Fundamento: Detección de contaminaciones cruzadas en el laboratorio mediante el análisis de los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de cepas de Mycobacterium tuberculosis.
Material y métodos: Se han analizado 224 aislamientos obtenidos durante un período de 5 años mediante la técnica de tipificación molecular del fragmento IS6110 según procedimientos estandarizados.
Resultados: Se detectaron cuatro grupos de aislamientos en los que había muestras cuya fluoroscopia era negativa y cuyos cultivos presentaron un bajo número de unidades formadoras de colonias. Estas muestras habían sido procesadas en el mismo lote y fecha que otras con fluoroscopia fuertemente positiva con las que compartían un mismo patrón de RFLP. Las muestras sospechosas de contaminación correspondieron a 15 pacientes. La revisión de las historias clínicas de cuatro de ellos reveló que no presentaban las manifestaciones típicas de tuberculosis.
Conclusiones: Cuando se obtienen aislamientos de M. tuberculosis provenientes de muestras con fluoroscopia negativa se deben revisar los resultados de las muestras procesadas en el mismo lote y la historia clínica del paciente. Si con estos datos se sospecha la posibilidad de una contaminación cruzada, dichos cultivos deben analizarse por técnicas de tipificación molecular.
Background: Detection of cross-contamination in the laboratory by restriction fragments length polymorphism (RFLP) analysis of Mycobacterium tuberculosis strains.
Material and methods: 224 strains isolated during a five years period were characterized by IS6110 fingerprinting performed (RFLP) by standardized protocols.
Results: Four groups of isolates with smear-negative specimens and low number of colony formit units were detected. They were processed in the same batch and day than other smear-positive specimens with identical RFLP patterns. Fifteen patients were involved and the review of four patients' charts showed that they did not have the typical manifestations of tuberculosis.
Conclusions: When M. tuberculosis isolates were obtained from smear-negative specimens, the results of specimens processed in the same batch and the patients' charts should be reviewed. If with these data the possibility of cross-contamination is suspected, the isolates must be analyzed by molecular typing methods.
Introducción
El diagnóstico de la tuberculosis no siempre puede basarse en datos clínicos ya que con frecuencia, especialmente en el caso de pacientes inmunocomprometidos, resultan inespecíficos. La prueba más específica para diagnosticar la enfermedad es el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis. En los últimos años, coincidiendo con el auge de la tuberculosis y la aplicación de técnicas moleculares, se han descrito numerosos casos de falsos diagnósticos de tuberculosis debidos a contaminaciones cruzadas en los laboratorios durante el procesamiento de las muestras1-5.
En el año 1993, el estudio retrospectivo en nuestro servicio de un falso brote de infecciones por Mycobacterium kansasii ocurrido en 1992 puso en evidencia la existencia de contaminaciones cruzadas en el laboratorio que hasta ese momento no se habían sospechado. Este hecho alertó sobre la posibilidad de que se pudieran haber diagnosticado falsos casos de tuberculosis.
La aplicación y estandarización del análisis de los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) capaz de diferenciar cepas de M. tuberculosis6 permite agrupar cepas con un mismo origen, por lo que es un instrumento muy valioso de discriminación ante la sospecha de una contaminación.
La detección de posibles contaminaciones cruzadas mediante el análisis retrospectivo de los RFLP de las cepas de M. tuberculosis aisladas en el laboratorio y el estudio de las historias clínicas de los pacientes ha sido el objeto del presente trabajo.
Material y métodos
Muestras
Se analizaron un total de 224 cepas de M. tuberculosis que correspondían a 200 pacientes diagnosticados entre el 1 de enero de 1992 y el 31 de diciembre de 1996. Se recogieron los datos clínicos (edad, procedencia, forma de presentación de la tuberculosis y serología para el virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]) de los pacientes estudiados.
Procesamiento de las muestras
La descontaminación de las muestras se realizó siguiendo procedimientos estandarizados7. Sin embargo, hasta finales de 1993 las muestras se descontaminaban en el mismo envase en que se recibían, añadiendo a cada uno de ellos un volumen igual de N-acetil-L-cisteína-NaOH que provenía de un único envase. La solución neutralizante también se preparaba en un envase único, a partir del cual se llenaban los tubos de muestra. Tras la centrifugación, el sobrenadante se decantaba también en un recipiente común. A partir de finales de 1993 se modificaron estos procedimientos, de modo que la mezcla de N-acetiI-L-cisteína-NaOH, una vez preparada se distribuía en alícuotas de 2 ml en envases individuales a los que se añadía la misma cantidad de la muestra a procesar. La solución neutralizante se preparaba también en tubos individuales, uno para cada muestra. La apertura y cierre de los tubos se realizaba de manera secuencial, de modo que en ningún momento hubiera dos tubos con muestra abiertos simultáneamente. Además, entre el tapón y los guantes del operador se anteponía siempre una servilleta de papel empapada de desinfectante que se renovaba con cada muestra. Del mismo modo, tras la centrifugación, el sobrenadante se decantaba en un envase individual para cada muestra. Por último, todo el personal involucrado en el procesamiento de las muestras estaba especialmente alertado de la importancia del cuidado de todas estas medidas.
Los sedimentos se tiñeron con auramina O fluorescente8 y tinción de Ziehl-Neelsen9. Las micobacterias se recuperaron en medios de Löwenstein-Jensen o agar 7H11 Middlebrook. La identificación de las cepas se realizó mediante el sistema AccuProbe (GenProbe) y pruebas bioquímicas convencionales. De cada una de las muestras procesadas se registró la fecha de obtención de la muestra, fecha y número de lote de la descontaminación, resultado de la fluoroscopia, fecha de obtención del cultivo positivo y número de colonias obtenidas.
Análisis de los RFLP
Para la extracción del ADN, las cepas se subcultivaron en placas de agar 7H11 Middlebrook a 37 °C durante 3 semanas. La extracción del ADN genómico de M. tuberculosis, la digestión del ADN con la endonucleasa de restricción Pvull, la separación de los fragmentos mediante electroforesis en geles de agarosa, la transferencia a membranas de nailon, el marcaje quimioluminiscente de la sonda de ADN y la hibridación y detección de la sonda se realizaron según los procedimientos estandarizados6. Como sonda específica para el complejo M. tuberculosis se empleó un fragmento de 867 pares de bases de la secuencia de inserción IS6110 obtenido mediante PCR con los oligonucleótidos cebadores GAB-1 (5'-CTGACCGAGCTGGGTGTGC) y GAB-2 (5'-TCTGATCTGAGACCTCAGCC)10. El fragmento se purificó del gel de agarosa mediante el sistema GenecleanII (BIO 101 Inc.). Como referencia estándar se incluyó en cada gel ADN genómico de M. tuberculosis Mt14323 digerido con la enzima Pvull. Las imágenes obtenidas tras la hibridación con la sonda IS6110 fueron escaneadas (HP ScanJet, Hewlett-Packard) y los patrones de los RFLP analizados por ordenador mediante el programa GelCompare 4.0 (Applied Maths).
Resultados
Se obtuvieron un total de 146 patrones de RFLP diferentes en los 224 aislamientos analizados. El patrón de RFLP fue siempre idéntico en todos los aislamientos pertenecientes a un mismo paciente. De los 146 patrones diferentes, 21 fueron compartidos por uno o más aislamientos, y los aislamientos obtenidos en 125 pacientes (62,5%) presentaron un patrón de RFLP único, lo que sugería que no existía relación alguna entre esos casos. Se comprobó que en cuatro de los 21 grupos relacionados había muestras cuya fluoroscopia era negativa y que fueron procesadas en el mismo día y junto a muestras con fluoroscopia fuertemente positiva. Además, los cultivos de todas estas muestras con fluoroscopia negativa presentaron un bajo número de unidades formadoras de colonias. En estos cuatro grupos, las muestras fueron procesadas entre los meses de junio y agosto de un mismo año.
El grupo 1 fue definido por 15 aislamientos (tabla 1), tres del paciente 85a, dos del paciente 47a, dos del paciente 51a y una del resto de los pacientes. En la figura 1 se observa el patrón de RFLP de nueve de los aislamientos pertenecientes a nueve pacientes del grupo 1. No fue posible encontrar relación epidemiológica entre los pacientes de este grupo, excepto en el caso de los pacientes 47a y 85a que eran vecinos de la misma pequeña localidad, y el diagnóstico final de ambos fue de tuberculosis. El estudio detallado de los registros de laboratorio demostró que la mayoría de las muestras fueron procesadas en las mismas fechas. Se comprobó que ocho muestras con fluoroscopia negativa (muestras 430, 432, 433, 434, 437, 443, 597 y 693) se procesaron siempre al lado de muestras con fluoroscopia fuertemente positiva (muestras 431, 436, 442, 596 y 692), lo que sugiere que fueron contaminaciones durante el procesamiento. Los aislamientos procedentes del paciente 85a, del que se procesaron tres muestras de esputo en 3 días diferentes, fueron el origen de la contaminación de las muestras de tres pacientes distintos (52a, 77a y 84a). Además, los aislamientos del paciente 47a dieron lugar a la contaminación de cinco muestras distintas correspondientes a cuatro pacientes (48a, 49a, 50a y 51a). Muy probablemente, la muestra 431 fue el origen de la contaminación de las muestras 430, 432, 433 y 434; la 436 lo fue de la 437, la 442 de la 443, la 596 de la 597 y la 692 de la 693. Las muestras de los pacientes 24a y 61p tuvieron fluoroscopias negativas, pero se descartó que se debiera a una contaminación cruzada por haber sido procesadas individualmente en lotes y en días distintos.
De manera similar a lo descrito para el grupo 1 se definieron los grupos 2, 3 y 4 (tabla 1). El grupo 2 fue definido por 11 aislamientos, de los cuales cinco de ellos (999, 4, 16, 17 y 18) pertenecientes a cuatro pacientes (147a, 148a, 152a y 153a) tuvieron una fluoroscopia negativa y se procesaron al lado de muestras con fluoroscopia fuertemente positiva (10, 11 y 12). El grupo 3 fue definido por cinco muestras de sólo dos pacientes. Las muestras 930 y 931 tuvieron una fluoroscopia negativa y se procesaron inmediatamente después de la 926, en la que se obtuvo fluoroscopia positiva. Por último, el grupo 4 fue definido por nueve aislamientos de cinco pacientes. Las muestras del paciente 55a fueron el origen de la contaminación de las de los pacientes 56a, 57a y 58a. Así, muy probablemente la muestra 447 fue el origen de la contaminación de las muestras 441 y 448, la 455 de las 456 y 458, y la 465 de la 466.
Si bien no se pudieron revisar las historias clínicas de los 15 pacientes en cuyas muestras se sospechó un resultado falso positivo, se comprobó que cuatro de ellos no presentaron las manifestaciones típicas de tuberculosis, lo que confirma que se trataba de contaminaciones cruzadas. Además, dos de ellos (147a y 148a) fueron sometidos a tratamiento antituberculosos
Discusión
La frecuencia de cultivos falsos positivos para M. tuberculosis debido a la contaminación cruzada en el laboratorio ha sido difícil de determinar debido a la falta de un marcador específico de cepa, aunque algunos autores lo habían advertido al utilizar la técnica de la fagotipificación11,12. La aplicación del análisis por RFLP y su estandarización6, capaz de diferenciar cepas de M. tuberculosis, proporciona un poderoso instrumento para el estudio de los cultivos falsos positivos1-3,5,13,14.
El estudio en 1993 de un falso brote por M. kansasii ocurrido el año anterior, que pudo llevarse a cabo por las características fenotípicas de esta especie y por la baja frecuencia con la que se aísla, demostró la existencia de contaminaciones cruzadas en el laboratorio. Dichas contaminaciones podrían haberse producido también para el complejo M. tuberculosis, aunque habían pasado desapercibidas hasta ese momento. Por ello, se modificaron los protocolos de procesamiento de las muestras, como se ha indicado anteriormente.
Debido a la homogeneidad fenotípica de M. tuberculosis, para poder diferenciar unas cepas de otras fue necesario realizar un análisis de los patrones de los RFLP de toda la colección de aislamientos de M. tuberculosis. Estos resultados, junto con la revisión detallada del registro de laboratorio, permitió detectar que, en efecto, durante el período comprendido entre junio-agosto de 1992, y coincidiendo con un cambio de personal de laboratorio no experto, se produjeron varios episodios de contaminaciones cruzadas también para el complejo M. tuberculosis.
Los resultados de este estudio nos permiten reconocer las condiciones en las que se debe sospechar la existencia de contaminaciones cruzadas (resultado de cultivo falso positivo): cuando la fluoroscopia de la muestra sea negativa y se hayan procesado en el mismo lote y fecha que otras con fluoroscopia fuertemente positiva (verdaderos cultivo positivos). En estos casos, debe contactarse con el clínico y comprobar la sintomatología tuberculosa del paciente. Si persiste la sospecha de contaminación cruzada, no debe aceptarse el resultado como positivo mientras no se determinen los patrones de RFLP de todas las muestras procesadas en el mismo lote y fecha.
Hay que destacar el hecho de que incluso en pacientes que presentan más de un cultivo positivo se pueden obtener cultivos falsos positivos. Así, por ejemplo, los pacientes 51a, 56a, 148a y 160a tuvieron más de un cultivo positivo, pero se demostró que sus muestras siempre se procesaron al lado de otras con fluoroscopias fuertemente positivas.
El hecho de que las contaminaciones detectadas coincidieran con un cambio de personal en el laboratorio puede sugerir que la contaminación se produjese por una mala manipulación de las muestras por parte de técnicos inexpertos. Sin embargo, durante los años siguientes también se produjeron cambios esporádicos del personal técnico, pero con las nuevas medidas adoptadas durante el procesamiento de las muestras no se volvieron a registrar más casos de contaminaciones. Esto sugiere que, como cabe esperar, el origen de la contaminación estuvo en el proceso de descontaminación de las muestras. Algunas maniobras durante este proceso pueden causar fácilmente la contaminación cruzada entre las muestras: la distribución a cada una de las muestras de las soluciones descontaminante y neutralizante a partir de un recipiente único; la eliminación del sobrenadante tras la centrifugación también a un recipiente común para todas las muestras; el abrir y cerrar los tubos, con lo que pueden contaminar los guantes del operador, etc.
Dos de los pacientes en los que se demostró un resultado falso positivo recibieron tratamiento antituberculoso completo a pesar de estar asintomáticos, no encontrarse imágenes patológicas en sus radiografías y obtenerse pruebas negativas para la tuberculina. Esto sugiere que la existencia de contaminaciones debería ser conocida por el personal médico a la hora de diagnosticar la enfermedad y se debería contrastar siempre la historia del paciente con los resultados del laboratorio. Esto es especialmente importante hoy día, en que se disponen de técnicas con una alta sensibilidad (como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa) que pueden originar con mayor facilidad resultados falsos positivos.
Los laboratorios de micobacteriología deben llevar a cabo un control riguroso de sus procedimientos de descontaminación, prestando especial atención a aquellas muestras con fluoroscopia negativa que se hayan procesado en el mismo lote que otra muestra fluoroscopia fuertemente positiva.
Agradecimiento
El presente trabajo ha sido financiado por el Departamento de Salud del Gobierno de Navarra. Agradecemos especialmente al Instituto de Salud Pública de Navarra por la facilitación de datos epidemiológicos.
