Fundamento. Evaluar de forma prospectiva la eficacia del método de extracción con dextrano salino en la prueba de la antigenemia pp65 (Ag-pp65) frente al citomegalovirus humano (CMV).
Material y métodos. Durante un período de dos meses se han analizado las muestras de sangre procedentes de pacientes inmunodeprimidos. La extracción de los leucocitos polimorfonucleares (LPMN) se realiza con una solución de dextrano al 6% en cloruro de sodio al 0,9%. Se realizó el recuento total de leucocitos obtenidos y el porcentaje correspondiente a los LPMN. Simultáneamente se realizó el cultivo de los LPMN extraidos por el método de shell vial (CSV) en la línea MRC-5.
Resultados. Las 144 muestras de sangre analizadas se han dividido en tres grupos según la positividad en la prueba de la Ag-pp65 y/o el CSV. Los pacientes con ambas pruebas positivas presentaron el menor recuento global de leucocitos y de LPMN, mostrando significación estadística con el grupo de Ag-pp65 negativa. No se han observado diferencias en el recuento global de los grupos con Ag-pp65 negativa. El porcentaje global de LPMN obtenidos fue del 87%. El valor medio de las muestras Ag-pp65 positivas fue de 48/100.000. LPMN, que sería de 51/100.000 LPMN si se corrigiera en función del porcentaje real de LPMN (p>0,05).
Conclusiones. El método de extracción leucocitario con dextrano salino ha mostrado un elevado rendimiento en la mayoría de las muestras analizadas. El estado inmunológico del paciente y la presencia de infección y/o enfermedad por CMV determinan el grado de rendimiento de este método. En general no es necesario ajustar el valor de la Ag-pp65 en función del porcentaje real de LPMN obtenidos.
Background. To prospectively evaluate the efficacy of the saline dextran extraction method in the human cytomegalovirus (CMV) pp65 antigenemia assay (Ag-pp65).
Material and methods. In a 2 months period we studied all the blood samples from immunodepressed patients. The extraction of leukocytes polymorphonuclear (LPMN) was obtained with a 6% dextran solution in 0.9% saline. The total leukocytes population was counted and the percetage of LPMN obtained was established. Simultaneously the LPMN were cultivated into the MRC-5 cell line by the shell vial method (SVC).
Results. The 144 blood samples studied were divided in three groups depending of the positivity in the pp65-AG and/or in the SVC. The patients with both assays positive presented the lower overall leukocyte and LPMN counting, with a difference statistically significance with the pp65-Ag negative. No statistically difference was observed in the overall count of leukocytes in the pp65-Ag negative group. The overall percentage of LPMN obtained was 87%. The median value of pp65-Ag positive samples was 48/100,000 LPMN, this value would be 51/100,000 LPMN with the application of the real percentage of LPMN obtained (p>0.05).
Conclusions. The saline dextran extraction method presentd a high efficacy in the majority of blood samples studied. The immunological status and the presence of a CMV infection or disease in the patient were the principal factors that influence the extraction method. In general there is no need to adjust the pp65-Ag value obtained with this method to the real one.
Citomegalovirus (CMV) constituye en la actualidad el principal virus causante de infecciones víricas en los pacientes inmunodeprimidos (transplantados e infectdos por el virus de inmunodeficiencia humana [VIH]). La elevada morbimortalidad asociada a este tipo de enfermedad, mucho más importante si es una primoinfección, obliga a realizar un seguimiento estricto y controlado de esta infección en este grupo de pacientes1,2.
De las diferentes técnicas existentes en la actualidad, la antigenemia pp65 (Ag-pp65) o detección de este antígeno en el núcleo de los leucocitos polimorfonucleares (LPMN) y el cultivo shellvial (CSV) parecen ser las que presentan una mayor correlación y valor predictivo positivo en el desarrollo posterior de enfermedad por CMV3,4.
Para la realización de la prueba de la Ag-pp65 es preciso, primeramente, realizar el fraccionamiento de la sangre periférica y extraer la población correspondiente a los LPMN, sobre la que se realiza posteriormente la detección antigénica5,6.
De los diferentes métodos de extracción o fraccionamiento sanguíneo analizados, parece que el empleo de una solución al 6% de dextrano salino es el que determina un mayor y mejor rendimiento en este proceso de extracción, estando además al alcance de cualquier laboratorio5-7. El empleo de este método no siempre consigue la extracción del 100% de los LPMN, ya que depende básicamente tanto de la propia técnica (experiencia, eficacia, pulcritud) como del estado inmunológico del paciente (ineficaz en los neutropénicos o con déficits de inmunidad celular)7,8.
El objeto de este estudio prospectivo es conocer el rendimiento real de este método de extracción leucocitario en la sangre de pacientes en diferentes situaciones clínicas.
Material y métodos
Durante un período de dos meses se han estudiado de forma prospectiva las muestras de sangre remitidas para la prueba de la Ag-pp65 y viremia procedentes de pacientes infectados por el VIH y los receptores de trasplante renal y médula ósea.
Cada muestra de sangre periférica recogida en un tubo con EDTA (3-5 ml) se mezcló con 1 ml de una solución dextrano salino al 6% (Dextranorm Salino Braun) y se dejó sedimentar a 36°C en la estufa durante 30-45 minutos. Posteriormente se recogió 1 ml de la parte superior del tubo con una pipeta estéril y se pasó a un tubo estéril. Se añadieron 4 ml de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,2) y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 15 minutos. Se resuspendió el sedimento en 4 ml de PBS y se añadió 1 ml de cloruro de amonio que se dejó actuar durante 2 a 3 minutos. Tras este proceso se decantó y resuspendió el sedimento en 2 ml de PBS que se centrifugaron a 1.500 rpm durante 15 minutos. Finalmente el sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS.
El recuento leucocitario se realizó en un autoanalizador Sysmex K-4500 (Boehringer Mannheim, Alemania), ajustándose posteriormente la concentración final para la adición a un porta de 200.000 LPMN. El volumen adecuado se centrifugó en una citocentrifuga (Cytospin 3; Shandon Scientific, Inglaterra) a 700 rpm durante 10 minutos.
Los portas, tras su fijación con formaldehído-sacarosa, se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-pp65 (Monofluokit CMV, Pateur Diagnostics) mediante una técnica de inmunofluorescencia indirecta. Los portas fueron observados al microscopio de fluorescencia a 400x. Los valores de antigenemia se han expresado en el número de LPMN positivos (con fluorescencia/100.000 LPMN) observados.
La misma muestra de sangre utilizada para la Ag-pp65 fue también empleada para el cultivo vírico (viremia), mediante el método de CSV, a partir de los LPMN extraidos previamente siguiendo la técnica ya descrita con anterioridad3,4.
Resultados y discusión
Durante el período de estudio se han analizado 144 muestras de sangre. Las muestras se han dividido en tres grupos dependiendo de su positividad en la prueba de la Ag-pp65 y de la viremia (CSV) (tabla 1).
En los pacientes con antigenemia y CSV positivos se ha obtenido el menor recuento de LPMN tras la extracción, observándose diferencia significativa con el grupo de pacientes con antigenemia negativa (p<0,05). No se ha observado diferencia en el rendimiento global del proceso de extracción entre las muestras que eran antigenemia negativa fueran o no CSV-positivas. En los tres grupos de muestras se ha observado un rango muy amplio de extracción leucocitaria total que ha oscilado entre 800.000 y 6.100.000 de LPMN.
Al analizar la composición porcentual del proceso de extracción se observa cómo ha variado dependiendo del tipo de muestra. El menor porcentaje de LPMN correspondía a las muestras con antigenemia y CSV-positivo, siendo además el que ha mostrado un rango mucho más amplio (46%-100%). A pesar de ello no se observan diferencias significativas con los porcentajes obtenidos en las muestras con antigenemia y CSV-negativo (p>0,05) y con ambas negativas (p=0,052).
En las muestras con antigenemia positiva, el valor medio de positividad fue de 48 LPMN/100.000 LPMN y su valor corregido al ajustarlo, si el rendimiento del proceso de extracción fuera del 100% en vez del realmente obtenido, hubiera sido de 51 LPMN/100.000 LPMN, no observándose diferencias significativas (p>0,05).
El empleo de una solución de dextrano al 6% en cloruro sódico al 0,9% (dextrano salino) es el método más ampliamente utilizado en el proceso de extracción leucocitaria en la prueba de la Ag-pp655,7,8. Es un método sencillo, barato y al alcance de la mayoría de laboratorios. Sin embargo, como la mayoría de los sistemas de extracción o separación celular utilizados en sangre periférica, no siempre obtiene un rendimiento del 100%. Los principales motivos para ello son el propio polímero, que no es exclusivamente selectivo en el proceso de separación de los LPMN y, especialmente, las características de la propia sangre del paciente y la minuciosidad del que realiza la metodología7,9.
En este estudio hemos analizado el rendimiento real del dextrano salino en la extracción de LPMN de sangre periférica en tres tipos de pacientes. En primer lugar un grupo de pacientes con sintomatología de enfermedad por CMV y que correspondían a las muestras Ag y CSV-positivas. Es este grupo en el que se ha mostrado un menor rendimiento cuantitativo del método, tanto en el recuento total como en el porcentaje final de LPMN presentes en la población celular extraida.
En general este tipo de pacientes presentan por su propia enfermedad por CMV una inmunosupresión transitoria que se añade a la inducida por los fármacos inmunosupresores. Todo ello determina que el número total de leucocitos presentes en sangre periférica sea menor que en las personas sanas5,8,9. Esta leucopenia demostrada también se ha visto asociada a un descenso casi significativo del porcentaje de LPMN presentes en la población extraida (media del 82,4%).
En el grupo de pacientes con Ag-pp65 negativa no hemos observado apenas diferencias según tuvieran el CSV positivo o no. Los primeros, correspondientes la mayoría a pacientes receptores de trasplante renal, no presentaban ninguna sintomatología clínica compatible con infección o enfermedad por CMV y se detectaron en las muestras de control semanal postrasplante. En ninguno de ellos se realizó tratamiento antivírico y simplemente corresponden a viremias de bajo nivel sin, en general, valor predictivo positivo.
El grupo de muestras con Ag-pp65 y CSV negativo también correspondían a pacientes trasplantados de riñón bajo control, pero recogidas más allá del cuarto mes del trasplante. Este grupo es el que ha mostrado el rendimiento global (media de 2,1 millones de leucocitos) y el porcentaje más alto de LPMN (92,5%). Este porcentaje se asemeja al comunicado por Gerna et al7 del 95% obtenido en el proceso de extracción leucocitaria en pacientes receptores de trasplante renal y enfermos de sida. Aunque la media global de LPMN obtenido en nuestro estudio en el conjunto de todas las muestras ha sido del 87%.
Al analizar las muestras con Ag-pp65 positiva se observa como el valor medio de la misma ha sido de 48 LPMN-positivos/100.000 LPMN. Este valor se ha obtenido con los diferentes porcentajes de LPMN obtenidos en cada proceso individualizado de extracción. Si a la hora de calcular la cantidad de leucocitos que deben utilizarse para la prueba de la Ag-pp65 tuviéramos en cuenta el porcentaje real de LPMN presentes en la población leucocitaria, deberíamos añadir más cantidad salvo en los casos en que el porcentaje de LPMN fuera del 100%.
Por lo tanto, uno de los inconvenientes del sistema de extracción con dextrano salino es que al no obtener un 100% de LPMN estamos analizando menos LPMN de los deseados. Sin embargo, cuando luego hemos ajustado los valores de la antigenemia al porcentaje real de LPMN existentes en la población leucocitaria, hemos observado cómo el valor medio de la misma pasaba a ser de 51 LPMN-positivo/100.000 LPMN. Es decir, no se obtiene apenas un incremento significativo ni en la media ni en los valores individualizados, ya que porcentajes de incremento del 10% al 20% sobre valores de antigenemia bajos apenas modifican el valor final y el significado clínico de la antigenemia positiva.
En resumen, el método de extracción con dextrano salino aplicado a la prueba de la Ag-pp65 frente al CMV presenta un rendimiento aceptable, que varía generalmente en función de la clínica del paciente y de su estado inmunológico. Es un método sencillo, barato y que no precisa realizar ajustes en función del porcentaje final de LPMN, ya que no se produce una pérdida significativa de los mismos. Sin embargo, debe realizarse la metodología con total minuciosidad y ajustándose a los tiempos y procedimientos de la misma para poder obtener resultados comparables dentro de un mismo laboratorio.
