Introducción
Salmonella spp. continúa siendo una de las causas principales de gastroenteritis en España1. Según la clasificación taxonómica más aceptada, el género Salmonella se divide en dos especies, S. enterica y S. bongori2, siendo la serotipificación el marcador epidemiológico de elección para la tipificación de las cepas de este género. El conocimiento de los serotipos circulantes en un país permite saber cuáles son los reservorios o los alimentos que sirven de vehículo en las toxiinfecciones alimentarias por Salmonella, la implicación de cada serotipo en la gravedad de la infección, la distribución de resistencias, la evolución de cada uno de ellos, la detección de brotes y la cuantificación de infecciones esporádicas3.
La serotipificación esta basada en el esquema, internacionalmente reconocido, de Kauffmann-White2 y consiste en la caracterización, generalmente por aglutinación en portaobjetos, de los antígenos somáticos O, de los antígenos flagelares H y rara vez del antígeno capsular Vi. Muchos serotipos de Salmonella expresan dos tipos de antígenos flagelares, denominados tradicionalmente antígenos de fase 1 y de fase 2. Cada Salmonella expresa alternativamente estos dos tipos de antígenos mediante un mecanismo denominado "cambio de fase"4. En la última revisión de este esquema, llevada a cabo por el Instituto Pasteur (París), en el centro Colaborador de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la Referencia e Investigación en Salmonella, se han descrito 2.523 serotipos5.
Sin embargo, algunos serotipos son los que con más frecuencia se identifican en cada país a lo largo del tiempo. En estos casos es necesaria la utilización de otros marcadores epidemiológicos complementarios que subdividan las cepas de estos serotipos. Entre ellos, la fagotipificación se ha utilizado con gran éxito en los principales serotipos de Salmonella. Esta técnica consiste en la separación de las cepas en fagotipos, de acuerdo con el patrón de lisis obtenido cuando se infectan con un juego de bacteriófagos, generalmente específicos de serotipo.
Existen esquemas de fagotipificación, reconocidos internacionalmente, para los serotipos Enteritidis6, Typhimurium7, Hadar8, Virchow9 y Typhi10. Los juegos de bacteriófagos para cada uno de estos serotipos son suministrados a los laboratorios nacionales de referencia por el Centro Colaborador de la OMS para la fagotipificación de enterobacterias, de la Agencia para la Protección de la Salud (HPA) (Colindale, Londres, Reino Unido).
Salmonella serotipo Typhi es el microorganismo causante de la fiebre tifoidea, que a diferencia de otras salmonelosis es una enfermedad sistémica generalizada. El tratamiento es preceptivo en el caso de la fiebre tifoidea y, por lo tanto, la vigilancia en la evolución de los patrones de resistencia a antimicrobianos que presentan los aislamientos del serotipo Typhi es imprescindible tanto desde el punto de vista epidemiológico como clínico.
El Laboratorio Nacional de Referencia de Salmonella y Shigella (LNRSSE) recibe y estudia todos los años las cepas de Salmonella de diferentes orígenes, procedentes de laboratorios de salud de nuestro país. Los resultados de la serotipificación y fagotipificación, en aquellos serotipos para los que existen esquemas reconocidos internacionalmente, y de los patrones de resistencia de las cepas del serotipo Typhi, se publican anualmente en el Boletín Epidemiológico Semanal del Centro Nacional de Epidemiología (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad y Consumo)11.
En este trabajo se analiza la tendencia de los principales serotipos y fagotipos de Salmonella identificados en el LNRSSE durante los años 1997 a 2001, marcadores utilizados tradicionalmente en la investigación epidemiológica de Salmonella y el patrón de resistencias de las cepas del serotipo Typhi. Sin embargo, se debe tener en cuenta que para establecer relaciones clonales entre las cepas pertenecientes a un mismo serotipo y fagotipo sería necesaria la posterior utilización de marcadores moleculares12.
Métodos
Las cepas de Salmonella recibidas en el LNRSSE durante los años 1997-2001 se reaislaron en agar McConkey y se confirmaron como pertenecientes al género Salmonella con un número reducido de pruebas bioquímicas convencionales13.
Cuando se conocía el nombre de los enfermos, se seleccionaron las cepas de forma que se incluyó una única cepa por paciente y año en el estudio de la frecuencia de serotipos y fagotipos y la distribución de las cepas por sexo y grupos de edad.
La serotipificación de estas cepas se llevó a cabo por microaglutinación en tubo, con sueros producidos en nuestro laboratorio, siguiendo el protocolo elaborado por el Instituto Pasteur14, y/o aglutinación en porta con sueros comerciales (BioRad Laboratories, S.A., Madrid, España; Sifin, Izasa, Madrid, España y Staten Serum Institut Izasa, Madrid, España). Los antígenos somáticos se identificaron directamente a partir del crecimiento de la bacteria en BHI o TSA. Los antígenos flagelares se identificaron seleccionando las bacterias más móviles por cultivo en medio Sven-Gard (BioRad Laboratories, S.A., Madrid, España). Tras haber identificando una de las fases flagelares, cada cepa se volvió a sembrar en una placa con medio Sven-Gard que contenía antisuero (BioRad Laboratories, S.A., Madrid, España) de la fase previamente detectada, para identificar la otra fase.
En algunos serotipos fue también necesario determinar la subespecie a la que pertenecían, lo que se realizó siguiendo el método propuesto por Popoff y Le Minor, basado en la determinación de un pequeño número de características bioquímicas y la susceptibilidad frente al fago O12.
Tras la serotipificación, se llevó a cabo la fagotipificación de las cepas de Salmonella de los serotipos Enteritidis6, Typhimurium7, Hadar8, Virchow9 y Typhi10 siguiendo los esquemas internacionalmente reconocidos para estos serotipos, con los bacteriófagos suministrados por la Agencia para la Protección de la Salud (HPA) (Colindale, Londres, Reino Unido).
Con el crecimiento en fase exponencial, en caldo común con 0,8% de cloruro sódico, del aislamiento que se quería tipificar, se inundó una placa de agar común con 0,8% de cloruro sódico. Se retiró el sobrenadante y se depositó en la superficie de la placa una gota de 10 ml de cada uno de los bacteriófagos que constituyen el juego de fagos para ese serotipo. Las placas se incubaron toda la noche a 37 °C, excepto en el caso del serotipo Typhi para el que la temperatura de incubación es 38,5 °C, y se determinó la producción o no de lisis con cada uno de los bacteriófagos y la intensidad con que ésta se produjo (desde lisis total a placas aisladas de lisis).
Aquellos aislamientos que presentaban patrones de lisis que no se correspondían con ninguno de los fagotipos reconocidos para cada esquema se incluyeron en la denominación "patrón no reconocido" (PNR). Otros aislamientos "no tipificables" (NT) fueron los que no se lisaron con ninguno de los fagos de su juego.
Las cepas del serotipo 4,5,12:i:-, probablemente variantes monofásicas del serotipo Typhimurium15, se fagotipificaron con el juego de fagos del serotipo Typhimurium.
El LNRSSE estudió el patrón de resistencias de todas las cepas recibidas del serotipo Typhi. La resistencia se determinó por la técnica de Kirby-Bauer de difusión en agar, siguiendo los criterios y los puntos de corte de la NCCLS16, frente a ampicilina (AMP), amoxicilina (AMX), carbenicilina (CRB), cefoperazona (CFP), cloranfenicol (CHL), gentamicina (GEN), kanamicina (KAN), estreptomicina (STR), sulfonamidas (SSS), trimetoprima (TMP), tetraciclina (TCY) y ciprofloxacino (CIP), según siglas WHONET (http://200.68.11.22/Herramientas/Estandares/ CodigosWhonetAntibioticos.htm).
La tendencia temporal de los principales serotipos y fagotipos de Samonella de origen humano se evaluó con la prueba exacta de Fisher para variables dicotómicas. Los resultados se analizaron con el paquete informático Epi Info 2002 (http://www.cica.es/epiinfo/).
Resultados y discusión
Se tipificaron 30.856 cepas de Salmonella de origen humano recibidas en el LNRSSE durante los años 1997-2001. Las cepas se enviaban de forma voluntaria desde los laboratorios de salud, por lo que no todas las provincias estaban representadas con el mismo peso, aunque la mayoría de ellas estaban representadas en el estudio.
Se recibieron cepas procedentes de 264 laboratorios. De ellos, 87 laboratorios enviaron cepas al menos en 4 de los 5 años del estudio y 32 laboratorios en 3 años, lo que supuso el 88,5 y 93,3%, respectivamente, del total de las cepas recibidas y permite evaluar la tendencia de los serotipos en este período de tiempo.
Las cepas procedían mayoritariamente de heces (90,7%), seguido de sangre (3%) y orina (0,8%). Otros orígenes tuvieron una frecuencia inferior a 0,5%. En el 4,7% de las cepas se desconocía su origen. En cuanto a la distribución por sexo, cuando se conocía, el 52,6% procedían de varones y el 47,4% de mujeres.
El mayor número de cepas de Salmonella se aislaron en niños menores de 5 años y principalmente en niños de 1 y 2 años. La distribución por grupos de edad, en los 18.185 casos en los que se disponía de esta información, fue: menores de 1 año, 1.324 (7,3%); de 1 a 5 años, 6.587 (36,2%); de 6 a 14 años, 2.662 (14,6%); de 15 a 25 años, 1.430 (7,9%); de 26 a 35 años, 1.386 (7,6%); de 36 a 45 años, 1.088 (6,0%); de 46 a 55 años, 1.023 (5,6%); de 56 a 65 años, 863 (4,7%), y mayores de 65 años, 1.822 (10,0%) casos.
La distribución por años de los serotipos de Salmonella de origen humano más frecuentes se muestra en la tabla 1. Como en estudios anteriores, Enteritidis fue el más frecuente cada año seguido de Typhimurium17. Estos dos serotipos son también los más referidos en la mayoría de los países en los que se dispone de esta información18,19, aunque en algunos de ellos como en Estados Unidos sea el serotipo Typhimurium el más frecuente3. En nuestro estudio, el serotipo Enteritidis, que mostraba una ligera tendencia a ir disminuyendo en años anteriores a 199717, parece haber retomado una tendencia alcista en los últimos años, con un incremento del 45 al 61%, estadísticamente significativo (p < 0,001; odds ratio [OR], 0,53; intervalo de confianza del 95% [IC 95%], 0,49-0,57), justo al contrario de lo que ocurre con el serotipo Typhimurium cuya incidencia ha ido disminuyendo en este mismo período de tiempo (p < 0,001; OR, 1,9; IC 95%, 1,77-2,10). La frecuencia de aparición de otros serotipos varía en función del país (http://www.hpa.org.uk/hpa/inter/enter-net_menu.htm).
El serotipo Hadar, que experimentó un aumento estadísticamente significativo en el período 1993-199617, paralelamente al aumento de este serotipo en cepas aisladas de carne de ave20, continuó aumentando durante los 3 primeros años de este estudio para disminuir paulatinamente en 2000 y 2001. El serotipo Hadar se encuentra también entre los tres o cuatro serotipos más frecuentemente aislados en Europa (http://www.hpa.org.uk/hpa/inter/enter-net _inter_db.htm), pero es mucho menos frecuente en Estados Unidos21.
En el segundo semestre de 1997 se identificó en 14 de las 17 comunidades autónomas, una cepa monofásica atípica del serotipo 4,5,12:i:-, que rápidamente aumentó su incidencia pasando a ocupar el cuarto lugar en frecuencia en los años del estudio22. Según el esquema de Kauffmann-White, esta combinación antigénica podría ser una variante monofásica del serotipo Typhimurium (4,5,12:i:1,2), del serotipo Lagos (4,5,12:i:1,5) o podría representar un nuevo serotipo. Estudios moleculares posteriores establecieron que, en su mayoría, constituían un clon de cepas probablemente derivado del serotipo Typhimurium15,23.
El serotipo Virchow, que había ido decreciendo en el período 1993-199617, se ha estabilizado en este período ocupando el quinto lugar.
Es de destacar el aumento estadísticamente significativo del serotipo Rissen (p < 0,0001; OR, 0,08; IC 95%, 0,03-0,22). En 2001, se recibieron 63 cepas de este serotipo procedentes de 29 laboratorios de 10 comunidades autónomas, por lo que parece que esté distribuido en todo el territorio nacional. Por el contrario, en el año 1999, la incidencia de los serotipos Grumpensis y Agona fue 6,4 veces y 2,4 veces respectivamente superior en Cataluña a la encontrada en el resto de las comunidades. En este año se recibieron 104 cepas del serotipo Grumpensis y 71 cepas del serotipo Agona. De ellas, 90 cepas (86,5%) del serotipo Grumpensis y 50 cepas (70,4%) del serotipo Agona procedían de Cataluña y sólo 3 cepas del serotipo Grumpensis se asociaron a un brote.
Cabe hacer algún comentario sobre S. ser Typhi, responsable de la fiebre tifoidea, ya que esta enfermedad es de "declaración obligatoria" (EDO) en nuestro país y por lo tanto se tiene más información sobre su incidencia. El número de cepas que se reciben en el LNRSSE es relativamente bajo con relación a los casos de fiebre tifoidea declarados y suele suponer, como promedio, el 10% de estos casos. Esta comparación entre casos de salmonelosis y cepas recibidas en el LNRSSE no puede hacerse en otros serotipos de Salmonella, ya que la rúbrica "salmonelosis" nunca ha sido de declaración obligatoria y, desde el año 1997 dejaron incluso de serlo las "toxiinfecciones alimentarias" y "otros procesos diarreicos", que hubieran permitido estimar el alcance de las salmonelosis en España, si bien de forma indirecta (Real Decreto 2210/1995).
La distribución por años de las cepas de Salmonella ser Typhi recibidas no tiene una tendencia clara, aunque sí parece tener una tendencia descendente el número de casos de fiebre tifoidea declarados al Sistema EDO del Servicio de Vigilancia Epidemiológica (Centro Nacional de Epidemiología), desde 324 casos declarados en el año 1997 a 174 en 2001 (http://cne.isciii.es/htdocs/bes/).
La distribución por fagotipos de las cepas del serotipo Enteritidis se muestra en la tabla 2. El esquema utilizado en nuestro laboratorio para este serotipo ha sufrido sucesivas ampliaciones hasta el año 1999. Por ello, algunos fagotipos no aparecen en los primeros 2 años de este estudio y otros, por su escasa incidencia, han sido englobados en el fagotipo al que se hubiera asignado con el esquema original de 10 fagos.
Los fagotipos 1, 4, 6a y 6 han sido en el período 1997-2001 los más frecuentes (82% de las cepas), pero mientras que el fagotipo 1 ha experimentado un notable aumento a lo largo de estos años pasando del 26 al 41%, los fagotipos 4 y 6A han ido disminuyendo en una proporción similar. El fagotipo 4 sigue siendo el más frecuente en otros países, habiendo desplazado incluso al fagotipo 8, tan frecuente en países como Estados Unidos en años anteriores a 1997, pero que nunca ha ocupado un lugar predominante entre nuestros aislamientos24.
El fagotipo 21 ha experimentado un aumento en estos años que cabe destacar y que le sitúa en el quinto lugar. Por el contrario el fagotipo 34, que empezó siendo el quinto en frecuencia en 1997, ha ido disminuyendo en este período de tiempo, identificándose en 2001 con una frecuencia inferior al 1%.
La distribución por años de los fagotipos más frecuentes del serotipo Typhimurium se muestra en la tabla 3. Los fagotipos 104, 104B, 193 y 120 se han mantenido entre los más frecuentes a lo largo de todos los años del estudio. La propagación internacional a partir de 1990, de un clon de cepas multirresistentes del fagotipo 104, incrementó drásticamente las tasas de resistencia de Salmonella a los antimicrobianos y este clon ha sido responsable de numerosos brotes epidémicos alrededor del mundo25. En algunos países como en Inglaterra y Gales parece que esté declinando la incidencia de este clon26, que puede ser resistente incluso a 9 antimicrobianos, siendo lo más habitual que sea resistente a AMP, CHL, STR, SSS, TCY, mientras que en nuestro país continúa siendo uno de los más frecuentes27. Sin embargo, cabe mencionar que el fagotipo 120, algunas de cuyas cepas se cree que han aparecido por cambios en la susceptibilidad al juego de fagos en una pequeña proporción de cepas multirresistentes del fagotipo 104, ha disminuido drásticamente en estos años28.
Cuando en 1998 se incorporan al esquema del serotipo Typhimurium dos nuevos fagos adicionales aparece un nuevo fagotipo U302, cuya frecuencia rápidamente le sitúa en el tercer lugar, desplazando incluso al fagotipo 104B en los años 2000 y 2001. El fagotipo U302 ha sido descrito como estrechamente relacionado al fagotipo 10429.
También la mayoría de las cepas monofásicas del serotipo 4,5,12:i:- (651/887) se tipificaban como fagotipo U30222. Si además consideráramos a las cepas del serotipo 4,5,12:i:- como variantes monofásicas del serotipo Typhimurium15,23, tendríamos 1.241 cepas del fagotipo U302, lo que apunta la verdadera importancia de este fagotipo.
Este clon, caracterizado molecularmente por electroforesis en campo pulsado, presenta un patrón de multirresistencia a antimicrobianos característico, siendo resistente a AMP, CHL, STR, GEN, SUL, TCY, SXT. Su frecuencia, que ha ido bajando progresivamente desde su aparición en el segundo semestre de 1997 y su mayor incidencia en 1998 con 227 cepas (4,1%) a 169 cepas (2,3%) en 2001, se asoció al consumo de alimentos derivados de cerdo22. Cabe hacer notar la resistencia de estas cepas frente a gentamicina, resistencia poco frecuente entre las cepas de origen humano recibidas en el LNRSSE30.
La distribución por años de los fagotipos más frecuentes del serotipo Hadar, a partir del año 1998 en el que se dispone del juego de bacteriófagos para este serotipo se muestra en la tabla 4. Los fagotipos 2 y 1 son los más frecuentes a lo largo de todos los años. A estos 2 fagotipos pertenecen más del 50% de las cepas de este serotipo y la incidencia de cada uno de ellos es 5 veces superior a las de los demás.
La distribución por años de los fagotipos más frecuentes del serotipo Virchow se muestra en la tabla 5. En nuestro país el fagotipo 8 es el predominante, como sucede en otros países31, y como sucedía en Inglaterra y Gales hasta 1994, cuando fue reemplazado por el fagotipo 2632.
Finalmente se analizan los fagotipos del serotipo Typhi cuya distribución se muestra en la tabla 6. El LNRSSE tiene una larga experiencia en el estudio de los fagotipos de este serotipo y su distribución se publica anualmente en los Boletines Epidemiológicos Semanales (http://cue.isciii.es/htdocs/bes/). Debido al pequeño número de cepas recibidas la incidencia por año es tan variable que, en nuestra opinión, no permite extraer conclusiones. Sin embargo, los fagotipos E1a, A, C1 y AD se han mantenido durante todos los años del estudio, así como en estudios anteriores, como los más frecuentes33.
En cuanto a las tasas de resistencia del serotipo Typhi, el 36,7% de las cepas fueron resistentes al menos a un antimicrobiano, si bien el 19,4% fueron resistentes sólo a estreptomicina y el 10,1% sólo a las sulfonamidas. Cabe destacar la identificación de una cepa multirresistente (AMP, AMX, CRB, STR, SSS, TMP, TCY) del fagotipo E1a, aislada en 1999 del coprocultivo de una mujer que viajó a la India y una cepa resistente a cloranfenicol del fagotipo D1, uno de los antibióticos tradicionalmente utilizados en el tratamiento de la fiebre tifoidea.
La certeza de que diferentes cepas tengan un origen común nunca puede asegurarse totalmente, pero se incrementa con la realización de más y mejores técnicas de tipificación. La utilización jerárquica de la serotipificación, y posteriormente de la fagotipificación de los serotipos más frecuentes, aumentó enormemente el poder de discriminación de este esquema combinado. La distribución de los serotipos/fagotipos más frecuentes durante el período 1997-2001 se muestra en la figura 1.
Figura 1. Distribución de los serotipos/fagotipos de Salmonella de origen humano más frecuentes en el período 1997-2001. Ent: serotipo Enteritidis; Tym: serotipo Typhimurium; Had: serotipo Hadar.
El estudio de los serotipos/fagotipos de las cepas circulantes de Salmonella puede ofrecer, en aquellos casos en los que se caracterizan tipos poco frecuentes, la suficiente evidencia de la transmisión epidemiológica entre enfermos y fuentes de infección. Sin embargo, para poder establecer relaciones clonales entre las cepas pertenecientes a un mismo serotipo y fagotipo será siempre necesario la posterior utilización de marcadores moleculares.
Agradecimientos
Queremos expresar nuestro agradecimiento a todos los laboratorios de salud que a lo largo de los años nos envían sus cepas de Salmonella para su tipificación.
