Introducción
La capacidad de los microorganismos para desarrollar resistencia a los antibióticos se detectó muy poco después del desarrollo de los primeros antimicrobianos. En el caso de las penicilinas, apenas se habían iniciado los experimentos en animales cuando ya se detectó la primera cepa productora de penicilinasa, y 3 años después de comenzar el uso clínico ya se describen los primeros fracasos terapéuticos derivados de la aparición de resistencia.
Desde entonces, con un margen mayor o menor de tiempo, se han desarrollado resistencias a las diferentes familias de antimicrobianos que se han ido desarrollando, desde la resistencia a penicilina descrita en 1940 a la resistencia a linezólida descrita en enterococos y, más recientemente, en estafilococos, y la últimamente descrita resistencia de alto nivel a glucopéptidos, mediada por vanA, en Staphylococcus aureus1.
Uno de los factores esenciales para que la aparición de una resistencia no implique un fracaso terapéutico es su adecuada detección.
Sin embargo, buena parte de los nuevos mecanismos de resistencia que se han ido describiendo tienen una característica común, ser distintos de los que se conocían y que podrían denominarse clásicos.
La práctica totalidad de los mecanismos clásicos guardaban una clara correlación con los resultados de las pruebas de sensibilidad estándar (disco placa, dilución en agar o en caldo) para cada antimicrobiano. En muchos casos la descripción exacta del mecanismo íntimo de resistencia podía ser más compleja, por el menor desarrollo de las técnicas moleculares, pero había una clara correspondencia entre la presencia de un mecanismo de resistencia a un antimicrobiano y la aparición de dicho antimicrobiano como resistente en cualquiera de las pruebas características. Como consecuencia, había una excelente correlación entre lo que reflejaban las pruebas de sensibilidad in vitro y el comportamiento in vivo del antimicrobiano.
Por el contrario, buena parte de los mecanismos de resistencia de descripción más reciente, se caracterizan por detectarse dificultosamente mediante las técnicas habituales, de modo que la presencia del mecanismo de resistencia no se deduce con facilidad de los resultados del antibiograma. Ello lleva a que aparezcan como activos los antimicrobianos frente a los cuales, en realidad, el microorganismo alberga mecanismos de resistencia, e implica por tanto un alto riesgo de fracaso terapéutico, a pesar de una posible sensibilidad in vitro mediante los métodos clásicos.
Naturalmente, no todos los mecanismos de resistencia de nueva descripción reciente responden a este esquema. Mecanismos de resistencia a nuevos antimicrobianos, descritos recientemente, como son la mayor parte de las resistencias de alto nivel a glucopéptidos en enterococos y estafilococos o la resistencia a linezolida, siguen el comportamiento habitual en cuanto que se detectan sin dificultad mediante las técnicas habituales de estudio de la sensibilidad.
Sin embargo, varios de los mecanismos de mayor importancia descritos en los últimos años se caracterizan por requerir procedimientos específicos para su diagnóstico o, en alguna ocasiones, por no disponerse de técnicas ampliamente aceptadas.
Este tipo de mecanismos de resistencia incluye los responsables de algunos de los mayores problemas actuales en el campo de los antimicrobianos, como son las betalactamasas de espectro ampliado, la resistencia a penicilina y la tolerancia a vancomicina en neumococos y la resistencia a meticilina y la sensibilidad intermedia a vancomicina en estafilococos.
La resistencia a meticilina en estafilococos deriva, como es bien conocido, de la presencia de una PBP adicional con baja afinidad por los betalactámicos (PBP2a), codificada por el gen mecA que, junto con la alteración de otros genes, condiciona la resistencia. El principal problema deriva de que, en la mayor parte de los casos, se trata de poblaciones heterogéneas, en las que sólo una parte, con frecuencia muy minoritaria, de la población, expresa la proteína responsable. En estas condiciones, un estudio disco-placa estándar, con los discos con la carga habitual de antimicrobianos y en las condiciones habituales de incubación, es probable que no sea capaz de detectar esta resistencia.
A lo largo del tiempo han existido diversas tendencias respecto al método ideal para la identificación de S. aureus resistentes a meticilina. Actualmente, el National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda utilizar placas con 4% de cloruro sódico y 6 mg/l de oxacilina, incubadas a no más de 35 °C durante 24 h2.
Resistencias en gramnegativos
Como es bien conocido, las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) derivan de mutaciones en las betalactamasas plasmídicas clásicas que modifican bien su espectro, ampliándolo a cefalosporinas de tercera generación y monobactamas, bien su susceptibilidad a la inhibición por ácido clavulánico y derivados, haciéndolas resistentes a su acción (Inhibitor Resistant TEM, IRT)3.
Las características de estas betalactamasas hacen que los métodos que permitían detectar y caracterizar a las betalactamasas clásicas no sean válidos para ellas. Las betalactamasas clásicas reflejaban perfectamente su actividad en el antibiograma, con la evidencia de resistencia a una serie de antimicrobianos distintos según el tipo de betalactamasa. Su caracterización, de interés a efectos epidemiológicos y de investigación, aunque con poca trascendencia clínica inmediata, se realizaba adecuadamente mediante isoelectroenfoque.
Esto no ocurre así en el caso de las BLEE. Por una parte, pueden pasar desapercibidas mediante el antibiograma clásico, ya que con frecuencia no producen unas concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) elevadas de las cefalosporinas de tercera generación, situadas claramente en la categoría de resistente, por lo que requieren métodos específicos de detección.
Por otra parte, la enorme profusión de BLEE, extremadamente similares desde el punto de vista bioquímico (se diferencian en la mayor parte de los casos en no más de 3 o 4 aminoácidos, y en bastantes ocasiones en uno solo) hace que existan un gran número de ellas con puntos isoeléctricos muy similares, que no pueden diferenciarse adecuadamente por tanto mediante isoelectroenfoque.
Ello obliga a trabajar con métodos diferentes, con estudios de sensibilidad específicos para su detección y mediante técnicas moleculares que identifiquen de forma precisa su secuencia genética para su caracterización.
Las BLEE derivadas de TEM y SHV son la causa más frecuente de resistencia a aminotiazol-oximino cefalosporinas en nuestro medio. Ello obliga a modificar el modelo de antibiograma que se venía realizando en primera instancia a las enterobacterias más sensibles, y que con frecuencia excluía a cefalosporinas de tercera generación como ceftacidima. La British Society for Antimicrobial Chemotherapy recomienda que se incluyan ceftacidima y cefpodoxima en todos los antibiogramas, al menos, de los gramnegativos más probables como portadores de BLEE (Escherichia coli y Klebsiella spp.), ya que son, entre las cefalosporinas de tercera generación, las que constituyen un mejor sustrato para las BLEE derivadas de TEM y SHV4.
Sin embargo, tanto estos como otros gramnegativos pueden ser resistentes a estas cefalosporinas por otros mecanismos, transmisibles o no.
Se ha descrito en diversos gramnegativos, entre ellos el género Klebsiella, la presencia de cefalosporinasas tipo AmpC de codificación plasmídica, además de la posible presencia de enzimas cromosómicas de este tipo en otras enterobacterias. Estas enzimas hidrolizan eficazmente cefoxitina y aztreonam, de modo que la inclusión de estos antimicrobianos constituye un apoyo útil para la inferencia de la posible enzima implicada.
Además, las BLEE más próximas a las cefalosporinasas cromosómicas como son las de tipo CTX-M, hidrolizan en menor medida ceftacidima y aztreonam, pero hidrolizan eficazmente cefotaxima. Aunque son infrecuentes en Europa occidental, son prevalentes en Sudamérica y se han descrito en Europa oriental, por lo que su presencia se debe considerar5.
En conjunto, el uso de estos antimicrobianos permite establecer unos fenotipos que pueden orientar hacia la sospecha de la presencia de una u otra de estas enzimas. En cualquier caso, la característica que permite corroborar definitivamente la presencia de una BLEE es el sinergismo entre cefalosporinas de tercera generación y el ácido clavulánico.
A estos efectos, es recomendable incluir tanto cefotaxima como ceftacidima, ya que las enzimas tipo CTX-M pueden no mostrar un sinergismo claro entre ceftacidima y ácido clavulánico4.
La determinación de este sinergismo puede realizarse por diversos métodos. Los de doble disco, en los a que a una placa inoculada con la cepa problema le colocan discos de amoxicilina clavulánico (20 g + 10 g), cefotaxima y ceftacidima (30 g) a una distancia de 25-30 mm, tienen la ventaja de su sencillez y bajo precio, y la desventaja de que la distancia ideal puede variar de una cepa a otra.
Se puede recurrir también al uso de tiras de E-test que combinan una cefalosporina aislada en un extremo y la misma cefalosporina más ácido clavulánico en el otro. Si la proporción entre las CIM obtenidas en uno y otro extremo es superior o igual a 8 se admite la presencia de sinergismo. Una variante son los discos que contienen ya el antibiótico y el inhibidor, considerándose positivo cuando este disco origina halos al menos 5 mm mayores que el disco con el antibiótico solo, al menos con un diámetro de más de 5 mm.
Cualquiera de estas pruebas es capaz de detectar a la mayor parte de las BLEE. Desde el punto de vista práctico, la principal consecuencia es que todas las bacterias en las que se deduzca la presencia de una BLEE deben considerarse resistentes a todas las cefalosporinas de amplio espectro, con independencia de los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad habituales.
La detección de BLEE en géneros distintos a E. coli y Klebsiella, mucho menos frecuentes, tiene la dificultad adicional de que, con frecuencia, conviven con otras enzimas e, incluso, con mecanismos de resistencia no enzimáticos. En el caso de caso de enterobacterias, esto implica sobre todo cefalosporinasas cromosómicas inducibles o desreprimidas. En estos casos puede ser muy problemática su detección, mientras en Pseudomonas, habitualmente puede ser orientativo el hecho de que las BLEE suelen dar CIM elevadas de ceftacidima (> 64 mg/l), habitualmente superiores a las originadas por cefalosporinasas y problemas de permeabilidad. Un dato importante es que, en P. aeruginosa, los estudios de sinergismo con ácido clavulánico no tienen utilidad.
En todos los casos, la caracterización definitiva de la enzima requiere la secuenciación del gen codificador de la betalactamasa o de un fragmento representativo.
Resistencias en grampositivos
En el caso de los grampositivos pueden diferenciarse dos tipos de mecanismos entre los que plantean problemas en la actualidad: a) aquellos que se detectan adecuadamente mediante las pruebas sistemáticas de sensibilidad, aunque su caracterización molecular pueda ser más o menos dificultosa, y b) aquellos que requieren estudios de sensibilidad específicos para su detección. Dentro de éstos, probablemente los de mayor importancia son los que se refieren a la detección de resistencia a meticilina y la detección de resistencia intermedia a glucopéptidos en S. aureus.
En el caso de la resistencia a meticilina, la clave del problema está en la expresión heterogénea de la resistencia dentro de una misma población bacteriana, de modo que puede haber grandes diferencias de resistencia entre las células individuales de una población.
Se han producido numerosas propuestas sobre los métodos más recomendables para su detección, basadas en la modificación de diversas condiciones (tiempo de incubación, temperatura, concentración de cloruro sódico).
En la actualidad, de todas las condiciones propuestas, para la mayor parte de los métodos se conserva la adición de cloruro sódico, se considera necesario modificar la temperatura de incubación sólo en algunos métodos y no se considera necesario prolongar el tiempo de incubación respecto a las condiciones estándar. En cambio, la detección de resistencia en estafilococos coagulasa negativos requiere incubación de 48 h en la mayor parte de los métodos2,6.
Se consideran cepas intermedias (borderline) aquellas con CIM o halos en los límites de sensibilidad. Este comportamiento puede deberse a tres mecanismos:
1. Hiperproducción de penicilinasa.
2. Alteraciones en PBP.
3. Cepas resistentes a meticilina con alto nivel de heterogeneidad.
Las primeras se han pretendido diferenciar de S. aureus resistentes a meticilina verdaderos mediante la modificación del halo de meticilina u oxacilina por ácido clavulánico, pero no es un método recomendable, ya que algunos S. aureus resistentes a meticilina verdaderos también incrementan su halo en estas circunstancias.
En estos casos, y en cualquier circunstancia en que se pretenda caracterizar de forma definitiva la resistencia, el método adecuado es la detección del gen mecA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Del mismo modo, han existido controversias relativas a la detección de la resistencia intermedia a glucopéptidos en S. aureus, aunque en la actualidad existe un mayor consenso respecto a la mayor utilidad de los métodos basados en el estudio de poblaciones7.
