Fundamento. Descripción retrospectiva de los casos de endocarditis por Actinobacillus actinomycetemcomitans observados en nuestro hospital.
Pacientes y métodos. Se revisan las historias clínicas y los documentos microbiológicos de los enfermos ingresados en nuestro centro, con aislamiento en los hemocultivos de A. actinomycetemcomitans durante el período 1972-1998. Se aplicaron los criterios diagnósticos de endocarditis infecciosa de Duke.
Resultados. Se diagnosticaron cuatro pacientes con endocarditis por A. actinomycetemcomitans, tres varones y una mujer, durante un período de doce años. Dos eran portadores de prótesis valvulares y en tres enfermos se había practicado una manipulación odontoestomatológica previa. La presentación fue subaguda en todos. En dos casos hubo manifestaciones de la endocarditis a distancia (focalidad neurológica y nódulos de Osler). Además de la fiebre, existió elevación de reactantes de fase aguda en todos los pacientes, anemia inflamatoria en tres casos e insuficiencia cardíaca en uno. Se necesitó un mínimo de siete días para observar signos de crecimiento en los frascos de hemocultivos y se precisaron, en el pase a medios sólidos, atmósfera y composición nutricional apropiadas para obtener el aislamiento de este microorganismo. Todas las cepas fueron sensibles a las penicilinas o aminopenicilinas (salvo una con sensibilidad intermedia), aminoglucósidos y quinolonas estudiadas. El tratamiento con penicilina G sódica, sola o combinada con un aminoglucósido, permitió controlar la infección en tres pacientes. Ningún paciente precisó cirugía cardiovascular.
Conclusiones. En nuestra experiencia, la endocarditis por A. actinomycetemcomitans es una entidad rara que no siempre acontece sobre una cardiopatía previa. La puerta de entrada suele ser un foco oral. El curso subagudo-crónico y a veces atípico puede demorar el diagnóstico durante meses. Nuestras cepas mantienen una sensibilidad uniforme a penicilinas y otros betalactámicos, así como frente a aminoglucósidos y quinolonas. Pese a las complicaciones evolutivas de algún paciente, el pronóstico ha sido excelente con tratamiento antibiótico solo, alcanzando la curación sin necesidad de cirugía de recambio valvular.
Background. We describe the cases of endocarditis caused by Actinobacillus actinomycetemcomitans (EAA) obseved at our hospital.
Patients and methods. We revised clinical records and microbiological documents from patients admited at our hospital, with A. actinomycetemcomitans in blood cultures occurred from 1972-1998. We used Dukes's diagnostic criterions of infectious endocarditis.
Results. Four patients were diagnosed of EAA for twelve years, there were males and two females. Two cases have had valvular prothesis and three patients suffered a previous odontological manipulation. All cases were clinical subacute presentation. Two patients have had at a distance endocarditis clinical manifestation (neurological deficit and Osler nodules). All patients were febrile and elevation of acute reactants, two cases had inflammatory anemia and one had cardiac failure. We observed growing signs after 7 days of culture and it was necessary, on solid medium, adequate atmosphere and nutritional composition to procure A. actinomycetemcomitans growing. All isolates were susceptible to studied penicillins or aminopenicillins (except one isolate with intermediate susceptibility), aminoglycosides and quinolones. Tratment with penicillin G, lone or combined with aminoglycosides, controled infection in three patients. No case needed cardiac surgery.
Conclusions. In our experience, EAA is a strange entity and there isn't a previous cardiac disease always. Usually, the place of entrance is a buccal focus. Subacute-chronic course and, sometimes, uncommon, can delay diagnostic during months. Our isolates have an uniform sensibility to penicillins and others betalactamic, anyway aminoglycosides and quinolones, therefore an antibiotic combination of two antibiotics from theese families at least could be the choise treatment. Except evolutive complications in some patient, prognostic has been excellent with only antibiotic treatment, withoult valvular surgery.
Introducción
La bacteriemia asociada con endocarditis infecciosa debida a microorganismos clásicos, como especies de Streptococcus, Staphylococcus y Enterococcus, es continua. Estas bacterias pueden cultivarse con el uso de medios y condiciones de incubación convencionales. Otros microorganismos causantes de endocarditis, como los del grupo HACEK, plantean dificultades de diagnóstico, tanto clínico como microbiológico. Sin embargo, el reconocimiento de estas endocarditis por bacterias inhabituales es importante dado que su curso es fatal de no ser diagnosticadas y tratadas adecuadamente1.
HACEK es el acrónimo de grupo que incluye bacterias gramnegativas de crecimiento dificultoso o con requerimientos nutricionales y/o de incubación especiales como Haemophilus (aphrophilus, parainfluenzae y otros), Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens y Kingella kingae. Todos ellos forman parte de la flora normal de la cavidad orofaríngea y del tracto respiratorio superior. En determinadas áreas geográficas, el grupo HACEK causa en torno al 3% de los casos de endocarditis infecciosa, siendo la incidencia estimada de 0,32 casos por 100.000 habitantes y año2,3.
A. actinomycetemcomitans, descrito en 1912 por Klinger4, es un cocobacilo gramnegativo anaerobio facultativo de crecimiento lento, que precisa una atmósfera enriquecida en CO2. Produce sobre válvula nativa el 0,3% de los casos de endocarditis, y sobre válvula protésica el 1,1%5. En nuestro país no disponemos de información acerca de la incidencia de endocarditis por A. actinomycetemcomitans, aunque se han comunicado casos aislados en la literatura procedente de nuestro entorno (MEDLINE 1988-1998)6-9. En Francia la incidencia está cercana a cuatro casos por año10. En este trabajo presentamos los pacientes con endocarditis por A. actinomycetemcomitans diagnosticados y tratados en nuestro hospital tras revisar un amplio período de tiempo y comparamos algunas características epidemiológicas, clínicas y evolutivas con las de otras series previamente publicadas.
Pacientes y métodos
Se revisaron retrospectivamente las historias clínicas de los enfermos con hemocultivos positivos en los cuales se aisló A. actinomycetemcomitans durante el período 1972-1998, recogiendo los siguientes datos: características demográficas, antecedentes personales, sintomatología, exploración física, pruebas analíticas, estudios radiográficos, electrocardiogramas, ecocardiogramas, informes microbiológicos, información referente al tratamiento y la evolución final. Independientemente de la época de cada episodio, se utilizaron para el análisis final los actuales criterios de endocarditis infecciosa de Durack et al11, en lugar de los más antiguos de Fordham von Reyn12.
Los hemocultivos se extrajeron y procesaron según las técnicas, métodos y recomendaciones al uso, dependiendo de la época y momento del caso. Por tanto, se utilizaron botellas con medios líquidos y lectura visual durante la incubación, sistemas semiautomatizados (radiométricos y no radiométricos) además de los actuales sistemas automatizados con monitorización continuada de los frascos [Bact/Alert (Organon Teknika)® con lectura colorimétrica, y Bactec 9240 (Becton & Dickinson) con lectura fluorométrica] según la fecha del hemocultivo.
Tras la detección de signos de crecimiento y la práctica de una tinción de Gram y/o de naranja de acridina, se consiguió el aislamiento mediante los subcultivos pertinentes realizando los pases a los medios líquidos (caldo de tioglicolato) y sólidos (agar sangre, agar chocolate y/o agar Levine) seleccionados, en las condiciones de incubación y atmósfera apropiadas. En la identificación de género y especie se tuvieron en cuenta las características macroscópicas y microscópicas (fig. 1), de atmósfera y de temperatura más adecuadas para el crecimiento, el tiempo y los medios nutricionalmente enriquecidos que se precisaron, así como el perfil de reacciones bioquímicas características de cada aislamiento. Ocasionalmente fue necesario el empleo de métodos comerciales de identificación (tarjetas NHI®, Vitek, bio-Mérieux) para confirmar la identidad del microorganismo. Los estudios de sensibilidad de las cepas aisladas se realizaron mediante la técnica de disco-difusión (Kirby-Bauer), según las normas y recomendaciones al uso aconsejadas en cada momento del estudio.
Observaciones clínicas
En conjunto, se han encontrado cuatro enfermos diagnosticados de endocarditis por A. actinomycetemcomitans, agrupados en el período de tiempo correspondiente a los últimos doce años. Cada caso es descrito a continuación:
Caso 1 (1987): Varón de 31 años que, tras una exodoncia siete semanas antes, consultó por fiebre, escalofríos y artralgias iniciados una semana después del procedimiento estomatológico, que cedían con el uso de amoxicilina y que reaparecían el cesar el tratamiento. Exploración física: temperatura de 39°C, boca séptica, auscultación cardíaca normal y hepatoesplenomegalia. En el hemograma: 8,44 x 109 leucocitos/l con 73% de neutrófilos, hemoglobina (Hb) 1,15 g/l, 173 x 109 plaquetas/l y velocidad de sedimentación globular (VSG) de 32 mm/1ª hora. La bioquímica fue normal. En la orina: indicios de proteínas y leucocitos aislados. La exploración odontoestomatológica mostró cuatro piezas dentarias en mal estado. Radiografía de tórax y electrocardiograma normales. Doce días más tarde, en cuatro de los seis hemocultivos practicados creció un microorganismo gramnegativo, iniciándose tratamiento con eritromicina y amikacina. Dos días después, al confirmarse en el aislamiento la identificación de A. actinomycetemcomitans se prosiguió el tratamiento con penicilina G sódica (12 millones de UI/día) y amikacina. La auscultación cardíaca había cambiado apareciendo un desdoblamiento del primer ruido y un soplo protosistólico en el borde paraesternal izquierdo, aunque la ecocardiografía transtorácica sólo mostró una regurgitación mitral y tricuspídea mínimas junto a dilatación de la raíz aórtica sin vegetaciones. Ante la persistencia de la fiebre, doce días después se modificó la pauta antibiótica sustituyéndola por estreptomicina y tetraciclina durante cuatro semanas más, quedando el paciente asintomático y alcanzando la curación en el seguimiento.
Caso 2 (1988): Mujer de 41 años, portadora de prótesis mitral y aórtica, que ingresó por aparición en los últimos nueve meses de brotes de nódulos cutáneos eritematosos en manos y pies de dos a cuatro semanas de duración con escalofríos, febrícula y síndrome constitucional. Además presentaba, desde tres días antes del ingreso, paresia faciobraquial derecha y disartria. Exploración física: temperatura de 37,6°C, lesiones eritematosas en manos y pies, ruidos de prótesis cardíacas normofuncionantes y signos de insuficiencia cardíaca. Hemograma: 13,8 x 109 leucocitos/l con 71% de neutrófilos, Hb 0,96 g/l, 436 x 109 plaquetas/l y VSG de 92 mm en la primera hora. Bioquímica hemática normal. En la orina había microhematuria. En la exploración odontoestomatológica no se encontraron focos infecciosos ni boca séptica. La radiografía de tórax mostró cardiomegalia a expensas de las cavidades izquierdas y aumento de las arterias pulmonares. Electrocardiograma (ECG): fibrilación auricular a 80 latidos por minuto. Ecocardiografía transtorácica: prótesis aórtica y mitral normofuncionantes, doble lesión tricuspídea, hipertensión pulmonar ligera y no se detectaron vegetaciones. En dos hemocultivos se observó diez días más tarde crecimiento de un cocobacilo gramnegativo identificado como A. actinomycetemcomitans. La paciente fue tratada durante cuatro semanas con penicilina G sódica (30 millones de UI/día) con resolución completa del cuadro clínico en el período de seguimiento.
Caso 3 (1990): Varón de 18 años, con antecedentes de fiebre reumática, endocarditis en la infancia por S. viridans sobre válvula mitral y posterior implantación de prótesis mitral y aórtica. Un mes antes del ingreso se le practicó una limpieza dental instrumental. Ingresó por astenia, anorexia, mialgias y lesiones cutáneas dolorosas de color rojo-púrpura y de aspecto inflamatorio en los pulpejos de pies y manos asociando fiebre en los últimos quince días. Exploración física: temperatura de 37,5°C, lesiones purpúricas en pulpejos, ruidos de prótesis cardíacas normofuncionales, sin signos de insuficiencia cardíaca y presencia de esplenomegalia. Hemograma: 9,68 x 109 leucocitos/l con 72% de neutrófilos, Hb 1,45 gl, 242 x 109 plaquetas y VSG de 32 mm en la primera hora. Bioquímica: GPT de 58 U/l y GGT de 66 U/l. Orina: indicios de proteinuria. Radiografía de tórax normal. ECG: ritmo sinusal a 70 latidos por minuto con patrón de hemibloqueo anterior y crecimiento de ventrículo izquierdo. Ecocardiografía transtorácica: prótesis normofuncionales, regurgitación tricuspídea ligera, ausencia de hipertensión pulmonar significativa y buena función ventricular sin observarse vegetaciones. En cinco hemocultivos se aisló A. actinomycetemcomitans. El enfermo fue tratado durante tres semanas con penicilina G sódica (24 millones UI/día) y hubo resolución completa del cuadro clínico.
Caso 4 (1998): Varón de 52 años, con antecedentes de fiebre tifoidea en la infancia, colecistectomía e hipertensión arterial en tratamiento con atenolol. Se le practicó una limpieza odontoestomatológica cuatro semanas antes. Presentaba quebrantamiento general, fiebre, escalofríos y sudación nocturna desde hacía tres semanas, sin respuesta al tratamiento con cefuroxima oral. Exploración física: temperatura de 38°C; auscultación cardíaca normal. Hemograma: 6,12 x 109 leucocitos/l con 86% neutrófilos, Hb 1,19 g/l, 143 x 109 plaquetas/l y VSG de 57 mm en la primera hora. Bioquímica: bilirrubina de 1,44 mg/dl. La exploración odontoestomatológica no mostró focos infecciosos. Radiografía de tórax y ECG normales. Se inició tratamiento empírico con ciprofloxacino oral bajo control ambulatorio. Una semana más tarde se informó del crecimiento en un hemocultivo de un cocobacilo gramnegativo de crecimiento lento y requerimientos nutricionales y atmosféricos exigentes. Ante la sospecha clínica y microbiológica inicial de posible brucelosis se modificó el tratamiento antibiótico, pasando a una combinación de rifampicina y doxiciclina. Las pruebas serológicas del Rosa de Bengala y del Coombs anti-Brucella fueron negativas y una semana después la bacteria fue finalmente identificada como A. actinomycetemcomitans (fig. 1). Se practicó de forma ambulatoria una ecocardiografía transtorácica y transesofágica cinco semanas después de la primera visita, que mostró una válvula aórtica con cambios degenerativos, insuficiencia moderada y una vegetación de 6 x 4 mm, además de insuficiencia mitral ligera. La auscultación cardíaca se había modificado, presentando ahora un desdoblamiento del primer ruido y un soplo sistólico en ápex. Dados los hallazgos microbiológicos y ecocardiográficos se inició tratamiento con gentamicina (tres semanas) y betalactámicos (durante seis semanas, inicialmente penicilina G sódica 24 millones de UI/día y después ceftriaxona por mayor comodidad en la administración ambulatoria). Tras finalizar el tratamiento, los hemocultivos fueron repetidamente negativos y en la ecocardiografía de control desapareció la vegetación, persistiendo una insuficiencia aórtica moderada, pero encontrándose el enfermo asintomático.
En la tabla 1 se resumen las principales características clínicas de estos cuatro casos de endocarditis por A. actinomycetemcomitans y en la tabla 2 se muestran los estudios de sensibilidad de cada una de las cepas aisladas.
Discusión
Anteriormente A. actinomycetemcomitans fue considerado un simple saprófito de la cavidad oral y nasofaríngea de las personas sanas o un acompañante de Actinomyces israelii en las lesiones de actinomicosis. En las últimas décadas se acepta su capacidad patógena como agente único en el ser humano13,14. Ha sido reconocido como microorganismo causante de infecciones de partes blandas, absceso cerebral, empiema, infección urinaria, osteomielitis y, sobre todo, ha sido vinculado con la endocarditis infecciosa5,15-17. No obstante, la endocarditis por A. actinomycetemcomitans es un proceso infrecuente tanto sobre válvula nativa como protésica1-3,5,18-20. En nuestro centro, que cuenta con 1.900 camas, sólo se han documentado cuatro casos en sus 27 años de historia, acumulándose además en los últimos doce años. Es una entidad más frecuente en hombres (77%), que muestra dos picos de incidencia, uno a los 25-35 años y otro a los 50-60 años20. La puerta de entrada se reconoce en el 37% de los episodios y suele tratarse de una infección orofaríngea o acontecer tras una instrumentación oral, si bien también se han implicado como focos de origen la sinusitis, abrasiones de la piel, toracotomías y manipulaciones del tracto urinario20,21. En nuestra serie, en un caso existió un foco infeccioso en la cavidad oral y en otros dos se realizó una manipulación odontoestomatológica en las semanas previas.
El curso suele ser subagudo o crónico y con manifestaciones clínicas que pueden ser inusuales o insidiosas, con la consiguiente demora en el diagnóstico, en alguno de los casos de hasta 18 meses22. En nuestros pacientes, el mayor tiempo de evolución antes del diagnóstico definitivo fue de nueve meses (caso 2). Al igual que en otras series, la fiebre es un dato constante. También puede haber afectación del estado general, como ocurrió en tres de nuestros enfermos. Otros hallazgos frecuentes son la hepatomegalia (53%) y la esplenomegalia (29%), siendo raros los estigmas cutáneos (2%-6%)20, aunque en dos de nuestros pacientes se observaron nódulos de Osler. En el 19% de los casos la infección se manifiesta por una complicación (insuficiencia cardíaca, accidente vascular cerebral, embolia arterial periférica, uveitis, etc.)20. En nuestro paciente nº 2 se produjo un empeoramiento de su insuficiencia cardíaca, además de un accidente cerebrovascular. En algunos casos la auscultación cardíaca es normal y es la aparición de un soplo lo que lleva a sospechar el diagnóstico de endocarditis23. Inicialmente la auscultación cardíaca no mostró alteraciones en ningún paciente, pero sí se produjeron más tarde variaciones evolutivas en el primer y cuarto casos. La ecocardiografía transtorácica tiene una sensibilidad del 50%-60% para la detección de vegetaciones, la cual es superada ampliamente por la ecocardiografía transesofágica con una sensibilidad del 95%23. En los tres primeros casos no se pudo objetivar la presencia de vegetaciones intracardíacas. En el momento en que ocurrieron no se disponía de ecocardiografía transesofágica con la cual, quizá, hubiera mejorado la rentabilidad diagnóstica.
Al igual que en otras series los datos analíticos son inespecíficos. La cifra total de leucocitos suele ser normal, a veces con neutrofilia. Según el tiempo de evolución puede desarrollarse anemia inflamatoria. La VSG es un dato constantemente alterado. En la bioquímica pueden detectarse muy leves alteraciones hepáticas. Aunque las complicaciones renales pueden aparecer hasta en un 26% de los pacientes20, en nuestros enfermos la función renal fue siempre normal, si bien el sedimento de orina mostró alteraciones en todos los casos. En series más amplias la mortalidad está en torno al 9% y depende de las complicaciones cardíacas y cerebrovasculares20. En la evolución tardía el 36% presentan graves secuelas cardíacas o neurológicas20. Tras un seguimiento de entre 24 meses y 8 años, en nuestra serie no se han producido fallecimientos ni complicaciones tardías.
El crecimiento del microorganismo se produce entre 2 y 30 días de incubación, aunque el 90% de los hemocultivos son positivos a los ocho días5-9,24. En los hemocultivos procesados en nuestro laboratorio se observaron signos de crecimiento entre los siete y diez días de incubación. No obstante, la identificación definitiva de género y especie puede requerir varios días más, dadas las especiales características de crecimiento e incubación5,6. A. actinomycetemcomitans, al igual que Brucella spp., H. aphrophilus, Pasteurella spp., y Francisella tularensis, puede aparecer como pequeños cocobacilos o bacilos cortos gramnegativos en la tinción de Gram, lo cual en determinados contextos clínicos y epidemiológicos puede llegar a confundir más que orientar al clínico y al microbiólogo. Así ocurrió en nuestro cuarto paciente, llegando a iniciarse tratamiento frente a Brucella spp., si bien las pruebas serológicas y la identificación final del microorganismo permitieron llegar al diagnóstico correcto. No obstante, esta identificación puede ser muy costosa por el comportamiento nutricionalmente exigente de esta bacteria y la casi obligada necesidad de ambientes capnófilos. Por ello, se requiere en ocasiones períodos de incubación prolongados para los subcultivos, así como para las baterías de pruebas bioquímicas necesarias en su identificación. En los caldos de cultivo, las células se adhieren a la pared de los tubos, y excepto por un escaso sedimento, el medio permanece claro. Las colonias pueden ser translúcidas y menores a 0,5 mm de diámetro tras sólo 24 horas de incubación, lo que dificulta su detección a simple vista en las placas, llegando en días sucesivos a tamaños de 2-3 mm, algunas veces con superficies rugosas y más tardíamente apareciendo como incrustadas en el agar con una fóvea central en su cúspide o retraídas en forma de estrella (como se muestra en la figura 1). Estas últimas características culturales, aunque muy sugestivas y orientadoras, no llegan a ser completamente patognomónicas.
A. actinomycetemcomitans es sensible a cefalosporinas, rifampicina, cloramfenicol, aminoglucósidos, cotrimoxazol y quinolonas, siendo variable la sensibilidad a penicilina y ampicilina5-9,20. Durante años, la pauta de tratamiento clásico fue la asociación de penicilina o ampicilina con un aminoglucósido durante tres a cuatro semanas. La excelente sensibilidad in vitro frente a las cefalosporinas de tercera generación hace de éstas una opción útil también, bien solas o asociadas a rifampicina o a un aminoglucósido20,25. Actualmente algunos autores recomiendan como tratamiento de elección fluoroquinolonas como ciprofloxacino o modernas cefalosporinas, basándose en la excelente sensibilidad a las mismas y en la alta tasa de producción de betalactamasas que encuentran en sus aislamientos1,26. Dos de nuestros pacientes fueron tratados con penicilina en monoterapia con buena evolución clínica, pese a que una de las cepas mostró sensibilidad intermedia. Sin embargo, en el caso 1, aunque la cepa fue sensible a penicilina, no quedó apirético tras doce días de tratamiento combinado con penicilina y amikacina. Es muy probable que esta falta de respuesta se debiera a la utilización de dosis subóptimas de penicilina (12 millones de UI/día). Se ha descrito un caso de tratamiento satisfactorio con ciprofloxacino oral durante ocho semanas27. El caso 4 fue tratado con medicación oral durante cinco semanas (ciprofloxacino durante una y rifampicina junto a doxiciclina en las cuatro restantes) quedando completamente asintomático, aunque en la ecocardiografía se observó una vegetación que desapareció tras completar tratamiento parenteral con betalactámicos más un aminoglucósido. Estos datos hacen pensar que quizá en algunos casos el empleo de nuevas fluoroquinolonas de amplio espectro, suficiente potencia bactericida, excelente farmacocinética y buena tolerancia por vía oral (como ciprofloxacino), bien en monoterapia o combinadas con otros antimicrobianos, durante un período de tiempo más prolongado que con los tratamientos parenterales, podría ser una opción a evaluar y debería considerarse sobre todo en aquellos episodios de endocarditis por A. actinomycetemcomitans que cursen sin graves complicaciones27. El empleo de fluoroquinolonas, al igual que el de aztreonam o cotrimoxazol, debería tenerse en cuenta como alternativa en los pacientes que no toleran o son alérgicos a los betalactámicos, dados los aceptables porcentajes de sensibilidad y la demostración de sinergia con rifampicina ocasionalmente en las pruebas in vitro28,29. El tratamiento médico solo o combinado (antibioterapia y cirugía cardiovascular) cura el 82%-87% de los casos de endocarditis por el grupo HACEK sobre válvula nativa o protésica1,3. Respecto a la endocarditis por A. actinomycetemcomitans, el 32% de los pacientes curan sin complicaciones sólo con el tratamiento médico, un 36% presentan graves secuelas secundarias a las complicaciones y un 28% precisan de recambio valvular, que es de urgencia en el 15% de los enfermos20. Pese a estas cifras de la literatura, en ninguno de nuestros pacientes se requirió de cirugía cardíaca para conseguir la curación, ni persistió ninguna secuela importante en ninguno de ellos.
Por último, dada la dificultad que en ocasiones plantea la identificación microbiológica precisa de este microorganismo así como la detección del posible foco de origen, desearíamos incluir un breve comentario sobre la capacidad de las nuevas técnicas de diagnóstico molecular; por un lado, permitiendo la distinción respecto a otras bacterias relacionadas taxonómicamente y muy cercanas en sus comportamientos bioquímicos mediante la secuenciación de fragmentos amplificados del 16S rDNA30, y por otro, facilitando mediante las modernas técnicas de tipado molecular (como los RFLP o los RAPD) la localización del foco de origen31.
