Fundamentos: La esclerosis múltiple parece ser el fruto de la conjunción de una predisposición genética y un factor ambiental desconocido, que originarían una alteración de tipo autoinmune, que sería la causante de la inflamación y desmielinización propias de la enfermedad. Con el objetivo de determinar este posible factor ambiental hemos estudiado la presencia de virus de la familia Herpesviridae en enfermos de esclerosis múltiple.
Métodos: Se estudiaron 204 muestras de sangre: 102 de enfermos de esclerosis múltiple recurrente-remitente, (43 estaban bajo tratamiento con interferón ß), y 102 de donantes de sangre, con las mismas características de edad y sexo que los pacientes de esclerosis múltiple. De estas muestras extrajimos el ADN total, y lo analizamos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el fin de detectar la presencia de virus del herpes simple, virus de la varicela zoster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, herpesvirus humano 6, herpesvirus humano 7 y herpesvirus humano 8.
Resultados: a) Tan solo encontramos diferencias estadísticamente significativas (p = 0,0001) para herpesvirus humano 6: un 21,5% de muestras positivas en donantes (22/102), frente a un 49,02% de positividad en enfermos de esclerosis múltiple (50/102); b) no encontramos diferencias estadísticamente significativas para ninguno de los virus estudiados entre los pacientes que recibieron interferón ß y los que no lo recibieron.
Conclusiones: Estos resultados nos hacen pensar que el herpesvirus humano 6, en enfermos de esclerosis múltiple, puede establecer una infección sistémica, si bien desconocemos cómo actúa en esta enfermedad. El tratamiento con interferón ß no afecta a las prevalencias de ADN de ninguno de los virus estudiados.
Background: The multiple sclerosis seems to be the junction between genetics alteration and an unknown environmental factor, that they would originate an autoimmune alteration, that they would be the reason of the inflammation and demyelinization responsible of the disease. Our objective has been the determination of this possible environmental factor and to reach it, we have studied the appearance of Herpesviridae family viruses.
Materials and methods: 204 blood samples were studied: 102 from relapsing-remitting multiple sclerosis patients (43 was undergoing beta-interferon treatment), and 102 from blood donors with the same age and sex than multiple sclerosis patients. From this samples, we extracted the DNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and we analized by polymerase chain reaction (PCR) to detect the appearance of herpes simplex virus, varicella zoster virus, Epstein-Barr virus, citomegalovirus, human herpesvirus 6 (HHV-6), human herpesvirus 7 and human herpesvirus 8.
Results: a) we only found significative difference (p = 0.0001) in HHV-6: 21.5% donors positive samples (22/102), opposite to 49.02% of positivity in mulytiple sclerosis patients (50/102); b) we didn't found significative differences in none of other viruses studied, between patients treated with beta-interferon and non-treated ones.
Conclusions: Our results suggest us that HHV-6 can play an important role in the multiple sclerosis development. The beta-interferon treatment doesn't affect to DNA prevalence of none of studied viruses.
Introducción
La esclerosis múltiple es una enfermedad que se caracteriza por su anatomía patológica, consistente en la aparición de lesiones focales en la sustancia blanca denominadas placas, en las que lo más llamativo es la desmielinización. Pero a pesar de ser una entidad clínica bien descrita desde hace más de un siglo, todavía se desconoce la etiología de la enfermedad. La hipótesis patogénica más aceptada en la actualidad dice que la esclerosis múltiple es fruto de la conjunción de una determinada predisposición genética y un factor ambiental desconocido que, al aparecer, juntos en un mismo sujeto originarían una alteración en la respuesta inmunológica, de tipo autoinmune, que a su vez sería la causante de la inflamación y desmielinización propias de la enfermedad1.
Los distintos estudios epidemiológicos realizados hasta el momento han reconocido la existencia de un factor genético de susceptibilidad a la enfermedad y han permitido saber que, para que aparezca, parece ser necesaria la existencia de un factor ambiental, el cual parece intervenir en la infancia, antes de los 15 años, probablemente en forma de una infección inaparente o de carácter banal1.
Como posibles agentes ambientales se han implicado principalmente distintos virus como: virus del sarampión, HTLV-I y LM7 (retrovirus)2,3 y, sobre todo, algunos virus de la familia Herpesviridae: virus de la varicela-zoster, virus del herpes simple, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus y herpesvirus humano tipo 64-12, debido a que todos son capaces de establecer latencia y reactivarse periódicamente y porque algunos, como el herpesvirus humano 6, poseen neurotropismo y tienen la capacidad de inducir la desmielinización13. Pero todavía no se ha confirmado ninguna asociación.
Con el fin de determinar si los virus del herpes simple, de la varicela zoster, de Epstein-Barr, citomegalovirus y herpesvirus humano 6, así como herpesvirus humano 7 y herpesvirus humano 8 pueden estar implicados en la esclerosis múltiple, hemos analizado su presencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Materiales y método
Materiales
Pacientes
En el período comprendido entre los meses de abril de 1998 y junio de 1999 se recogieron un total de 204 muestras de sangre pertenecientes a otros tantos pacientes, de los que 102, 70 mujeres (68,63%) y 32 varones (31,37%), eran enfermos diagnosticados clínicamente de esclerosis múltiple recurrente-remitente (Posser et al), procedentes de la unidad de día del Servicio de Neurología del Hospital Universitario San Carlos de Madrid. Estos pacientes constituyeron el grupo patológico.
Dentro de este grupo patológico, 62 pacientes estaban siendo tratados con interferón- ß (18 varones y 44 mujeres). La edad media de los varones era de 36,34 años (rango, 22-63) y la de las mujeres de 34,75 años (rango, 21-57).
Las otras 102 muestras pertenecían a otros tantos donantes de sangre del servicio de hemoterapia del Hospital Universitario San Carlos de Madrid, que fueron utilizados como grupo control, con idénticas características de edad y sexo, con el fin de poder realizar un estudio comparativo de los resultados obtenidos.
Muestras
El tipo de muestra empleado fue sangre periférica14. En todos los casos se recogieron 6 cm3 en un tubo estéril que contenía EDTA como anticoagulante.
Métodos
Extracción del ADN de los linfocitos de sangre periférica
En el protocolo del laboratorio, seguido para la extracción del ADN de linfocitos a partir de sangre total se diluyeron en primer lugar los 6 cm3 de sangre periférica total en un tubo Falcon con STMT (sacarosa 0,32 mol/l, Tris-HCl pH 7,5 1 mmol/l, MgCl2 5 mmol/l, Triton X-100 al 1% y agua). A continuación se resuspendieron bien, se dejaron 5 min en la nevera a 4 °C, se centrifugaron a 3.500 rpm durante 20 min y se eliminó cuidadosamente el sobrenadante. Una vez retirado el sobrenadante se realizó un nuevo lavado con STMT. Se eliminó el sobrenadante con cuidado y se añadió al sedimento 4,5 ml de la solución B (NaCl 0,075, EDTA 0,024 mol/l a pH 8 y agua) y 0,5 ml de la solución C (proteinasa K 20 mg/ml y SDS al 10%). Se agitó bien en un vórtex, de forma que el sedimento quedara resuspendido, y dejamos la muestra toda la noche en un baño con agitación constante a 37 °C.
Al día siguiente se sacaron los tubos del baño y se añadió 1,7 ml de NaCl 6 mol/l, mezclándolo en vórtex durante 15 y centrifugando a 3.500 rpm durante 20 min. A continuación se recogía con mucho cuidado el sobrenadante y se pasaba un tubo estéril, donde precipitaba el ADN añadiendo un volumen de isopropanol y mezclando por inversión hasta la formación de una medusa compacta. Pescamos el ADN genómico, lo disolvimos en 400 µ l de TE (10 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA) estéril, lo dejamos en un baño con agitación a 37 °C durante 1 h y lo dejamos enfriar en la nevera a 4 °C durante 2 días.
Por último, se hicieron alícuotas que se guardaron en el congelador a 40 °C.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Para cada uno de los virus estudiados (virus del herpes simple, de la varicela zoster, de Epstein-Barr, citomegalovirus, herpesvirus humanos 6, 7 y 8) se realizó la PCR por separado, en presencia de iniciadores de ß -globina15, cuya amplificación se utilizó como control interno de reacción. En primer lugar se hizo una primera amplificación (PCR convencional), seguida de una segunda amplificación (nested PCR) de los fragmentos amplificados anteriormente.
Los reactivos y las concentraciones óptimas utilizadas en la reacción se determinaron, previamente, con genoma purificado de cada uno de los virus estudiados y fueron las siguientes: a) para la PCR convencional: una mezcla de reacción de 100 µ l que contenía 8 µ l de la muestra, Tris-HCl 10 mmol/l (pH 8,3), KCl 50 mmol/l, MgCl 1,5-2,5 mmol/l, dATP, dGTP, dCTP y dTTP (600 µ mol/l cada uno), 1-2,5 µ mol/l de cada iniciador16-21, 2 U de Taq ADN polimerasa, y agua hasta completar el volumen final, y b) para la nested PCR: en un volumen de reacción de 100 µ l se añadieron 5 µ l del producto amplificado anteriormente, Tris-HCl 10 mmol/l (pH 8,3), KCl 50 mmol/l, MgCl 1,5-2,5 mmol/l, dATP, dGTP, dCTP y dTTP (400 µ mol/l cada uno), 1-2,5 µ mol/l de cada iniciador16-21, 2 U de Taq ADN polimerasa, y agua hasta completar el volumen final. La preparación se cubrió con 150 µ l de aceite mineral para evitar condensaciones que pudieran alterar las condiciones de reacción.
Los controles utilizados fueron:
Control negativo: la ausencia de contaminación se comprobó incluyendo un tubo que contenía todos los componentes de la mezcla de reacción y 8 µ l de agua bidestilada estéril en lugar de muestra.
Control positivo interno: junto a los iniciadores destinados para amplificar cada uno de los genomas virales se añadieron a la mezcla de reacción los iniciadores PC04/ GH20 o KM29/RS42, según el tamaño del fragmento amplificado en cada caso, que nos permitieron amplificar un fragmento de 268 y 536 pb, respectivamente, del gen de la ß -globina humana. Este control permitió verificar la ausencia de inhibidores de la reacción de amplificación, así como la presencia de suficiente ADN.
Control positivo externo: genoma purificado de cada uno de los virus herpes estudiados.
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador (Perkin-Elmer/Cetus). En todos los casos, tanto para la PCR convencional como para la nested PCR, en primer lugar se realizó una fase de desnaturalización consistente en un ciclo de 10 minutos de duración a 94 °C, seguido por 30 ciclos de amplificación.
Electroforesis
Con los productos amplificados anteriormente se realizó electroforesis en gel de agarosa al 4% (BioRad) en TAE (Tris-acetato-EDTA) que contenía 0,15 µ g de bromuro de etidio por ml. Además de las muestras, en cada gel hicimos correr un patrón de peso molecular (50-2.000 pb, Bio-Rad). Tras la electroforesis, los geles se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta y se fotografiaron.
Hibridación
La detección de los productos amplificados visualizados en la electroforesis en gel de agarosa se realizó utilizando la técnica de ADN-enzimoinmunoanálisis (DEIA). Se trata de una modificación del método clásico de enzimoinmunoanálisis para adaptarlo a la detección de ADN. Esta técnica se basa en la hibridación del ADN amplificado con una sonda de ADN marcada con biotina y fijada a las paredes de los pocillos de una placa multipocillo mediante uniones estreptavidina-biotina22.
La reacción se llevó a cabo utilizando placas de 96 pocillos (Sorin Biomedica Diagnostics), cuyas paredes estaban recubiertas con estreptavidina, siguiéndose el protocolo de la casa comercial.
Los resultados se obtuvieron mediante lectura de la absorbancia en fotómetro: cada pocillo se leyó a 450 y 630 nm; el valor definitivo se obtuvo tras restar el valor de absorbancia a 630 nm al obtenido a 450 nm.
Análisis estadístico
Las variables estadísticas se han presentado con su distribución de frecuencias. La asociación entre variables cualitativas se estudió mediante el test de la * 2 o test exacto de Fisher.
Las variables cuantitativas se resumen en su media y desviación estándar. La relación entre este tipo de variables se estudió mediante el test de la t de Student (en el caso de comparaciones entre 2 grupos) y mediante ANOVA (cuando se trató de comparaciones de más de 2 grupos). Se realizó un estudio previo de normalidad y homogeneidad de varianzas.
La validez de criterio de las pruebas estudiadas se concretó mediante la sensibilidad, especificidad, y concordancia global u observada. Se estimó el índice kappa de concordancia entre pruebas. El riesgo se cuantificó mediante la odds ratio (OR) junto con su intervalo de confianza del 95%.
En todos los test estadísticos se rechazó la hipótesis nula cuando * (error de tipo I) fue menor de 0,005.
Resultados
Determinación de la sensibilidad de la PCR
Utilizando las condiciones anteriormente descritas para la determinación de cada uno de los virus herpes incluidos en este estudio, se realizaron una serie de reacciones en las que la muestra problema utilizada fueron cantidades conocidas de genoma de cada uno de los virus herpes. El fin de este estudio fue determinar cuáles eran los límites de resolución de las técnicas que íbamos a utilizar.
Para ello, fuimos utilizando concentraciones decrecientes de cada uno de los genomas virales. Finalmente, los resultados fueron repetidos 3 veces, tanto para verificar los resultados obtenidos como para poner a punto la técnica que luego íbamos a utilizar con las muestras pro-blema.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
900 copias para la primera amplificación o PCR convencional.
10 copias para la segunda amplificación o nested PCR.
Éstas fueron las copias que correspondían a la última de las bandas que se visualizaba con claridad en cada una de las técnicas estudiadas.
Resultados de la PCR convencional
Para ninguna de las muestras estudiadas, ni de donantes ni pertenecientes a pacientes diagnosticados clínicamente de esclerosis múltiple, se consiguió obtener un resultado positivo. Sin embargo, para cada una de las reacciones realizadas, sin excepción, se amplificó el gen de la ß -globina, es decir, el control interno y el control externo constituido por genoma purificado de cada uno de los virus, lo que nos hizo pensar que los resultados obtenidos no podían ser, en ningún momento, atribuidos a una posible inhibición de la reacción.
Resultados de la nested PCR
Estudio comparativo de la prevalencia global de ADN de los virus herpes. Influencia del sexo en la misma
Los resultados se exponen en la tabla 1.
El estudio estadístico realizado nos indicó que tan sólo para el herpesvirus humano 6 existía una diferencia estadísticamente significativa entre los resultados obtenidos en el grupo control y el grupo patológico (p < 0,0001): este virus era 2,26 veces más frecuente en los enfermos de esclerosis múltiple que en el grupo control. Para el resto de virus herpes estudiados, la diferencia no fue estadísticamente significativa, ya que obtuvimos una p < 0,05.
En cuanto a la distribución de las prevalencias de ADN, de los virus herpes estudiados, por sexos, en ninguno de los casos encontramos una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05), ni en el grupo patológico ni en el grupo control.
Estudio de la influencia del tratamiento con interferón ß en las prevalencias de ADN
Los resultados se exponen en la tabla 2. No hemos detectado diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos de población comparados para ninguno de los virus herpes estudiados (p < 0,05), si bien se observa que las prevalencias de ADN en la población que no fue tratada con interferón ß son ligeramente superiores para todos los virus estudiados, salvo para el virus de Epstein-Barr.
Resultados de la hibridación
La hibridación de las muestras positivas con las sondas biotiniladas confirmaron los resultados obtenidos con la nested PCR: todas las muestras que resultaron ser positivas por esta técnica lo fueron también por la hibridación.
Los dos controles negativos que se dispusieron por placa dieron resultado negativo, lo que nos garantizó la fiabilidad de la técnica y la no contaminación de los reactivos utilizados.
El control positivo lo fue claramente, así como los resultados de los pocillos en los que se añadieron las muestras clínicas.
Discusión
La esclerosis múltiple es una enfermedad de la que, en la actualidad, todavía no se conocen con exactitud muchas cosas: cuál es el factor genético que confiere la predisposición, el posible factor ambiental implicado en la activación del proceso autoinmune que da lugar a la inflamación y desmielinización de esta enfermedad y cuáles son los mecanismos implicados en esta respuesta autoinmune1.
En nuestro estudio nos propusimos intentar conocer algo más acerca del posible factor ambiental que actuaría como cofactor en el desarrollo de la enfermedad, por lo que decidimos estudiar un grupo de virus que, por sus características, ha sido implicado en la bibliografía en muchas ocasiones en esta enfermedad: los virus de la familia Herpesviridae4-12.
Por otro lado, decidimos centrarnos en la esclerosis múltiple en forma clínica recurrente-remitente (Posser et al), concretamente en la fase de no brote, sobre todo por dos razones: a) por el hecho de que estos pacientes constituían la gran mayoría de los que habitualmente acudían a la unidad de día del Servicio de Neurología del Hospital Universitario San Carlos de Madrid, y b) por el interés de realizar un estudio uniforme que nos proporcionara una información fácil de interpretar.
El análisis estadístico de las prevalencias de ADN obtenidas para los virus herpes estudiados conseguidas a través de la nested PCR del ADN purificado de leucocitos circulantes, obtenidos a partir de sangre total, nos indican que tanto en el grupo patológico como en el grupo control son prácticamente iguales, salvo para el caso de herpesvirus humano 6, que es significativamente más elevado en el grupo patológico, constituido por enfermos de esclerosis múltiple, que en el grupo control, formado por donantes de sangre (p < 0,0001).
Los resultados obtenidos nos hacen pensar que herpesvirus humano 6 establece una infección sistémica en los enfermos de esclerosis múltiple, si bien todavía desconocemos cómo puede intervenir en el desarrollo de esta enfermedad. Tal vez pueda tratarse de ese factor ambiental, anteriormente descrito, que contribuiría a alterar el sistema inmunológico del individuo, provocando la respuesta autoinmune que da lugar al cuadro que conocemos como esclerosis múltiple.
Si partimos del hecho de que, según todos los datos recogidos de la bibliografía hasta el momento23, la primoinfección por herpesvirus humano 6 tiene lugar prácticamente en el 100% de la población antes de los 3 años de edad, la esclerosis múltiple no sería consecuencia de la primoinfección por este virus, ya que la edad a la que suele aparecer está entre 25-30 años, siendo muy raro que ocurra antes de los 10 y después de los 60 años1. Si el virus ya está acantonado en nuestro organismo y permanece de forma latente, principalmente en el sistema nervioso central, descrito por muchos autores como un reservorio de herpesvirus humano 623, la respuesta autoinmune que daría lugar a la esclerosis múltiple se tendría que deber a una reactivación del virus.
A pesar de que hasta el momento no han sido muchos los estudios que se han realizado sobre este tema, encontramos en ellos dos posiciones claramente divergentes: los que descartan la implicación de herpesvirus humano 6 en la esclerosis múltiple24-28 y los que indican que puede existir relación entre ambos14,29-32.
Otros estudios realizados, sin embargo, establecen una relación entre la presencia de herpesvirus humano 6 y otras lesiones cerebrales: encefalomielitis33, leucoencefalitis subaguda34, encefalopatía aguda35, demostrando que la presencia de este virus está asociada a distintas enfermedades cerebrales.
A pesar de que se ha postulado que en la patogenia de la esclerosis múltiple podrían estar implicadas infecciones virales de algunos otros virus herpes36-42, en el presente estudio no se ha encontrado ninguna diferencia estadísticamente significativa entre las prevalencias de ADN de todos estos virus en los 2 grupos de pacientes comparados, lo que nos llevaría a descartar la implicación de todos ellos en la esclerosis múltiple.
Influencia del sexo en la prevalencia global de ADN de los virus herpes
A pesar de que la esclerosis múltiple es una enfermedad que afecta más frecuentemente a las mujeres (63%) que a los varones (37%) en una proporción de 1,681, cuando analizamos las prevalencias de ADN de los virus herpes en ambos sexos no encontramos diferencias estadísticamente significativas en ningún caso, ni en el grupo patológico ni en el grupo control.
Influencia del tratamiento con interferón ß en la prevalencia global de ADN de los virus herpes
El empleo de los interferones en pacientes con esclerosis múltiple se debió a la creencia de que la enfermedad podía estar causada por una infección viral persistente o latente del sistema nervioso central en personas con un sistema inmunológico alterado y al hecho de que los interferones poseen actividades antivíricas e inmunomoduladoras1.
Sin embargo, el mecanismo de acción de los interferones en la esclerosis múltiple sigue siendo desconocido, a pesar de que son muchos los trabajos que aparecen en la bibliografía43-48 y que estudian los distintos aspectos del tratamiento con interferón ß en la esclerosis múltiple.
En nuestro estudio observamos que no existía ninguna diferencia estadísticamente significativa entre las prevalencias de ADN de los pacientes que habían recibido tratamiento con interferón ß y los que no lo habían recibido, en ninguno de los virus herpes estudiados.
Para el caso concreto de herpesvirus humano 6, la prevalencia de infección entre los pacientes que recibieron el tratamiento fue del 48,39% y entre los que no lo recibieron fue del 50%, una diferencia que no es estadísticamente significativa (p > 0,05).
Por tanto, podemos concluir diciendo que estos resultados nos hacen pensar que herpesvirus humano 6, en enfermos de esclerosis múltiple, puede establecer una infección sistémica, aunque la determinación exacta del modo en que actúa en esta enfermedad, si es que realmente lo hace, requerirá todavía estudios posteriores. Es muy probable que la aplicación a este estudio de la variante cuantitativa de PCR nos permita conocer mejor la influencia del herpesvirus humano 6 en la esclerosis múltiple, al permitirnos estudiar la relación entre la carga vírica encontrada y la evolución clínica de la enfermedad.
