Presente de la micología médica
Aumento de la incidencia
En la segunda mitad del siglo xx, la prevalencia de las infecciones fúngicas ha aumentado constantemente, debido al mayor número de pacientes inmunodeprimidos y a la generalización de agresivas prácticas diagnósticas y terapéuticas1. Desde 1970, la incidencia anual de la candidosis y aspergilosis invasora ha aumentado 40 y 6,5 veces respectivamente2,3. Otros estudios publicados en Estados Unidos y Europa señalan que Candida spp. se ha situado entre los microorganismos aislados con más frecuencia en hemocultivos4; y constituyen entre el 5-10% de las sepsis nosocomiales5. La candidemia prolonga en 3 semanas la estancia hospitalaria media de los enfermos y multiplica por dos el riesgo de muerte durante el ingreso3. Asimismo, el 17% de los enfermos ingresados en unidades de cuidados intensivos tienen cultivos positivos para alguna especie de levadura, siendo cada vez más frecuente el aislamiento de especies distintas de C. albicans como C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, etc.6.
La información sobre las infecciones causadas por hongos filamentosos es más escasa. Los hongos miceliales que con más frecuencia causan infecciones pertenecen al género Aspergillus7, aunque en los últimos años se está detectando un notable aumento en la incidencia de infecciones por otros géneros como Fusarium, Scedosporium y Acremonium.
En todo el mundo se realizan algo más de 650.000 trasplantes al año, con un incremento anual del 1,5%. España mantiene un costoso programa de trasplantes, que ha situado a nuestro país entre los estados que realizan un mayor número de injertos al año. Las micosis invasoras son una de las principales complicaciones que pueden aparecer en enfermos trasplantados. Se calcula que el 10-15% de estos pacientes desarrollarán una infección por levaduras. Asimismo, el 15-20% de los trasplantados de médula ósea o de algún órgano sólido, principalmente de pulmón, tendrán una infección invasora por Aspergillus7,8.
En consonancia con lo anterior, en la última década el consumo de antifúngicos ha aumentado el 12% al año y según datos de la Agencia Europea del Medicamento, el coste anual mundial en antifúngicos asciende a 3.600 millones de euros; un tercio del mismo corresponde al gasto europeo. En paralelo, se está detectando un porcentaje creciente de cepas que han desarrollado resistencia secundaria a estos antimicrobianos3. Además, se empieza a sospechar que el uso indiscriminado de algunos antifúngicos como el fluconazol o el itraconazol en tratamientos empíricos y en profilaxis está ocasionando cambios ecológicos, que se traducen en un desplazamiento de las especies sensibles por otras con resistencias intrínsecas a éstos. Cada año se describen nuevas especies patógenas y cada vez son más frecuentes las infecciones invasoras por hongos que muestran resistencia in vitro a los antifúngicos y que hasta hace poco tiempo se consideraban no patógenos o que sólo originaban infecciones superficiales (Dipodascus, Rhodotorula, Trichosporon, Scopulariopsis, Cladophialophora, etc.)8,9.
La mortalidad asociada a las infecciones fúngicas es muy elevada. Así, la mortalidad atribuible a la candidemia es del 35-40%, y a la aspergilosis invasora del 85%1,8.
La problemática del diagnóstico
La principal característica de la mayoría de las infecciones fúngicas invasoras es que están causadas por microorganismos oportunistas. Además, muchos de ellos pueden colonizar a los pacientes sin causar enfermedad. Éstos y otros factores mantienen la incertidumbre y la controversia sobre cuáles son los métodos más adecuados para diagnosticar estas infecciones. Una dificultad añadida es la disparidad de criterios en la definición de la infección fúngica invasora y, así, durante los últimos años se está realizando un esfuerzo considerable para alcanzar un consenso. En el año 2002, miembros del Invasive Fungal Infections Cooperative Group de la European Organization for Research and Treatment of Cancer (IFICG/EORTC) y del Infectious Diseases Mycoses Study Group del National Institute of Allergy and Infectious Diseases alcanzaron un acuerdo sobre las definiciones de la infección fúngica invasora que ha supuesto un avance considerable en este campo10, ya que sin la estandarización de las definiciones no puede conseguirse una adecuada interpretación y una comparación fiable de las diferentes aproximaciones diagnósticas y terapéuticas. Por otro lado, un factor muy importante en el diagnóstico de la infección fúngica invasora es la prevalencia o la incidencia de la infección en el grupo de pacientes estudiado. Así, el valor predictivo positivo de una técnica diagnóstica como la detección del antígeno galactomanano mediante Platelia aspergillus® (Biorad, Madrid, España) es del 10% cuando la incidencia de aspergilosis invasora es del 0,5%. Por el contrario, cuando la incidencia es del 20%, el valor predictivo positivo asciende al 84%11. En resumen, la identificación de los factores de riesgo y su estratificación es esencial para un empleo adecuado de las técnicas diagnósticas.
En general, los métodos convencionales de laboratorio son similares a los empleados en bacteriología y se basan en el examen directo de las muestras mediante microscopia óptica y su cultivo. Los medios de cultivo utilizados son los habituales, pero deben utilizarse medios específicos para hongos y medios selectivos cuando la infección sea polimicrobiana o la muestra pueda contener flora bacteriana comensal. Un tema esencial y que debe ser asumido por todos los laboratorios de microbiología es la identificación de las levaduras y hongos filamentosos al nivel de especie. Las razones van más allá del mero hecho académico. Así, es conocida la diferente susceptibilidad a los antifúngicos de las distintas especies de Candida y, sin duda, es previsible que algo parecido ocurra entre las diferentes especies de hongos filamentosos. Así por ejemplo, existen datos sobre la susceptibilidad disminuida de Aspergillus terreus a anfotericina B, cuando se compara con la de A. fumigatus12-16. Scedosporium apiospermum es sensible a varios antifúngicos mientras que la infección por S. prolificans es prácticamente intratable17-19. La identificación al nivel de especie de la mayoría de las levaduras que se aíslan de la práctica clínica está al alcance de la mayoría de los laboratorios asistenciales. En el caso de los hongos filamentosos la identificación puede ser más complicada y en bastantes casos puede requerir el concurso de un centro de referencia. Otro aspecto importante es la utilización de medios de cultivo diferenciales que permiten la identificación de muestras que contienen levaduras de diferentes especies. Normalmente se emplean medios diferenciales cromogénicos que permiten distinguir especies de levaduras por el color de la colonia. Estos medios son de gran utilidad para distinguir las infecciones mixtas por dos o más especies de levaduras, micosis que según algunos datos son más habituales de lo que se cree.
En relación con las técnicas indirectas que están disponibles comercialmente hay que indicar que la situación es bastante confusa, aunque en algunos aspectos puntuales se ha avanzado alcanzándose conclusiones relevantes. El diagnóstico de la criptococosis invasora mediante la detección de antígeno capsular es una técnica suficientemente conocida con una sensibilidad y especificidad excelente. Con respecto al diagnóstico de la candidosis invasora mediante detección de antígenos y/o anticuerpos hay que señalar que se deben realizar más estudios en los que se estratifique por factores de riesgo, tipo de enfermo y cuadro clínico.
En relación con la aspergilosis invasora, la detección de galactomanano (Platelia Aspergillus®, Biorad, España) tiene su máxima utilidad en pacientes oncohematológicos, considerados de alto riesgo de sufrir la infección20-22. Además existen datos de que esta prueba es útil para el seguimiento de la respuesta23. Para otros grupos de pacientes, esta técnica puede ser de utilidad, pero por el momento no existen estudios fiables que lo demuestren.
Existe otra técnica comercial, denominada Fungitec G test o Glucatell (Seikagaku Kogyo Corporation y Wako WB003 test, Wako Pure Chemical Industries) que no ha sido evaluada mediante estudios multicéntricos estratificados, y aunque parece prometedora, no se puede recomendar hasta conocer más estudios de evaluación24,25.
En cuanto a las técnicas diagnósticas basadas en la detección de ácidos nucleicos, se han aplicado varios métodos en los últimos años para mejorar el diagnóstico de las micosis. Ninguna de ellas ha logrado superar la fiabilidad de los métodos tradicionales y apenas tienen aplicabilidad asistencial. Se han evaluado técnicas "caseras" para detectar ácidos nucleicos de levaduras y hongos miceliales. Habitualmente, se han amplificado las regiones ITS (Internal Transcriber Spacer), del ADNr llegándose a detectar cantidades muy pequeñas de ADN (10 pg). Sin embargo, la limitación de estas técnicas no es la sensibilidad sino la especificidad, que se sitúa alrededor del 70%26-36.
La situación de las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos y estudios de correlación
En los últimos años se han estandarizado varias técnicas para la detección de la resistencia in vitro, que tienen cierta correlación con la evolución clínica de los enfermos. Por otra parte, prácticas terapéuticas como el uso de la profilaxis antifúngica y de los tratamientos empíricos han generado cambios epidemiológicos, entre los que destacan la aparición de hongos que han desarrollado resistencia secundaria a los antifúngicos y la sustitución de algunas especies sensibles por otras con resistencia intrínseca. Por eso parece cada vez más importante conocer el perfil de sensibilidad de las cepas clínicas y el espectro de acción de los antifúngicos. Además, desde la aparición de nuevas moléculas antifúngicas y de nuevas estrategias terapéuticas, la detección de la resistencia podría ser vital a la hora de elegir una alternativa terapéutica u otra37-39.
Existen varios métodos estandarizados para detectar resistencias in vitro en levaduras. El más conocido y difundido es el recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, documento M27HA2). Este método incluye técnicas de macrodilución y microdilución para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM), entre cuyas principales características se incluyen un procedimiento espectrofotométrico para la preparación del inóculo, el medio RPMI a pH 7,0 como medio de cultivo, la lectura visual de los tubos o de las placas, el cálculo de la CIM por porcentajes o gradación de la inhibición y recomendaciones para controlar la calidad de los resultados40.
El documento M27HA2 se ha convertido en el método de referencia para los estudios de sensibilidad en levaduras y, así, otras técnicas normalizadas desarrolladas en los últimos años se han basado en este estándar, por lo que algunos autores las denominan como NCCLS-like38. Este es el caso del método propuesto por el European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST) de la Sociedad Europea de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas41. El estándar del EUCAST propone algunas modificaciones para determinar la CIM de las levaduras, acortando el período de incubación necesario para obtener la CIM (de 48 a 24 h) y prescindiendo de la subjetividad de la lectura visual para calcular los porcentajes de inhibición. Las CIM obtenidas mediante el método del EUCAST muestran una elevada correlación con las obtenidas por el NCCLS (> 85%), por lo que este método puede constituir una alternativa semiautomatizada para realizar estudios de sensibilidad42.
En lo que se refiere a los hongos miceliales, el NCCLS también ha aprobado recientemente un método para realizar estudios de sensibilidad en hongos productores de conidias (documento M38-A)43. En términos generales debe indicarse que los estudios de sensibilidad en hongos miceliales se encuentran más retrasados que los de las levaduras. Además, este estándar se ha desarrollado para unas pocas especies de hongos y algunos expertos cuestionan si el medio de cultivo es el idóneo, así como el procedimiento de preparación del inóculo.
Los métodos para realizar estudios de sensibilidad a los antifúngicos en levaduras y hongos muestran una serie de limitaciones técnicas entre las que destacan las siguientes:
1. Dificultades para detectar la resistencia a la anfotericina B.
2. Crecimiento residual descrito con fármaco fungistáticos como los azoles y la fluorocitosina.
3. Problemas de crecimiento en determinadas especies como C. neoformans y otras levaduras38-44.
A pesar de todos estos problemas se han desarrollado una buena cantidad de técnicas comerciales que intentan simplificar los métodos de detección de resistencias. De todas ellas, sólo una minoría ha demostrado una buena concordancia con los resultados de los métodos de referencia. Entre éstas destacan dos técnicas comerciales basadas en la microdilución marcada con contrastes colorimétricos, el Sensititre Yeast One (Trek Diagnostic Systems) y el ASTY (ASTY Inc). Estos dos métodos muestran una buena concordancia con los resultados obtenidos mediante los estándares del NCCLS y pueden constituir una alternativa para los laboratorios asistenciales38,39,45. Otra técnica comercial que muestra una buena correlación con los estándares es el Etest (AB biodisk), un método basado en la difusión que ha sido ampliamente evaluado tanto para levaduras como para hongos miceliales. La mayoría de los trabajos publicados ha demostrado una correlación aceptable con los procedimientos NCCLS o NCCLS-like, aunque se ha observado una concordancia cercana al 50%, en algunas especies de Candida, en C. neoformans y en levaduras poco frecuentes en la práctica clínica46-52. Algunos expertos creen que tanto los métodos colorimétricos como los de difusión en agar no deben emplearse en laboratorios asistenciales, hasta que se superen los problemas que tienen las técnicas de referencia. No obstante, es indiscutible que estas técnicas son capaces de detectar la resistencia in vitro a los azoles, lo que les puede otorgar un papel a la hora de realizar recomendaciones terapéuticas. No obstante, no debe olvidarse que las técnicas de sensibilidad a los antifúngicos muestran una discreta correlación in vitro-in vivo, correlación que es aun más baja en el caso de las micosis invasoras38-44.
Por último, queda por revisar cuándo se deben realizar estos estudios. En primer lugar, hay que indicar que no existen recomendaciones estrictas y que las mismas están basadas en opiniones de expertos, conferencias de consenso y en algunos casos existen estudios controlados con un tamaño de muestra pequeño.
Existen algunas situaciones en las que las pruebas de sensibilidad han demostrado tener utilidad. Entre éstas cabe destacar los casos en los que se ha producido un fracaso terapéutico, en los que los enfermos que han recibido profilaxis antifúngica previa y en los casos en las que las cepas pertenezcan a especies poco frecuentes, de las que se desconoce su espectro de sensibilidad in vitro. En estas situaciones el estudio de sensibilidad puede ayudar a elegir el tratamiento más adecuado o, incluso, a variar la estrategia terapéutica específica, aumentando la dosis del antifúngico, cambiando de fármaco o instaurando una terapia combinada7,38,39,53,54.
Por otra parte, los estudios epidemiológicos son fundamentales. Varios trabajos han demostrado que la vigilancia epidemiológica de las infecciones fúngicas hospitalarias y ambulatorias puede ayudar a conocer los posibles reservorios, las vías de transmisión y los factores de riesgo de la infección, así como el perfil de sensibilidad de las distintas especies y su incidencia. De esta forma pueden establecerse cuáles son los tratamientos iniciales más adecuados o si debe cambiarse de tratamiento una vez que se ha identificado la especie (sensibilidad predecible). Así, por ejemplo, estudios epidemiológicos españoles han demostrado que el 95% de las cepas causantes de candidemia son sensibles in vitro al fluconazol, por lo que este fármaco es una buena opción para el tratamiento inicial de las candidemias55.
Por último, pueden realizarse algunas recomendaciones técnicas sobre los estudios de sensibilidad. Como recomendación general debe indicarse que los estudios de sensibilidad tienen que realizarse con un método estandarizado (NCCLS, NCCLS-like o EUCAST). Estos métodos han mostrado una reproducibilidad interlaboratorio elevada y han sido evaluados en estudios de correlación. Debe resaltarse que estas técnicas deberían realizarse en instituciones sanitarias que las hicieran de manera sistemática, siguiendo un sistema estricto de control de calidad de los resultados. Por otro lado, los métodos comerciales pueden ser una alternativa para algunos laboratorios asistenciales, ya que detectan la resistencia a los azoles con bastante fiabilidad. No obstante, no deben emplearse métodos comerciales para los que no existan estudios de correlación con los métodos de referencia o no se haya analizado su reproducibilidad.
La problemática del tratamiento
Como ya se ha comentado con anterioridad, la mortalidad asociada a las infecciones fúngicas es muy elevada. Así, la mortalidad atribuible a la candidemia es del 35-40%, y a la aspergilosis invasora del 85%1,8. Por desgracia, el tratamiento específico de estas infecciones apenas logra reducir las cifras de mortalidad. Este fracaso terapéutico se debe a un conjunto de factores entre los que destacan las escasas alternativas farmacológicas, la ausencia de técnicas diagnósticas capaces de detectar la infección antes de que haya diseminado, la extrema debilidad de muchos de los enfermos que desarrollan micosis invasoras y la falta de pruebas que puedan predecir con fiabilidad el fracaso terapéutico.
No obstante, debe indicarse que en los últimos años se han producido algunos avances terapéuticos que pueden modificar en breve el pronóstico de algunas de estas infecciones. Entre estos avances destacan la aparición de nuevas moléculas antifúngicas como los nuevos triazoles (voriconazol y posaconazol) y las equinocandinas (caspofungina, micafungina y anidulafungina). Asimismo, se han desarrollado nuevas formulaciones de los antifúngicos clásicos como las presentaciones lipídicas de anfotericina B y la formulación parenteral de itraconazol, que parecen aumentar la eficacia y el índice terapéutico de la presentaciones tradicionales. Por último, quizás en los próximos años nuevas estrategias como la terapia combinada y la inmunoterapia sean de gran utilidad en el tratamiento de algunas micosis.
Futuro de la micología médica
Hace 25 años el desarrollo de la biología molecular parecía que iba a revolucionar las enfermedades infecciosas. Aunque el avance ha sido lento gen tras gen, se han ido dilucidando muchos secretos de los microorganismos. Tras el comienzo de la secuenciación de genomas completos comenzó una nueva revolución. Actualmente se han o se están secuenciando un buen número de microorganismos, de los cuales la mayoría son bacterias patógenas. Entre los hongos se han abordado los siguientes: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, A. nidulans, A. niger, Coccidioides immitis, Neurospora crassa, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Schizosaccharomyces pombe y Trichoderma reesei.
En los próximos años, el conocimiento de la secuencia del genoma de estos hongos aumentará la comprensión de su biología y sus factores de virulencia, y permitirá alcanzar los objetivos que persigue la secuenciación del genoma de un patógeno. Estos objetivos son: a) el desarrollo de vacunas; b) el desarrollo de antimicrobianos, y c) el desarrollo de pruebas diagnósticas. Sin ir más lejos, en el asunto del diagnóstico, las técnicas moleculares cuantitativas pueden ser de una gran utilidad. Una de estas técnicas es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, que ha mostrado eficacia para el diagnóstico y la detección de resistencias en bacteria y virus, por lo que probablemente pueda constituir una técnica de referencia para el diagnóstico de las micosis en un futuro no muy lejano56. Por otro lado, y tomando en consideración el huésped, se está analizando si los factores de virulencia expresados por un patógeno producen una o varias respuestas en el paciente. Así, hoy se sospecha que la cascada de fenómenos que se produce al ponerse en marcha la respuesta inflamatoria y la inmunidad adquirida, incluyendo la secreción de mediadores y la subsiguiente interacción célula-célula, puede dejar una huella específica que afecta los procesos de señales de trascripción genética de las células que participan en esta respuesta. Así, la exposición a un patógeno puede producir una respuesta específica en la expresión de diferentes genes en los leucocitos polimorfonucleares, respuesta persistente y firme, que podría permitir diseñar técnicas de detección para diagnosticar de forma individualizada un proceso infeccioso.
Entre los principios básicos de estos avances, la genómica funcional, comparativa y estructural desempeñan un papel decisivo. Así, mediante la tecnología de microarrays se pueden utilizar miles de sondas de ADN individuales, inmovilizadas y perfectamente localizadas en un soporte sólido como una malla de nailon o un porta de cristal. Con ellas, una muestra clínica podrá analizarse para detectar la existencia de un grupo de microorganismos, en este caso hongos, identificarlos al nivel de especie, comparar la variabilidad de algunos genes entre cepas de la misma especie, examinar los mecanismos de resistencia, caracterizarlos a nivel subespecífico, etc.
También se emplearán para monitorizar los cambios en la expresión de genes en diferentes condiciones como las derivadas de la interacción con otras células y moléculas (inmunología y antifúngicos). Asimismo, permitirán medir la expresión de cientos de genes en paralelo. Por ejemplo, la utilización de sondas de ARNm marcadas mediante fluorescencia permitirá ver que genes se expresan en diferentes condiciones. Por otro lado, la información proveniente de la inmunogenética humana permitirá conocer la susceptibilidad individual a diversas infecciones y la farmacogenómica informará de cuál es el antibiótico más adecuado para un paciente en particular.
En conclusión, en los próximos años se asistirá a un buen número de avances en la micología médica que, como es habitual, será menos notable que el observado en el campo de la virología o de la bacteriología. Sin embargo, no puede olvidarse que la mayoría de estas infecciones son oportunistas y que, aunque la incidencia de éstas haya aumentado de forma considerable en los últimos años, no hay ningún centro que por sí solo pueda desarrollar estudios que alcancen conclusiones relevantes. En el momento actual las dos áreas más preocupantes de la micología médica son el diagnóstico y el tratamiento. Con respecto al tratamiento la problemática es grande, pero las empresas farmacéuticas están haciendo un esfuerzo considerable por lo que, en breve, tendremos un buen número de antifúngicos para utilizar en monoterapia o combinados, lo que augura una disminución en la elevada mortalidad que causan estas infecciones. Un tema sin resolver, aunque se están intentando aportar soluciones, es la dificultad para realizar ensayos clínicos aleatorios y a doble ciego que permitan conocer la eficacia real de estas nuevas moléculas y estrategias terapéuticas57. El otro problema preocupante es el diagnóstico de la infección fúngica invasora. Varias instituciones sanitarias y compañías de diagnóstico han desarrollado estudios limitados en cuanto a tamaño muestral y representatividad, por lo que, en general, se han alcanzado conclusiones poco valorables. Por tanto, la situación es de confusión y los avances alcanzados son limitados y sólo aplicables en ciertas poblaciones de riesgo. Por otro lado, no debe olvidarse que esta situación puede mejorar con la introducción de nuevas técnicas diagnósticas basadas en la detección de anticuerpos, antígenos y en la PCR, pero es indudable que también puede aumentar la confusión.
Para finalizar debe destacarse que es necesario que las instituciones sanitarias colaboren en los estudios epidemiológicos y de vigilancia de desarrollo de resistencia a los antifúngicos. Por tanto, la cooperación entre el Sistema Nacional de Salud (SNS) es imprescindible y es la única forma de que, entre todos, se alcancen los resultados pertinentes que permitan lograr una mayor supervivencia y mejorar la calidad de vida de aquellos pacientes que tengan la mala fortuna de adquirir una infección fúngica invasora. En este sentido, la convocatoria para financiar redes temáticas de investigación cooperativa realizada por la Subdirección General de Investigación Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III ha sido bien recibida y apoyada por el colectivo de profesionales que se dedica a la micología médica ya que, en nuestro ámbito, este programa de investigación puede ser una herramienta esencial para eliminar muchas de las insuficiencias que se han destacado en este artículo.
