Objetivo: Evaluamos un método simplificado para el procesamiento de muestras seriadas de esputo consistente en unir tres muestras para procesarlas como una única, y comparamos los resultados con aquellos obtenidos al procesar las tres muestras individualmente (método individual).
Material y métodos: Durante un período de 32 semanas se han estudiado un total de 867 muestras seriadas correspondientes a 289 pacientes con sospecha de padecer tuberculosis. Muestras de 148 pacientes (n = 444) fueron procesadas por el método simplificado y de 141 pacientes (n = 423) por el método individual. Todos los cultivos fueron procesados mediante el sistema ESP Culture System II (Difco Laboratories, EE.UU.).
Resultados: Se aislaron 7 cepas de micobacterias con el método individual y otras tantas con el método simplificado, en ambos casos cuatro cepas pertenecían a la especie M. tuberculosis. Los tiempos medios de detección de las micobacterias fueron de 21,5 y 24 días para los métodos individual y simplificado, respectivamente. Cultivos de 21 pacientes se contaminaron durante el procesamiento (11 con el método simplificado y 10 con el individual), detectándose dichas contaminaciones en un tiempo medio de 8 días para el método simplificado y de 7,5 días para el método individual.
Conclusión: El método simplificado puede ser una alternativa válida en laboratorios que manejan un gran número de muestras con unos recursos limitados, sin que esto afecte al rendimiento diagnóstico.
Objective: We evaluated a simplified method for processing three serial sputum samples as a single sample, and compare the results with those obtained when processing three samples individually.
Material and methods: During a 32-week period, we studied 867 sputum samples from 289 patients with pulmonary tuberculosis suspicious. Samples from 148 patients (n = 444) were processed by simplified method, and samples from 141 patients (n = 423) were processed by individually method. All cultures were processed by ESP Culture System II (Difco Laboratories, USA).
Results: Seven mycobacterium's strains were isolated by individually method. Simplified method detected another seven strains. In both cases, four strains were identified as Mycobacterium tuberculosis. Mean time to detection mycobacteria were 21.5 and 24 days for simplified and individually method, respectively. Cultures from 21 patients were contaminated (11 patients by simplified method and 10 patients by individually method). Mean time to detection contaminated cultures were 8 days and 7.5 days for simplified and individually method, respectively.
Conclusion: Simplified method may be a useful alternative in laboratories that must handle increasing numbers of samples, without decline in diagnostic performance.
Introducción
El diagnóstico de certeza de la tuberculosis requiere el cultivo y la identificación de la micobacteria. En los últimos años, el número de muestras procesadas en los laboratorios de microbiología para la detección de micobacterias ha aumentado considerablemente1. Este incremento ha forzado el diseño de nuevas estrategias con el fin de poder hacer frente a dichas necesidades sin que la calidad de los resultados resulte afectada2.
En nuestro laboratorio, situado en un hospital de 1.200 camas, se atiende a una población de 450.000 habitantes, aproximadamente. Todas las muestras remitidas para el diagnóstico de tuberculosis son procesadas mediante tinción ácido-alcohol resistente y cultivo en medios especiales para micobacterias. El número de estas muestras, fundamentalmente esputos y orinas, recibidas en nuestro laboratorio pasó de 2.500 anuales en 1990 a 6.000 anuales en 1997; esta situación originó problemas, no sólo de personal, sino también de espacio y material.
En el presente trabajo evaluamos la utilización de un método simplificado para el procesamiento de muestras seriadas de esputo, en pacientes con tinción directa ácido-alcohol resistente negativa, y comparamos los resultados con aquellos obtenidos con el método individual.
Material y métodos
Durante 32 semanas se han procesado un total de 867 muestras de esputo seriadas (tres por paciente) procedentes de 289 enfermos no hospitalizados con sospecha clínica de tuberculosis pulmonar. Como criterio de inclusión para nuestro estudio, la baciloscopia realizada sobre la primera de las tres muestras enviadas debía ser negativa. Las muestras fueron refrigeradas hasta un máximo de 48 h con el fin de procesar de manera conjunta las tres muestras seriadas. Aproximadamente la mitad de las muestras fueron procesadas por cada método (444 muestras por el método simplificado y 423 muestras por el método individual). Con el fin de homogeneizar los dos grupos de población estudiada se alternaron semanalmente los dos métodos de trabajo.
Método individual: cada una de las tres muestras seriadas fue procesada de manera independiente. Las muestras de esputos se descontaminaron por el método N-acetiI-L-cisteína-NaOH-citrato3. Cada esputo fue transferido a un tubo de centrífuga de 50 ml y mezclado con igual volumen de N-acetil-L-cisteína-NaOH (3%). Esta mezcla se agitó vigorosamente durante unos segundos con el fin de homogeneizarla, y tras 20 min el tubo se completó hasta los 50 ml con tampón fosfato. Posteriormente se procedió a centrifugar a 3.000 g durante 30 min.
Método simplificado: como paso previo los esputos fueron licuados con 1 ml de N-acetil-L-cisteína; después, las tres muestras seriadas fueron transferidas a un tubo único de 50 ml para procesarlas como si se tratara de una sola muestra, es decir, preparando una sola tinción y un solo cultivo. La descontaminación se hizo con el mismo método descrito anteriormente.
Después de centrifugar la muestra descontaminada, se inoculó 1 ml del sedimento en un vial ESP (Difco Laboratories, EE.UU.) previamente suplementado con 0,5 ml de mezcla antibiótica PVNA (polimixina-vancomicina-ácido nalidíxico-anfotericina) y 1 ml de suplemento de crecimiento como indican las instrucciones del fabricante. A partir del sedimento también se realizó una extensión para tinción de auramina. Los viales ESP fueron introducidos para su monitorización en el aparato ESP DifcoII durante un período de 6 semanas. Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium avium complex fueron identificados mediante sondas de ADN Accuprobe (bioMérieux, Francia). Se identificaron otras micobacterias mediante pruebas bioquímicas o cromatografía gas-líquido.
Resultados
Durante el período estudiado se utilizó el método simplificado, con 444 muestras que originaron 148 cultivos. Las baciloscopias después de descontaminar y concentrar las muestras fueron negativas. Se aislaron 7 cepas de micobacterias: M. tuberculosis (n = 4), M. fortuitum (n = 1), M. smegmatis (n = 1) y M. gordonae (n = 1). La tasa de aislamiento de micobacterias en este grupo de pacientes fue del 4,7%. El tiempo medio de detección de micobacterias fue 21,5 días (rango 11,3-31,7 días). Se contaminaron los cultivos de 11 pacientes, los cuales se detectaron en un tiempo medio de 8 días (rango 2-15 días) (tabla 1).
El método individual fue utilizado en un total de 141 pacientes (423 muestras). Las baciloscopias realizadas tras la descontaminación y concentración de las muestras fueron negativas, excepto en tres muestras de 2 pacientes, en las que se detectó la presencia de escasos bacilos ácido-alcohol resistentes; a pesar de ello, debido a que la baciloscopia de la primera muestra de cada paciente había sido negativa, estas muestras fueron incluidas en el estudio. Se aislaron un total de 7 micobacterias: M. tuberculosis (n = 4), M. xenopi (n = 1), M. avium complex (n = 1) y Mycobacterium spp. (n = 1). M. tuberculosis se aisló de las tres muestras seriadas de un paciente, de dos muestras en otro paciente y de sólo una muestra en los otros dos casos. M. xenopi y M. avium complex se aislaron en las tres muestras seriadas de los respectivos pacientes. La cepa restante (Mycobacterium spp.) se aisló de una sola muestra del paciente. La tasa de aislamiento de micobacterias en este grupo de pacientes fue del 4,9% y se detectaron en un tiempo medio de 24 días (rango 9,2-40 días). Dieciséis cultivos procedentes de 10 pacientes se contaminaron en un tiempo medio de 7,5 días (rango 1-24 días) (tabla 1).
No se detectaron diferencias significativas, mediante el test de la * 2, al comparar el número de aislamientos y contaminaciones entre los dos métodos estudiados.
Discusión
En los últimos años, la carga de trabajo en los laboratorios de micobacterias se ha incrementado considerablemente debido al incremento de la tuberculosis4 y de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Algunos autores han sugerido que una desproporcionada sospecha clínica de tuberculosis en población no infectada por el VIH también ha contribuido a este aumento1. En este contexto, las necesidades de recursos, personal, espacio, material, etc., han aumentado notablemente en los laboratorios de microbiología. Con el fin de solucionar este problema, algunos laboratorios han modificado protocolos de trabajo, por ejemplo, sembrando menos muestras por paciente o adoptando un sistema de selección previo al procesamiento de éstas2. Debido a que la selección previa era difícil de incorporar a la rutina de nuestro laboratorio, y que nuestro objetivo era poder procesar todas las muestras remitidas con sospecha de tuberculosis o micobacteriosis, diseñamos un protocolo que nos permitiera realizar este procesamiento. El protocolo propuesto permite esto último, a la vez que necesita menos recursos (espacio, material y personal), sin que esto afecte al rendimiento diagnóstico.
Debido al retraso en el procesamiento de las muestras por el método simplificado y para evitar un excesivo número de cultivos contaminados, la concentración final de NaOH que se utilizó fue del 1,5%, intermedia entre la aconsejada por el método hidróxido sódico y el método cisteína-citrato-hidróxido sódico3.
El objetivo principal de un laboratorio de micobacterias debe ser el rápido diagnóstico de la tuberculosis, por lo que es fundamental realizar una tinción de la muestra e informar sobre su resultado en las primeras 24 h. Éste fue el motivo por el que sólo nos propusimos estudiar muestras con baciloscopia negativa; además, en aquellas con baciloscopia positiva no sería necesario procesar tres muestras4. La detección de bacilos ácido-alcohol resistentes en muestras de 2 pacientes incluidos en el estudio por no observarse micobacterias en la primera muestra es explicable por el procesamiento de la muestra previo a la segunda tinción, es decir la homogenización-descontaminación seguida de una concentración por centrifugación. El método simplificado tendría el inconveniente de disminuir la probabilidad de detectar las micobacterias mediante baciloscopia, ya que se haría sólo una extensión para tinción, disminuyendo el volumen de muestra examinado al microscopio, aunque esto podría solucionarse, bien preparando una tinción con mayor volumen de muestra, como describe Casal5, o aumentando la superficie de la extensión. En un principio, el protocolo propuesto podría adaptarse al procesamiento de muestras de orina previamente concentradas, es decir, uniendo los sedimentos urinarios para el procesamiento de descontaminación y siembra.
La utilización del protocolo simplificado podría permitir a laboratorios como el nuestro, donde se ha multiplicado por cinco el número de muestras remitidas en la última década, procesar todas las muestras sin un desproporcionado incremento en personal y equipos.
Aunque la práctica estándar en el diagnóstico de la tuberculosis es procesar tres muestras de días consecutivos para la tinción ácido-alcohol resistente y cultivo6,7 y la mezcla de muestras se desaconsejaba, estas recomendaciones datan de una época en la que la utilización de tinciones fluorescentes (más sensibles) y el cultivo en medio líquido para el aislamiento de micobacterias (más rápido y sensible, y con menor tasa de contaminaciones)8-10 eran una práctica poco habitual, incluso no existían los sistemas automatizados de los que hoy disponemos. Nuestros resultados sugieren que el método simplificado podría sustituir al procesamiento de las tres muestras sin que se afectase el rendimiento diagnóstico. Sin embargo, cada laboratorio debería valorar las ventajas y desventajas del protocolo simplificado atendiendo a las características del centro donde esté ubicado y de la población asistida.
