Se investigó la asociación de los determinantes de resistencia a antibióticos MLSB (macrólidos, lincosamidas, estreptogramina B)-erm(B) y mef(A)) con los determinantes tet(M) (resistencia a tetraciclina y minociclina), catpC194 (resistencia a cloranfenicol), aph3´-III (resistencia a kanamicina y aminoglucósidos relacionados) con el fin de estudiar como se seleccionan las resistencias en Streptococcus pneumoniae. Los genes tet(M) y catpC194 se encuentran asociados al gen de resistencia erm(B), mientras que el gen aph3´-III estaba presente en bajo porcentaje. El transposón Tn1545 es el vector responsable de la diseminación de estos genes de resistencia. Por el contrario, el gen mef(A) no está relacionado con los determinantes tet(M), catpC194 y aph3´-III y parece que se transfiere mediante un transposón conjugativo diferente a Tn1545.
La coexistencia de diferentes genes de resistencia en el mismo transposón conjugativo es de gran importancia desde el punto de vista de la salud pública, puesto que el tratamiento antibiótico, con cualquiera de los antibióticos a los que confiere resistencia el transposón, podría seleccionar cepas multirresistentes.
Introducción
De los cuatro mecanismos que pueden intervenir en la transferencia de genes en estreptococos: transformación, conjugación mediada por transposones y/o plásmidos y transducción, la transformación es fundamental en la adquisición de resistencia a los betalactámicos. De los tres restantes, la transducción no parece eficaz en S.pneumoniae (aunque sí lo es en estreptococos de los grupos A, C y G), ni tampoco la conjugación plasmídica1.
En Streptococcus pneumoniae los determinantes de resistencia a antibióticos, como los que codifican resistencia a eritromicina, están localizados en transposones que se insertan en el cromosoma del huésped. Algunos transposones parece que desempeñan un papel importante en la diseminación de la resistencia entre especies de importancia clínica. El gen erm(B) se ha demostrado que reside en el Tn1545, un transposón conjugativo de 25,3 kb que confiere resistencia además a tetraciclina tet(M) y kanamicina (aph3´-III)2. Poyart-Salmeron et al han demostrado que se requiere la expresión de una proteína codificada por el transposón, llamada Int-Tn, para los movimientos (transposición y conjugación) del Tn1545 y elementos relacionados3.
Recientemente, LeBlanc et al han demostrado que algunas cepas de S. pneumoniae contenían secuencias similares a Tn917-like por hibridación ADN-ADN4. Tn917 es un elemento que confiere resistencia a eritromicina erm(B) pero no confiere resistencia a tetraciclina ni a kanamicina5. Este transposón está ampliamente distribuido en enterococos de origen humano y animal. McDougal et al realizaron un estudio para demostrar si Tn917 está presente en cepas de S. pneumoniae resistentes a eritromicina. En las tres cepas estudiadas, encuentran que el Tn917 está inserto en Tn916, llamando al transposón compuesto Tn3872. Si la integración del Tn917 en Tn916 ocurre directamente en S. pneumoniae u ocurre primero en Enterococcus faecalis y se transfiere más tarde a S.pneumoniae no está claro todavía6.
Con el fin de conocer cómo se seleccionan las resistencias en las cepas estudiadas se investigó la asociación de los determinantes de resistencia a antibióticos MLS (macrólidos, lincosamidas, estreptogramina) erm(B), mef(A) con los determinantes tet(M) (resistencia a tetraciclina y minociclina), catpC194 (resistencia a cloranfenicol) y aph3´-III (resistencia a kanamicina). También se investigó la presencia de transposones conjugativos de la familia Tn1545-Tn916 mediante hibridación en gota con la sonda intTn para averiguar cuáles eran los vectores implicados en la transferencia de estos determinantes de resistencia.
Parte de este trabajo ha sido presentado al IX Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (Santiago de Compostela, 21-24 mayo de 2000).
Material y métodos
Se han aislado 747 cepas de S. pneumoniae pertenecientes a 556 pacientes en nuestro hospital durante los años 1997-1999. Se seleccionaron 140 cepas de S. pneumoniae (100 resistentes a eritromicina [concentración mínima inhibitoria-CMI>0,250 µg/ml] y 40 sensibles a eritromicina) procedentes de muestras respiratorias y hemocultivos. La identificación de las cepas se realizó por la morfología de la colonia en Mueller Hinton sangre, sensibilidad a optoquina y solubilidad en bilis al 10% (desoxicolato sódico). Se enviaron al Laboratorio de Referencia de Neumococos (Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid) para su confirmación.
Sensibilidad a macrólidos, clindamicina y estreptograminas
Se determinó la sensibilidad mediante el método de difusión en agar con disco, a los siguientes macrólidos: eritromicina 15 µg (Difco), azitromicina 15 µg (Difco), clindamicina 2 µg (Difco), espiramicina 100 µg (Sanofi Diagnostic Pasteur), josamicina 100 µg (Sanofi Diagnostic Pasteur), miocamicina 60 µg (Neo-Sensitab), virginiamicina 100 µg (Sanofi Diagnostic Pasteur). Se estudió la sensibilidad a tetraciclina y minociclina, a cloranfenicol y a kanamicina con discos de 30 µg (Difco). También se estudió la posible existencia de cepas con alta resistencia a aminoglucósidos utilizando discos que se prepararon con papel Whatman nº 2 con las siguientes cargas: 1.000 µg de estreptomicina y 500 µg de gentamicina, tobramicina, kanamicina, amikacina, lividomicina, butirosina y neomicina. S. pneumoniae ATCC 49619, sensible a todos los antibióticos del grupo MLS, fue incluido en el estudio de sensibilidad.
Extracción de ADN e hibridación en gota
Se realizó hibridación en gota (dot blot) siguiendo el método de extracción de ADN descrito por Thakker Varia7. La obtención de las sondas se realizó a partir de los plásmidos derivados del pUC18 en el que se había clonado un fragmento de los diferentes genes (tabla 1). Las sondas utilizadas erm(A), erm(B), mef(A) y mrs(A) fueron obtenidas de los productos de reacción en cadena de la polimerada (PCR) de tamaños esperados: erm(B) de 640 pb, erm(A) de 530 pb, msr(A) de 400 pb y mef(A) de 348 pb8-10. Los productos de PCR fueron purificados después de electroforesis en geles de agarosa al 1%. Los fragmentos de agarosa conteniendo el ADN apropiado se disuelven y el ADN se une a una matriz utilizando un agente caotrópico (GFxTM PCR DNA and Gel Band purification Kit, Amersham Pharmacia Biotech).
La sondas tet(M), aph3´-III, catpC194 e intTn fueron cedidas amablemente por el doctor P. Courvalin (Instituto Pasteur, París). La sonda tet(M) se obtuvo como un fragmento ClaI-HindIII de 850 pb del transposón Tn1545, aph3´-III como un fragmento HpaII de 530 pb del plásmido enterocócico pJHI, catpC194 como un fragmento ClaI de 1.160 pb del plásmido estafilocócico pC194 e intTn como un fragmento TaqI del Tn1545 de 830 pb3. En el momento de la hibridación, se cogió una alícuota de 7 µl de la extracción de ADN de cada cepa y se llevó a una membrana de nitrocelulosa (Screen plus paper, New England Nuclear) dividida anteriormente en cuadrículas y se dejó secar a temperatura ambiente. Sobre el filtro se colocó un papel Whatman 3MM del mismo tamaño que el filtro, previamente saturado con NaOH 0,5 M y se dejó 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar el ADN. Se retiró y se colocó otro papel Whatman 3MM empapado con Tris 1M pH 7, dejándolo 5 minutos a temperatura ambiente para neutralizar. El filtro se introdujo en 500 ml de Tris 1 M pH 7 durante 3 minutos y se dejó secar el aire, se envolvió el filtro con film transparente y se expuso 5 minutos a luz ultravioleta (340 nm) en el transiluminador TS-40 para fijar el ADN a la nitrocelulosa. Los filtros se guardaron a 4ºC hasta su utilización.
Las sondas fueron marcadas con *-dCTP-32P, según las recomendaciones del fabricante. El fragmento de ADN que se utiliza como sonda se marca por la técnica de marcaje de oligonucleótidos aleatorios (Amersham, Megaprime DNA labelling system RPN 1606)11. Se realizó la hibridación a 60ºC durante toda la noche en el horno de hibridación (Hybridaser HB-1D, Techne). Las membranas fueron lavadas dos veces 20 minutos con 2 x SSC, dos veces con 1 x SSC (3M NaCl, 300 mM sodium citrate pH7) y dos veces con 0,7 x SSC. Los filtros fueron envueltos en plástico y sobre ellos se puso una película de autorradiografía (Hyperfilm-ECL RPN2103, Amersham) exponiéndolos en una pantalla reflectante al menos durante 24 horas a -70ºC. Para el revelado se utilizaron productos de la casa Kodak.
Resultados
Resistencia a antibióticos MLSB
De las 140 cepas de S. pneumoniae estudiadas, 100 eran resistentes a eritromicina. Entre las cepas resistentes a eritromicina, 83% presentaron fenotipo cMLSB y todas tenían el gen erm(B). Las 17 cepas restantes tenían fenotipo M y tenían el gen mef(A).
Determinante tet(M): resistencia a tetraciclina y minociclina
De las 140 cepas de S. pneumoniae estudiados, 92 (65,7%) eran resistentes a tetraciclina y minociclina y tenían el gen tet(M). De las 100 cepas resistentes a eritromicina, el 82% tenían el gen tet(M). El tet(M) estaba presente en el 92% de los S. pneumoniae erm(B) y en el 29,4% de los mef(A) (figs. 1-4).
Determinante catpC194: resistencia a cloranfenicol
De las 140 cepas de S. pneumoniae, 51 (36,4%) eran resistentes a cloranfenicol y contenían el gen catpC194. Entre los neumococos resistentes y sensibles a eritromicina, encontramos el determinante catpC194 en el 44% y 17,5% de las cepas, respectivamente. El 50,6% de los S. pneumoniae erm(B) tenían asociado el determinante catpC194 y solamente el 11,8% de los mef(A) llevaban el determinante catpC194 (figs. 1-4).
Determinante aph3´-III: resistencia a kanamicina
El 2,8% de los neumococos eran resistentes a kanamicina y tenían el determinante aph3´-III. Las cuatro cepas con el determinante aph3´-III eran resistentes a eritromicina (4% de las cepas resistentes) y contenían el gen erm(B). No encontramos ninguna cepa con el determinante aph3´-III entre los neumococos mef(A) ni entre los neumococos sensibles (figs. 1-4).
Las cuatro cepas de S. pneumoniae con el gen aph3´-III tenían resistencia de alto nivel a lividomicina, neomicina, butirosina y kanamicina. Una cepa era resistente a estreptomicina 1.000 µg/ml.
Presencia de transposones conjugativos de la familia Tn1545
De los 100 S. pneumoniae resistentes a eritromicina, el 77% de las cepas hibridaba con el gen intTn y de los 40 neumococos sensibles, el 22,5% hibridaba con la sonda intTn.
El 86,7% de las cepas de neumococos erm(B) tenían el gen intTn, es decir, un transposón de la familia Tn1545-Tn916. De las 17 cepas de S. pneumoniae mef(A) sólo tenían el gen intTn cinco cepas que contenían además del gen mef(A), el gen tet(M). Las 12 cepas que tenían solamente el gen mef(A) no tenían el determinante intTn.
Transposones conjugativos de la familia Tn1545-Tn916 en S. pneumoniae resistentes a eritromicina con los determinantes tet(M), catpC194 y aph3´-III
De las 77 cepas de S. pneumoniae erm(B) con el determinante tet(M), sólo 9 cepas no contenían el gen intTn. De éstas, 6 poseían los determinantes erm(B) y tet(M), pertenecían al serogrupo 15 y eran un mismo clono (datos no publicados). De las 42 cepas de S. pneumoniae erm(B) que tenían el determinante catpC194, 41 tenían el gen intTn. La cepa restante tenía los determinantes erm(B), tet(M) y catpC194.
De S. pneumoniae mef(A), 5 contenían el gen tet(M) y 2 de ellas el gen catpC194. Las 5 tenían el gen intTn (figs.1-4).
Discusión
Los transposones conjugativos cromosómicos son elementos movibles que poseen la maquinaria genética necesaria para facilitar su propia transferencia entre células bacterianas12. Son segmentos de ADN, entre 18 y 150 kpb, se hallan generalmente integrados en el genoma bacteriano y se caracterizan por su capacidad de moverse intercelularmente (de una bacteria a otra) por un procedimiento que requiere contacto de las células donadoras y receptoras. Se encuentran en un gran número de microorganismos grampositivos siendo ubicuos en Enterococcus spp. y Streptococcus spp.13.
El mecanismo clave de transferencia de genes de resistencia a eritromicina en S. pneumoniae es la transposición conjugativa de los determinantes genéticos que codifican para tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina y kanamicina, que están localizados en el cromosoma del huésped. Estos determinantes se pueden transferir aisladamente o en diversas conbinaciones. Por el contrario, no se cotransfieren ni se transmiten de la misma manera la resistencia a penicilina y a cotrimoxazol1.
En S. pneumoniae, Poyart-Salmeron et al describieron un elemento, llamado Tn1545, que con un tamaño de 25,3 kb, contenía los determinantes tet(M), erm(B), y un determinante de resistencia para kanamicina (aph3´-III)3. Los transposones Tn1545 y Tn916 han sido estudiados en detalle y, recientemente, el Tn916 ha sido secuenciado14. Se consideran parte de una familia de transposones de más de diez miembros, entre los cuales figuran: Tn918, Tn920, Tn925 y Tn3702 en E. faecalis; Tn5031, Tn5032 y Tn5033 en E. faecium; Tn919 en S. sanguis; y Tn5251 en S. pneumoniae. Todos estos transposones están relacionados estructural y funcionalmente. Muchos de ellos confieren solamente resistencia a tetraciclina y a su análogo lipofílico minociclina (gen tet(M), mientras que otros, como Tn1545, llevan más de un determinante de resistencia.
Resistencia a tetraciclina y minociclina (tet(M)
La resistencia a tetraciclina en estreptococos es el resultado de la adquisición de uno de estos dos determinantes de resistencia: tet(M) o tet(O). Estos genes codifican proteínas que protegen el ribosoma y tienen homología con los factores de elongación G y Tu. El gen tet(M) se transfiere mediante transposones conjugativos (Tn916, Tn1545, Tn5151, Tn3872). Todavía no se sabe si tet(O) se transporta en transposones, en plásmidos o si está albergado en el cromosoma de los neumococos15.
Hemos encontrado que el gen tet(M), que codifica resistencia a tetraciclina y minociclina, está relacionado con la resistencia a eritromicina en las cepas de estreptococos que contiene el gen erm(B), mientras que no está relacionado con la resistencia a eritromicina en los estreptococos que contienen el gen mef(A).
Resistencia a cloranfenicol (catpC194)
La resistencia a cloranfenicol es debida a la síntesis de acetiltransferasas (CAT) que inactivan el antibiótico convirtiéndolo en 3- acetil y 1,3- diacetil. Hasta la fecha se han descrito trece genes cat en grampositivos. Se diferencian siete clases de determinantes cat mediante hibridación ADN-ADN: cat-86; catpC194; catpIP501, catpC221, catpUB112, catpSCS1 y catpSCS6; catpC223, catpSCS5 y catpSCS7; catD y catP; catQ; y catB.
En S. pneumoniae sólo se ha encontrado el gen catpC194, que se localiza en el cromosoma16. La resistencia a cloranfenicol la encontramos asociada a la resistencia a eritromicina especialmente entre las cepas que presentaban fenotipo cMLSB y tenían el gen erm(B).
Resistencia a kanamicina (aph3´-III)
La resistencia a aminoglucósidos en cocos grampositivos es debida a la síntesis de las siguientes enzimas: APH3´-III (aminoglycoside-3´-O-phosphoryltransferase), APH(2´´)-ACC(6´) (aminoglycoside-6´-N-acetyltransferase-2´´-O-phosphoryltransferase) y ANT(6) (aminoglycoside-nucleotidyltransferase), que inactivan el antibiótico17. En S. pneumoniae, encontramos cuatro cepas resistentes a eritromicina con el gen erm(B) que contenían también el gen aph3´-III. En EE.UU, aislados clínicos pertenecientes a los clones 23F (Spanish clone) y 6B (Spain/Iceland clone) parece que también han perdido el gen aph3´-III18.
Presencia de transposones Tn15457Tn916
Utilizando sondas intragénicas específicas del gen intTn, gen que codifica para la integrasa de Tn1545 y Tn9163, requerida para los movimientos de transposición y conjugación, estudiamos la presencia de transposones conjugativos de la familia Tn1545-Tn916 en nuestras cepas. Hibridaron con la sonda del gen intTn el 86,7% de los neumococos resistentes a eritromicina que poseían el gen erm(B) (77 cepas) y el 29,4% de las cepas resistentes a eritromicina con el gen mef(A) (5 cepas). Estas últimas cepas tenían además del gen mef(A), el gen de resistencia a tetraciclina tet(M), lo que explica la hibridación positiva con la sonda intTn. Existe una clara asociación entre la resistencia a eritromicina en las cepas con fenotipo cMLSB gen erm(B) y la presencia del transposón conjugativo Tn1545, confirmando que el gen erm(B) reside en la mayoría de los casos en dicho transposón conjugativo.
Recientemente, LeBlanc et al han demostrado como algunas cepas de S. pneumoniae contenían secuencias Tn917 -like por hibridación ADN-ADN. Tn917 es un elemento que confiere resistencia a eritromicina erm(B) pero no confiere resistencia a tetraciclina tet(M) ni a kanamicina (aph3´-III)4. Sólo encontramos una cepa con el gen erm(B) sin ningún otro determinante de resistencia asociado y con hibridación negativa para el gen intTn. Esta cepa, perteneciente al ST 6B, podría tener el transposón Tn917.
Mc Dougal et al realizaron un estudio para demostrar si Tn917 estaba presente en cepas de S. pneumoniae resistentes a eritromicina6. De las 12 cepas estudiadas por este grupo con los determinantes erm(B) o erm(B)+ tet(M), encuentran que 9 tenían secuencias similares a Tn917, mientras que en las 3 restantes, el transposón conjugativo Tn917 estaba inserto en Tn916, llamando al transposón compuesto Tn3872. Si la integración del Tn917 en Tn916 ocurre directamente en S. pneumoniae u ocurre primero en E. faecalis y se transfiere más tarde a S. pneumoniae no está claro todavía. Hasta la fecha no se ha descrito la presencia de más cepas con este transposón compuesto Tn3872.
Entre nuestras cepas, 35 neumococos (42,2%) tenían los genes erm(B) y tet(M), siendo 27 positivas y 8 negativas para el gen intTn. Las primeras 27 cepas podrían tener el transposón conjugativo Tn1545 o el transposón compuesto Tn3872. Dada la baja frecuencia de cepas con Tn3872 pensamos que nuestros aislados previsiblemente contendrán el Tn1545, mucho más frecuente. Las 8 cepas restantes que contenían los determinantes de resistencia erm(B) y tet(M) pero no hibridaban con el gen intTn podemos afirmar que no contienen el transposón Tn1545. Tampoco tienen el transposón Tn917 porque este transposón sólo contiene el determinante de resistencia erm(B). Cuando McDougal et al estudiaron el transposón compuesto Tn3872 no pudieron transferirlo a S. pneumoniae y E. faecalis por conjugación6. Plantearon la hipótesis que el transposón Tn917 a la hora de insertarse en el orf9 de Tn916 pudo sufrir una deleción y como consecuencia haber perdido la movilidad. Esta deleción afectaría al gen intTn (responsable de los movimientos de transposición y conjugación) resultando negativas las hibridaciones con el intTn. Si fuera éste el caso, estas 8 cepas podrían tener un transposón compuesto. Si estas cepas tuvieran el transposón conjugativo compuesto Tn3872 pero hubieran perdido por una deleción el gen intTn, este transposón no podría moverse intercelularmente (de una bacteria a otra) y la única forma de difundir sería por diseminación clonal. Realizamos tipaje molecular mediante la técnica de campo pulsante a estas cepas para comprobar si se trataba de un clono que se hubiera diseminado, encontrando que las 8 cepas pertenecían al mismo clono (datos no publicados).
De las 17 cepas resistentes a eritromicina con el gen mef(A), 5 (41,6%) hibridaban con la sonda intTn. Estas 5 cepas tenían los determinantes tet(M) y/o catpC194, lo que significa que podrían tener el transposón conjugativo Tn916 o Tn5253. Las 12 cepas restantes sólo tenían el determinante de resistencia mef(A) y no hibridaban con el gen intTn.
El gen mef(A) se asocia con elementos conjugativos localizados en el cromosoma y que se transfieren entre géneros y especies por conjugación19. No se ha descrito todavía ningún transposón conjugativo que pudiera ser responsable de la transferencia del gen mef(A) entre neumococos e incluso entre diferentes géneros de grampositivos como corinebacterias, enterococos, micrococos y diferentes especies de estreptococos20.
La coexistencia de diferentes genes de resistencia en el mismo transposón conjugativo como sucede en S. pneumoniae es de gran importancia desde el punto de vista de la salud pública, puesto que el tratamiento antibiótico, con cualquiera de los antibióticos a los que confiere resistencia el transposón, podría seleccionar cepas multirresistentes.
Agradecimientos
Las sondas tet(M), aph3´-III, catpC194e intTn fueron amablemente cedidas por el Dr. Patrice Courvalin del Instituto Pasteur de París. Este trabajo ha sido realizado mediante una beca del Fondo de Investigación Sanitaria (FIS 98/0733), una beca del Gobierno de Aragón (REF P49/97) y una beca SEIMC-Bayer (personal a Cristina Seral).
