Fundamento: El diagnóstico por cultivo de la enfermedad asociada a Clostridium difficile requiere confirmar la capacidad toxigénica de los aislamientos. La técnica de referencia es la detección de la citotoxina por cultivo celular tras el crecimiento del microorganismo durante 3-5 días en medio líquido, implicando una demora en el diagnóstico final. En este estudio, se comparan de forma retrospectiva 4 métodos rápidos para la investigación de la toxigenicidad in vitro de las cepas de C. difficile.
Métodos: Se han utilizado 106 aislamientos clínicos de C. difficile (72 toxigénicos y 34 no toxigénicos), y 16 de otras especies de Clostridium. Los cuatro métodos se llevaron a cabo directamente a partir de las colonias aisladas en medio sólido. Los métodos evaluados fueron: a) detección directa de la citotoxina; b) dos técnicas de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes codificantes de toxina A y B, respectivamente, y c) detección de la toxina A por enzimoinmunoanálisis (VIDAS CDA2). En todos ellos, el tiempo total de procesamiento fue inferior al de una jornada laboral.
Resultados: Sólo las 72 cepas de C. difficile toxigénicas mostraron resultados positivos por cultivo celular y por las técnicas de PCR (sensibilidad y especificidad del 100%). En cuanto a la técnica de VIDAS, hubo 14 resultados falsos negativos entre las 49 cepas de C. difficile toxigénicas investigadas, aunque todas estas cepas fueron positivas en pruebas repetidas.
Conclusiones: Aunque todos los métodos fueron eficaces, la detección de citotoxina directa de colonias es una técnica sencilla, rápida y adecuada para aquellos laboratorios que dispongan de cultivos celulares.
Introducción
Clostridium difficile es un patógeno entérico nosocomial frecuentemente aislado en pacientes con diarrea y colitis asociada a antibióticos. El espectro clínico de la infección intestinal por C. difficile varía desde el estado de portador asintomático hasta la producción de diarrea simple, colitis no complicada y colitis seudomembranosa. El factor clave en la patogenia de la diarrea es el uso de antibióticos, que altera la flora colónica habitual y favorece así el crecimiento intestinal de Clostridium, con la consiguiente liberación de las toxinas causantes del daño en la mucosa intestinal. C. difficile produce, al menos, dos toxinas: la toxina A, una enterotoxina que provoca una lesión en la mucosa intestinal con pérdida de líquidos y electrólitos, y la toxina B, una citotoxina que carece de actividad enterotóxica pero que ejerce un efecto sinérgico in vivo con la toxina A1. Prácticamente todas las cepas toxigénicas producen ambas toxinas, mientras que las no toxigénicas no producen ninguna2. En general, el diagnóstico de laboratorio de la enfermedad asociada a C. difficile se realiza mediante la detección de las toxinas en las heces. La detección de toxina B directamente en las heces, mediante técnica de cultivo celular, es el método diagnóstico de referencia. Sin embargo, debido a la inestabilidad de las toxinas, que pueden ser destruidas por las proteasas presentes en las heces, esta prueba no consigue una total sensibilidad. Muchos autores recomiendan complementarla con el aislamiento de Clostridium en cultivo3-6. El aislamiento del microorganismo tiene, además, interés epidemiológico y permite realizar estudios de sensibilidad antibiótica. El cultivo anaerobio de C. difficile puede verse complicado por la presencia de la flora intestinal y por la gran labilidad del organismo en la aerobiosis. Sin embargo, con el uso de medios de cultivo selectivos y de técnicas que facilitan la detección de la forma esporulada del mismo, el cultivo anaerobio ofrece una buena sensibilidad. No obstante, en estos medios crecen tanto las cepas productoras de toxinas como las no toxigénicas. Por ello, tras el aislamiento e identificación de Clostridium debe investigarse su capacidad toxigénica para establecer un diagnóstico definitivo. El método de referencia para este propósito es la detección de la citotoxina por cultivo celular tras crecimiento del microorganismo durante 3-5 días en un medio líquido enriquecido. A pesar de ser una técnica sensible y específica, supone un retraso en el resultado final, lo que limita su utilidad desde el punto de vista clínico. El objetivo de este estudio es comparar cuatro técnicas rápidas para la investigación de la toxigenicidad in vitro, realizadas directamente a partir de las colonias aisladas en un medio sólido. Los resultados se compararon con el método de referencia de detección de la citotoxina por cultivo celular tras el crecimiento del microorganismo en caldo.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Se incluyeron 106 aislamientos clínicos de C. difficile (72 toxigénicos y 34 no toxigénicos), procedentes de pacientes diferentes en los que se solicitó la investigación del microorganismo y de sus toxinas en las heces. Estas cepas fueron aisladas en tres hospitales españoles, distantes entre sí (81 de ellas pertenecientes a pacientes ingresados en nuestro hospital). Como referencia para el estudio de toxigenicidad in vitro se analizó también la cepa de C. difficile ATCC 9689. Para evaluar la especificidad de los métodos, se investigaron, además, 16 aislamientos clínicos no toxigénicos de otras especies de Clostridium, incluyendo tres de Clostridium sordelli. Con la técnica de VIDAS, sólo se probaron 49 cepas de C. difficile no toxigénico, 17 cepas de C. difficile no toxigénico y siete de otras especies de Clostridium (tabla 1).
Para la identificación de los aislamientos de Clostridium se realizó el sistema comercial API (RapidD 32A, BioMérieux) complementado, en ocasiones, por pruebas manuales adicionales. En los aislamientos del medio CCFA cuyas características coloniales eran compatibles con C. difficile se llevó a cabo también una prueba de cribado consistente en la detección de la enzima prolin aminopeptidasa7.
Todas las cepas se mantuvieron congeladas a 70 ºC en medio de crioconservación hasta el momento del estudio.
Detección de la citotoxina por cultivo celular
En este estudio, la técnica de referencia utilizada fue la detección de toxina B en aislamientos crecidos en un medio líquido. Para ello, los aislamientos de clostridios mantenidos a 70 ºC en medio de conservación fueron sembrados en medio sólido (placas de agar con cicloserina-cefoxitina-fructosa [CCFA, Becton-Dickinson] para las cepas de C. difficile y agar sangre para las otras especies de Clostridium). Estos medios se inocularon a 37 ºC en anaerobiosis, durante 24-36 h. Posteriormente se subcultivaron 3 o 4 colonias de los mismos en un medio líquido enriquecido. Estos caldos se incubaron nuevamente a 37 ºC, en anaerobiosis, durante 3-5 días, y posteriormente se centrifugaron, filtraron e inocularon en monocapas de fibroblastos humanos MRC-5 (VIRCELL SL, Granada). Tras la incubación a 37 ºC, se procedió a la lectura (observación del efecto citopático característico sobre el cultivo celular). La especificidad de éste se confirmó mediante neutralización con antitoxina de C. difficile (TechLab Inc. Blacksburg. EE.UU.).
El método alternativo a evaluar consistió en la detección de toxina B directamente de las colonias aisladas en el medio sólido, sin necesidad de realizar el subcultivo en caldo. Para ello, se suspendió una sola colonia del microorganismo en 1 ml de agua estéril, se homogeneizó y centrifugó durante 5 min a 3.000 * g. El filtrado del sobrenadante se inoculó sobre cultivos de células MRC-5 que fueron procesados de igual manera que en el método de referencia antes expuesto. En ambos métodos, las lecturas de los cultivos celulares se realizaron al cabo de las 6 y 24 h de incubación.
Métodos de PCR
Se investigaron dos técnicas de PCR que detectaban los genes codificantes de las toxinas A y B, respectivamente. La extracción del ADN bacteriano se realizó mediante calentamiento de los cultivos realizados en los medios sólidos. Brevemente, se suspendieron una o dos colonias del microorganismo en 500 µ l de tampón Tris-EDTA (10 mmol/l de Tris-HCl, 1 mmol/l de EDTA; pH 8), se homogeneizaron y sometieron a una temperatura de 95 °C durante 5-10 min. Después, las suspensiones se centrifugaron a 5.000 * g durante 2 min, y el sobrenadante se usó para la amplificación.
En el caso del gen codificante de toxina A, seguimos el método descrito por Kato et al8 con mínimas modificaciones, utilizando los cebadores derivados de secuencias no repetitivas de dicho gen. Las secuencias fueron: 5 '-CCC AAT AGA AGA TTC AAT ATT AAG CTT-3', correspondientes a los nucleótidos 2479-2505, y 5 '-GGA AGA AAA GAA CTT CTG GCT CAC TCA GGT-3' (nucleótidos 2254-2283). La técnica de PCR se realizó sobre un volumen total de 50 µ l, que contenía 5 µ l del ADN molde, 5 µ l de tampón de amplificación 10X (Life Technologies, Barcelona), 1,5 mmol/l de MgCl2, 200 µ mol/l de cada nucleósido trifosfato, 75 ng de cada uno de los iniciadores y 1,0 unidades de Taq polimerasa (Life Technologies, Barcelona). Para la amplificación, se realizaron un total de 35 ciclos consistentes, cada uno, en 15 s de desnaturalización a 95 °C, 20 s de acoplamiento a 50 °C y 40 s de polimerización a 72 °C. Los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se detectaron por electroforesis en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio. Las muestras positivas presentaban una banda de 251 pb.
La detección del gen codificante de toxina B se realizó según técnica de Wolfhagen et al9. La amplificación se hizo sobre un volumen total de 50 µ l que contenía 10 µ l del ADN molde, 5 µ l de tampón de amplificación 10X, 1,5 mmol/l de MgCl2, 200 µ mol/l de cada nucleósido trifosfato, 50 pmol de cada uno de los iniciadores y 1,0 unidades de Taq polimerasa. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron 5'-TAA TAG AAA ACA GTT AGA AA-3' (nucleótidos del 410 al 429) y 5'-TCC AAT CCA AAC AAA ATG TA-3' (complementaria a los nucleótidos 691-710), según la secuencia del gen codificante de citotoxina10. Las muestras fueron sometidas a 40 ciclos de amplificación, cada uno de los cuales consistió en 1 min de desnaturalización a 94 °C, 1 min de acoplamiento a 50 °C y 1 min de polimerización a 72 °C. Los productos amplificados se detectaron por electroforesis y el ADN amplificado presentaba una banda de 301 pb.
Detección de toxina A por enzimoinmunoanálisis
La capacidad de producción de la enterotoxina en las cepas se investigó mediante el método VIDAS C. difficile Toxina A II (Vidas CDA2, bioMérieux, Francia) siguiendo el mismo protocolo técnico proporcionado por el fabricante para la detección de la toxina en las heces. Brevemente, se suspendieron 7-10 colonias en 900 µ l del diluyente suministrado en el equipo. Tras homogeneizar esta suspensión y centrifugarla a 13.000 * g durante 5-7 min, se inocularon 200 µ l del sobrenadante en el cartucho comercial del sistema. El procesamiento, lectura e interpretación de los resultados se realiza de forma automática por el equipo suministrado por el fabricante.
Resultados
Los resultados se exponen en la tabla 1. Todas las técnicas en estudio, excepto el método VIDAS, dieron resultados positivos con los 72 aislamientos clínicos de C. difficile toxigénicos, así como con la cepa patrón ATCC 9689. Por el contrario, las pruebas fueron negativas, por todos los métodos, en las cepas de C. difficile no toxigénicas, así como en las pertenecientes a otras especies de Clostridium (ninguna de ellas era toxigénica por el método de referencia). En consecuencia, la sensibilidad y especificidad de estos métodos fueron del 100%. La observación del efecto citopático sobre los cultivos celulares a partir de las suspensiones de colonias aisladas en medio sólido fue patente, en todos los casos, antes de las 6 h de incubación. Como era de esperar, y según se desprende de los resultados anteriores, todas las cepas toxigénicas presentaron la capacidad de producción de ambas toxinas, A y B.
En cuanto a la detección de toxina A por el método VIDAS, hay que señalar que 14 cepas de C. difficile toxigénico tuvieron, inicialmente, una reacción negativa en un primer ensayo (sensibilidad del 70,0%). Sin embargo, y de manera sorprendente, todas ellas fueron positivas para la prueba en ensayos posteriores realizados en condiciones aparentemente similares. Como ya hemos comentado, la detección del gen de la toxina A mediante PCR fue positiva en todas las cepas toxigénicas, incluidas estas cepas discrepantes. No encontramos ninguna razón objetiva para esta discordancia, en especial por lo que respecta a la edad del cultivo o a una aparente heterogeneidad de las colonias.
En los cuatro métodos evaluados, el tiempo total de procesamiento (desde la preparación de la muestra a partir de las colonias crecidas en un medio sólido hasta la obtención de los resultados de toxigenicidad de las cepas) fue inferior al de una jornada laboral. Así, con la técnica de detección directa de la citotoxina, los resultados se obtuvieron en 6 h, necesitando simplemente un tiempo de manipulación de la muestra de 5 min. Las técnicas de PCR se llevaron a cabo en 4-5 h, con un tiempo de manipulación de 30 min. La técnica de VIDAS fue la más rápida (el sistema puso de manifiesto los resultados tras 1 h de procesamiento interno) y con una manipulación también mínima (5 min).
Discusión
La detección de la toxina B por cultivo celular, directamente en la muestra de heces, constituye el método de referencia por su sensibilidad y por la correlación con las manifestaciones clínicas. Sin embargo, por razones de tipo técnico relacionadas con la conservación de las muestras, muchos autores recomiendan complementar este método mediante el cultivo anaerobio de las heces, principalmente cuando es previsible un retraso en su procesamiento1,5,11. Aunque el uso de medios selectivos ha mejorado la eficacia del cultivo, todavía persisten algunas limitaciones importantes, en especial la necesidad de comprobar la toxigenicidad de los aislamientos de C. difficile, lo que lleva emparejado un retraso en la emisión del resultado final. Así, el tiempo total del diagnóstico puede prolongarse durante 4-7 días, incluyendo el tiempo de incubación del cultivo primario, la identificación de las colonias y el posterior subcultivo en caldo (3-5 días), necesario como punto de partida para la comprobación del carácter toxigénico del aislamiento en cuestión. En estas condiciones, la utilidad clínica del cultivo es cuestionable. Por tanto, se necesitan alternativas más rápidas para la comprobación de la toxigenicidad in vitro, más aún teniendo en cuenta que existen métodos que acortan considerablemente el tiempo empleado en la identificación de los aislamientos primarios, como es el caso de la prueba de producción de la enzima prolinaminopeptidasa7,12. Combinando esta prueba con la detección rápida de toxigenicidad sería posible realizar el diagnóstico de laboratorio al cabo de 36-48 h de remitida la muestra, un tiempo que ya es clínicamente útil.
Los cuatro métodos evaluados cumplirían el anterior requerimiento. Por lo que respecta a las dos técnicas de PCR, el procedimiento se ha simplificado al máximo: extracción del ADN por calentamiento, un único proceso de amplificación y la detección por electroforesis. Así, la demostración de la capacidad toxigénica de un aislamiento podría conseguirse al cabo de 4-5 h, es decir, en el transcurso de una jornada laboral.
La técnica de VIDAS CDA2 ha sido diseñada para la detección de la toxina A en las heces. En este estudio usamos un protocolo similar adaptado a las colonias aisladas en medio sólido. Aunque los resultados finales estaban en total acuerdo con la técnica de referencia, hubo 14 falsos negativos en un primer análisis. No encontramos una explicación razonable para este hecho en la edad de los cultivos, ya que siempre fueron realizados a partir de cultivos de 24-48 h de incubación. Tampoco se pudo demostrar la existencia de una heterogeneidad de los aislamientos con respecto a la producción de la toxina A, ya que en todos ellos se estudió paralelamente la presencia del gen codificante de la enterotoxina con resultados positivos. A favor de la técnica debe reconocerse que es muy sencilla de realizar, completándose en 1 h con una manipulación mínima. Utilizando un procedimiento inmunoenzimático. Thonard et al13 consiguen un 90,1% de sensibilidad partiento de colonias aislada en CCFA-Taurocolato. Las diferencias con nuestro estudio (sensibilidad del 70% en primera instancia; 100% tras repetición de la prueba) pueden ser atribuibles tanto a las diferencias en el diseño como a los distintos métodos comerciales empleados en los trabajos.
Fue sorprendente la velocidad con que observamos los resultados positivos mediante la técnica de cultivo celular realizada directamente sobre las colonias. Todas las cepas de C. difficile productoras de toxina B fueron detectadas a las 6 h de incubación, con reacciones bien definidas. Es probable que un tiempo menor de incubación (p. ej., 4 h) sea suficiente para detectar dichas cepas, como pudimos observar en algunas ocasiones. No obstante, se necesitan más estudios para confirmar esta hipótesis.
Con la excepción ya comentada de la técnica VIDAS, los métodos alternativos demostraron total concordancia con la prueba de referencia. Todos los aislamientos clínicos y la cepa ATCC fueron correctamente clasificados respecto a su capacidad toxigénica. Además, no observamos reacciones cruzadas con los aislamientos clínicos de otras especies del género Clostridium, incluyendo las tres cepas de C. sordelli, una especie en la que se ha descrito una toxina similar.
Un aspecto práctico adicional sería comprobar la utilidad de los métodos alternativos sobre las placas de cultivo primario. En este sentido, merece la pena señalar que tanto los métodos de PCR como el basado en cultivo celular parten de 1-2 colonias, fácilmente disponibles en la placa primaria. El método enzimático VIDAS, por el contrario, necesita la presencia de 7-10 colonias.
En conclusión, todos los métodos estudiados han demostrado su utilidad como técnicas diagnósticas alternativas al método de referencia. El uso de una técnica en particular dependerá de las características individuales de trabajo y de la disponibilidad de instrumentación y reactivos en cada laboratorio. La inesperada tasa de resultados falsos negativos con la técnica de VIDAS contradice su uso hasta que se puedan identificar y corregir aquellos factores técnicos que influyen de manera negativa sobre la detección de la toxina A directamente de las colonias. Las técnicas de PCR son rápidas, pero usan reactivos caros y necesitan instrumentación e infraestructuras especiales. En aquellos laboratorios que dispongan de cultivos celulares, la detección de citotoxina directamente de las colonias crecidas en el medio sólido mejora de manera clara el resultado de la técnica clásica. Desde la finalización de este estudio, éste es el método de rutina actual en nuestro laboratorio.
Agradecimiento
Expresamos nuestro agradecimiento a los Dres. R. Alonso y E. Bouza, del Hospital General Gregorio Marañón (Madrid), y J. Vila, del Hospital Clínic (Barcelona) por proporcionarnos amablemente algunas de las cepas utilizadas en este estudio.
