCR y post-PCR se realizaron separadamente y se tomaron las medidas propuestas por Kwok e Higuchi para evitar la contaminación en las diferentes etapas de la amplificación38.
El ARN-VHC se determinó en 6 (4-8) muestras de suero en cada paciente del grupo A y en 2 (1-3) muestras seriadas de suero antes del tratamiento en cada paciente del grupo B.
Genotipo del VHC
Se determinó mediante el método LiPA (Line Probe Assay). Este método permite la detección de los genotipos 1-6 del VHC mediante la hibridación reversa en tiras de membrana del producto amplificado por PCR con iniciadores derivados de la región 5'UTR del genoma viral25,26.
Carga viral del VHC
Se han utilizado dos métodos: a) la prueba del ADN ramificado o bDNA (Quantiplex HCV RNA 2.0, Chiron Corporation)39,40, y b) el Amplicor HCV Monitor Test (Roche)41,42. La carga viral del ARN-VHC se expresa para la técnica de bDNA-2.0 en megaequivalentes/ml (MEq/ml) y para Monitor en copias/ml.
La carga viral del VHC se determinó en 126 muestras de suero, de las cuales 91 fueron seriadas (51 de 13 pacientes del grupo A y 40 de 15 pacientes del grupo B). Se comparó la carga viral del VHC por ambos métodos en la muestra de suero más reciente de los 63 pacientes, por grupos de pacientes y según el genotipo. Se evaluó también la relación Monitor/bDNA-2.0 de los pacientes con genotipo 1a y no-1 respecto a los pacientes con genotipo 1b.
Asimismo, se analizó la carga viral por ambos métodos en relación con la edad (mayor frente a menor de 45 años), sexo, duración de la infección (más frente a menos de 5 años), modo de transmisión de la infección del VHC (transfusión/desconocida) y con el índice de actividad histológica (índice de Knodell: mayor frente a menor de 10).
Por último, se comparó la carga viral del VHC y se determinó la concentración máxima/mínima de ARN-VHC por bDNA-2.0 y por Monitor en 101 muestras seriadas de suero en los grupos A y B.
Análisis estadístico
Las variables cuantitativas fueron expresadas como mediana y límites, y se compararon por medio de tests no paramétricos (U de Mann-Whitney, Kruskal Wallis y Friedman) y las variables cualitativas mediante el test de la * 2 y la prueba de Fisher. Un valor de p ¾ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Para determinar la correlación de variables se utilizó el coeficiente de Spearman.
Resultados
De los 63 pacientes, 33 (52,3%) tenían factor de riesgo conocido para la infección del VHC, con una duración conocida de la infección de 156 meses (límites, 24-400). La distribución del genotipo, la duración conocida de la infección, la edad y el sexo fueron similares en ambos grupos, mientras que el índice de actividad histológica fue significativamente diferente en los dos grupos (tabla 1).
No hubo diferencias estadísticamente significativas en la distribución del genotipo entre ambos grupos (grupo A, 1a: 1; 1b: 13; 1a1b: 1; 2a: 1; 3: 0; otros: 1; indeterminado: 1; grupo B, 1a: 10; 1b: 27; 1a1b: 1; 2a: 0; 3: 6; otros: 1; indeterminado 1; p = 0,13).
Se observó correlación de la carga viral entre los dos métodos de cuantificación (fig. 1), tanto al comparar la carga viral en todas las muestras de suero (r = 0,70; p < 0,0001) como al comparar la carga viral por grupos de pacientes (grupo A: r = 0,64; p < 0,005 y grupo B: r = 0,70; p < 0,0001) y por genotipos (1b: r = 0,81; p < 0,001; 1a: r = 0,51; p < 0,1). La correlación fue, en cambio, menor en los pacientes con genotipo no-1 (r = 0,43; p < 0,2).
La carga viral fue significativamente mayor por bDNA-2.0 que por Monitor (tabla 2), tanto al comparar todas las muestras de suero como al hacerlo por grupos de pacientes y según el genotipo (tabla 3). La carga viral fue aproximadamente 9 veces mayor por bDNA-2.0 que por Monitor respecto a todas las muestras de suero.
En cambio, la carga viral fue similar por bDNA-2.0 al comparar los grupos A y B, así como en relación con el tipo de genotipo. Por Monitor fue también similar al comparar los grupos A y B y los genotipos 1a y 1b, y menor en aquellos con genotipo no-1 (tabla 3). La carga viral por Monitor es 7,1 y 4,9 veces menor en los pacientes con genotipo no-1 que en los pacientes con genotipo 1b y 1a, respectivamente (tabla 3).
La relación de la carga viral Monitor/bDNA-2.0 fue similar al comparar el genotipo 1a frente al genotipo 1b (Monitor/bDNA-2.0; p = 0,3), mientras que fue significativamente menor al comparar el genotipo no-1 frente al 1b y el genotipo no-1 frente al 1a (p = 0,005, y p = 0,01, respectivamente) (tabla 4).
Por otra parte, la carga viral fue similar, por ambos métodos, al comparar las muestras seriadas de suero entre sí (fig. 2). La concentración máxima/mínima (Cmáx/mín) fue también similar y poco elevada, tanto por bDNA-2.0 como por Monitor (2,6 [1,09-14,9] frente a 2,74 [1,05-51,1]; p < 0,14) en todas las muestras seriadas de suero.
La concentración de ARN-VHC fue similar por ambos métodos entre varones y mujeres, en los pacientes con índice de actividad histológica mayor frente a menor de 10, en los pacientes con duración conocida de la infección por VHC mayor frente a menor de 13 años y en relación con el factor de riesgo para la transmisión del VHC (transfusión/desconocida). La carga viral fue menor por Monitor en los pacientes menores de 35 años y similar por bDNA-2,0 independientemente de la edad (tabla 5).
Discusión
En este estudio se han utilizado dos métodos para determinar la carga viral en individuos infectados con diferentes genotipos y con un patrón enzimático diferente. La eficacia de los diversos métodos utilizados para determinar la carga viral en relación con el genotipo del VHC puede influir en los resultados de los análisis estadísticos. Este hecho explica, al menos parcialmente, las controversias que existen acerca de la influencia de la carga viral en la severidad de la lesión histológica y su valor predictivo de la respuesta al tratamiento.
Nuestro estudio pone de manifiesto que la carga viral no depende de la edad, de la duración de la infección por VHC, del índice de actividad histológica del perfil enzimático (transaminasas persistentemente normales, poco elevadas o elevadas), ni del genotipo del virus C.
La carga viral determinada por Monitor es 9 veces menor que por bDNA-2.0, si bien la relación de la carga viral Monitor/ bDNA-2.0 es 10,4 veces menor en los pacientes con genotipo no-1 (la mayoría con tipo 3), que en los pacientes con genotipo 1b. Estos resultados son similares a los descritos recientemente por Hawkins et al43. Por ello, la carga viral por Monitor en los pacientes con genotipo no-1 debería de multiplicarse por un factor de corrección ( * 10,4).
Hawkins et al43 comparan 4 métodos de determinación de la carga viral (bDNA-1.0, bDNA-2.0, Monitor y un método de dilución) utilizando transcritos de ARN-VHC de concentración conocida de diferentes genotipos proporcionados por Chiron. Los resultados de este estudio demuestran que el bDNA-2.0 detecta con la misma eficiencia la carga viral en pacientes con diferentes genotipos, mientras que el Amplicor Monitor VHC detecta con una eficiencia 9 y 12 veces menor los tipos 2 y 3 que el tipo 1.
La reducida eficacia del Amplicor Monitor en la detección del genoma de los genotipos no-1 probablemente tiene su origen en desapareamientos entre los iniciadores y la secuencia diana del VHC. La existencia de desapareamientos44 entre la secuencia del iniciador directo y la diana (uno en el genotipo 2 y dos en el genotipo 3), daría lugar, durante la fase exponencial de la reacción de amplificación, a una desviación de la misma hacia la del competidor interno que carece de estos desapareamientos.
En nuestro estudio, la carga viral determinada por Monitor es similar cuando aplicamos el factor de corrección ( * 9) en los pacientes con genotipo no-1 en los pacientes con genotipo 1b.
En suma, pues, los resultados de nuestro estudio demuestran que la carga viral determinada por bDNA-2.0 es similar e independiente del genotipo.
Nuestros resultados ponen también de manifiesto que la determinación de la carga viral por ambos métodos es similar en muestras seriadas de suero (no más de 3 veces). En consecuencia, la determinación de la concentración de ARN-VHC en una muestra única de suero refleja fielmente la carga viral en los pacientes con infección crónica por VHC. En cambio, la mayor fluctuación de la carga viral observada en el grupo de pacientes con transaminasas normales o poco elevadas con respecto al grupo con transaminasas moderadamente elevadas puede explicarse por el reducido número de casos incluidos o por un fenómeno de inmunotolerancia en el grupo A con respecto al grupo B. Estos resultados están en controversia con otros estudios que utilizan otras técnicas de cuantificación, particularmente RT-PCR competitivas no estandarizadas, en los que se pone de manifiesto una marcada fluctuación de la viremia18-21.
Por otra parte, se ha sugerido en algunos estudios9,22-27,45, pero no en otros30,31,44-48, que la carga viral se relaciona con el modo de transmisión del VHC, con la duración de la infección y con la severidad de la lesión histológica. En nuestro estudio, si bien el número de pacientes incluidos es reducido, no encontramos relación entre la carga viral por ambos métodos y el sexo, el modo de adquisición de la infección (transfusión/desconocida), la duración conocida de la infección (más frente a menos de 13 años) y la severidad de la lesión histológica (índice de actividad histológica, mayor frente a menor de 10), mientras que la edad (mayor frente a menor de 35 años) fue similar por bDNA-2.0, pero significativamente mayor por Monitor, en los pacientes mayores de 35 años. No obstante, aplicando el factor de corrección ( * 9) para la carga viral por Monitor en los pacientes con genotipo no-1, la carga viral tampoco se relacionó con la edad. La distribución de los pacientes por edad (mayor frente a menor de 35 años) fue similar también entre los pacientes con transaminasas normales o elevadas y los pacientes con transaminasas elevadas (p = 0,81).
Algunos estudios22-27, aunque no otros28,29, postulan que la carga viral determinada por métodos de RT-PCR competitiva es menor en aquellos con transaminasas normales que en pacientes con transaminasas elevadas. Es posible que la utilización de métodos no estandarizados en algunos de estos estudios sea la razón, al menos parcial, de estas discrepancias. En nuestro estudio, las características virológicas (genotipo y carga viral) de los pacientes con infección crónica por VHC con transaminasas normales o poco elevadas son similares a las de los pacientes con transaminasas elevadas, en particular a las de los pacientes que posteriormente fueron tratados con IFN y que no presentaron respuesta al mismo. Estos resultados sugieren, al menos desde el punto de vista virológico, que los pacientes con estas características no serían candidatos idóneos al tratamiento con IFN, criterio compartido por otros autores49-52.
En consecuencia, la carga viral del VHC (ARN-VHC) no es el único factor que influye en la severidad de la lesión hepática. Es posible que ésta pueda tener un origen multifactorial en el que interaccionan el sistema inmunológico, la carga viral, el genotipo y el grado de quasiespecies.
En resumen, la concentración de ARN-VHC es significativamente mayor por bDNA-2.0 que por Monitor, por lo que la carga viral determinada por Monitor debe multiplicarse por un factor de corrección 1 ( * 10,4) en pacientes con genotipo no-1. La fluctuación de la carga viral en muestras seriadas de suero es poco elevada. Se sugiere que la carga viral es independiente del genotipo. Las características virológicas de los pacientes con transaminasas normales o < 2 veces los valores normales, en un área geográfica con una elevada prevalencia del genotipo 1b, son similares a las de los pacientes con transaminasas elevadas.
