Fundamento: Evaluar las IgG fraccionadas en el diagnóstico y seguimiento de la hidatidosis.
Material y métodos: Se han estudiado 82 sueros de 50 enfermos diagnosticados previamente de hidatidosis. Estos pacientes fueron divididos en distintos grupos en función de su sintomatología. Se incluyeron 10 sueros de personas sanas como grupo control. Todos los sueros fueron previamente estudiados mediante una técnica de hemaglutinación indirecta. A todos los sueros positivos se les realizó un enzimoinmunoanálisis para determinar las IgG fraccionadas.
Resultados: La IgG1 fue positiva en 81 de los 82 pacientes. La IgG2 y la IgG3 fueron positivas en 12 y en 2 pacientes, respectivamente. La IgG4 fue positiva en el 94,4% de los pacientes con sintomatología de hidatidosis, en el 100% de los enfermos intervenidos con anterioridad a los que no se practicó una cirugía radical, y en ningún caso en pacientes a los que se realizó cirugía radical o los quistes estaban calcificados.
Conclusiones: Las IgG1 e IgG4 pueden ser utilizadas conjuntamente en el diagnóstico de hidatidosis, aportando gran especificidad y sensibilidad. La IgG4 se negativiza en poco tiempo si la evolución es favorable, se positiviza en pacientes que sufren recaídas y se mantiene positiva ante la presencia de un quiste residual. Todo esto hace de la IgG4 un buen marcador en el seguimiento de la hidatidosis.
Background: The aim of the study is to evaluate the IgG subclasses for the diagnosis and follow-up of hydatidosis disease.
Material and methods: 82 serum of 50 patients previously diagnosed of hydatidosis disease, were studied. This patients were divided into different groups depending on their sintomatology, and 10 serum of healthy individuals were tested for an indirect hemaglutination, and IgG subclasses were studied in all positive cases by an ELISA.
Results: IgG1 subclass was positive in 81 out of 82 patients. IgG2 and IgG3 subclasses were positive in 94.4% of sintomatic patients, in 100% of patients with calcified cyst or who had had no radical surgery, and in 0% of patients with calcified cyst or who had had radical surgery
Conclusion: IgG1 and IgG4 subclasses can be used together for hydatidosis diagnosis, due to their high specificity and sensibility. IgG4 subclass becomes negative soon if there is a good clinical response by the patient, turns to be positive when there is a disease recrudescence, and keeps positive when residual cyst are left. All this makes IgG4 subclass a good marker in the hydatidosis follow-up.
Introducción
La hidatidosis es una zoonosis parasitaria de distribución mundial que constituye un problema de salud pública.
Echinococcus granulosus es el agente etiológico de la hidatidosis. El hombre se infecta al ingerir los huevos, presentes en el agua o verduras contaminadas. Cuando éstos llegan al estómago, la acción del ácido clorhídrico libera el embrión exacanto, que atraviesa la mucosa gástrica e intestinal, y vehiculizado por la circulación portal, llega al hígado. La mayoría de embriones que llegan al hígado son fagocitados, otros se enquistan y una minoría pueden atravesar la barrera hepática y llegar al pulmón, donde se embolizan en los capilares pulmonares. En el pulmón pueden ser fagocitados, enquistarse o atravesar este segundo filtro y pasar a la circulación sistémica, pudiendo llegar a cualquier órgano. Aproximadamente el 75% de los quistes se localizan en el hígado, sobre todo en el lóbulo derecho, el 30% en el pulmón y alrededor del 15% restante en otros órganos1.
El diagnóstico de la hidatidosis se basa en la clínica del paciente, en técnicas de imagen y en estudios serológicos. La respuesta inmunológica en la hidatidosis es muy variable; los resultados obtenidos en el diagnóstico serológico dependen de la técnica utilizada, la localización y el estado del quiste, así como del propio sujeto, lo que ha sido atribuido a la variabilidad genética de cada individuo y a la existencia de distintas cepas del parásito2-4. Por ello se recomienda combinar dos o 3 técnicas para llegar a un diagnóstico lo más aproximado posible.
La prueba inmunológica ideal sería aquella que permitiera diagnosticar y diferenciar el curso de la enfermedad de manera temprana después de un tratamiento médico o quirúrgico5.
La respuesta serológica con las técnicas habitualmente empleadas permanece elevada durante largos períodos de tiempo, por lo que dichas técnicas no son útiles para valorar la evolución de un paciente tras el tratamiento ni pueden predecir posibles recaídas en pacientes que permanecen asintomáticos durante largos períodos.
Los signos clínicos del paciente son a menudo inespecíficos y no siempre se correlacionan con el estado real de la infección.
En el presente trabajo evaluamos las IgG fraccionadas en el diagnóstico y evolución de la hidatidosis. Estudios recientes manifiestan que pacientes con una buena respuesta clínica y terapéutica tienen valores de IgG4 significativamente inferiores que aquellos con mala respuesta al tratamiento6-12.
Material y métodos
Se han estudiado 82 sueros correspondientes a 50 enfermos adultos, todos ellos diagnosticados previamente de hidatidosis. Se han incluido 10 sueros de personas sanas como grupo control. La población se dividió en los siguientes grupos: grupo 1, en el que se incluyeron 36 sueros de pacientes con clínica y/o serología compatible con hidatidosis, como dolor, urticaria, tos, dificultad respiratoria, imágenes radiológicas indicativas de quistes hidatídicos, etc; grupo 2, formado por 35 sueros de pacientes actualmente asintomáticos con historia previa de hidatidosis y evolución favorable tras cirugía radical; grupo 3, constituido por 11 sueros de pacientes asintomáticos en los que no se pudo realizar una extirpación total del quiste y se realizó cirugía parcial, y grupo 4, con 10 sueros de personas sin historia previa de hidatidosis como grupo control.
Todos los sueros fueron previamente estudiados mediante una técnica de hemaglutinación indirecta (HAI) (Laboratorios Fumouze, París). A todos los sueros positivos se les realizó un enzimoinmunoanálisis (ELISA) para determinar las IgG fraccionadas. La realización del ELISA se hizo como sigue.
Obtención del antígeno
Para la obtención del antígeno utilizado en el ELISA se partió de un pool de líquidos hidatídicos extraídos de quistes fértiles hepáticos y pulmonares de ovejas adultas (mayores de 5 años), recién sacrificadas. La purificación y concentración del antígeno se realizó siguiendo el método descrito por Dottorini et al13 (1981).
La concentración óptima determinada para sensibilización de las microplacas fue de 10 µg/ml.
Enzimoinmunoanálisis
Se sensibilizaron las microplacas (Maxisorp, Nunc®) con 100 µl por pocillo de la concentración de trabajo del antígeno, diluido en PBS pH 7.2 (tampón fosfato alcalino). Se incubaron toda la noche a 4 ºC. Posteriormente, se lavaron por 3 veces con PBS-Tween 20 (PBS-T) al 0,1% (Sigma®).
El bloqueo de las placas se realizó durante 30 min a 37 ºC con 200 µl por pocillo de PBS-T y BSA (Seroalbúmina bovina, Sigma®) al 1%. A continuación se realizaron 3 lavados con PBS-T y se añadieron 100 µl por pocillo de una dilución 1/100 en PBS-T/BSA al 0,1% de los sueros controles y problema, incubándose durante 30 min a 37 ºC. Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T. Se añadieron 100 µl por pocillo de los diferentes conjugados (anticuerpos monoclonales específicos antihumanos frente a IgG total, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 obtenidos en ratón) marcados con biotina (Souther Biotechnology Associates®) y diluidos al 1/1.500 en PBS-T/BSA al 0,1%. Se incubaron durante 30 min a 37 ºC y posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T. Se añadieron 100 µl por pocillo de Estreptavidina-HRP (Souther Biotechnology Associates®) diluida al 1/6.000 en PBS-T/BSA al 0,1%, incubándose durante 30 min a 37 ºC. A continuación se realizaron cinco lavados como los descritos anteriormente y se añadieron 100 µl por pocillo del sustrato (ABTS, Sigma®) diluido en buffer fosfato-citrato pH5 (Sigma®), siguiendo las recomendaciones del fabricante, incubándose 30 min a temperatura ambiente.
La reacción se frenó añadiendo 100 µl por pocillo de SDS (Merck®) al 5%. Se leyó en el espectrofotómetro (Mios®, Merk) a una longitud de onda de 405 nm.
Los sueros se consideraron positivos a partir de una lectura de 0,50 de DO de absorbancia. El punto de corte se calculó sumando 0,150 a la media aritmética de las DO de las muestra control negativo.
Resultados
En la tabla 1 se expone el valor de las IgG fraccionadas en los distintos grupos.
La IgG1 fue positiva en todos los sueros excepto en un suero del grupo 3.
La IgG2 fue positiva en un bajo porcentaje de pacientes, sólo en seis de los 36 del grupo 1 (17,7%) y en 3 de los grupos 2 (8,6%) y 3 (27,3%), respectivamente.
En ningún paciente de los grupos 2 y 3 se hallaron anticuerpos de la subclase IgG3 y sólo se encontraron en 2 pacientes del grupo 1 (5,6%).
La IgG4 fue positiva en 34 de los 36 pacientes del grupo 1 (94,4%). Ninguno de los pacientes del grupo 2 presentó anticuerpos IgG4, al contrario que el grupo 3, en el que todos los pacientes tenían valores positivos de IgG4.
No se detectaron anticuerpos de alguna de las subclases en las muestras del grupo control.
En la tabla 2 se observa la respuesta IgG4 en función del estado clínico de los pacientes, sin que se observaran anticuerpos IgG4 en ninguno de los pacientes asintomáticos con quistes calcificados o que fueron sometidos a cirugía radical.
En todos los pacientes a los que no se realizó una cirugía completa, la respuesta de los anticuerpos IgG4 fue positiva. En el caso de los pacientes sintomáticos, todos excepto dos presentaron anticuerpos IgG4; estos 2 pacientes presentaban hidatidosis pulmonar y vertebral, respectivamente.
Discusión
El diagnóstico de la hidatidosis se basa en la clínica del paciente, en técnicas de imagen y en estudios serológicos.
Para el diagnóstico serológico de la hidatidosis se han empleado distintos métodos que han ido evolucionando con los años, desde la fijación del complemento hasta las actuales técnicas de ELISA o inmunotransferencia (Western blot). Los más utilizados han sido la contrainmuno-electroforesis o arco 5, la hemaglutinación indirecta o el látex14. El mayor inconveniente del arco 5 es la dificultad que supone la obtención del antígeno específico empleado en la reacción. No obstante, es una técnica sensible y específica, aunque el largo tiempo que tarda en negativizarse no permite utilizarla para hacer un seguimiento de estos pacientes.
El látex es un método de fácil realización que presenta problemas de sensibilidad y especificidad.
La sensibilidad y especificidad de la hemoglutinación indirecta dependen de los títulos considerados como positivos en las series. Valorando como positivos títulos bajos (1/32 y 1/64), obtenemos una gran sensibilidad, pero la tasa de falsos positivos es alta, sobre todo en zonas endémicas. Debemos combinar esta técnica con otra que nos proporcione la especificidad necesaria para reducir el número de falsos positivos sin perder sensibilidad. Puede ser utilizada como técnica de selección por su gran sensibilidad, pero el resultado debe ser confirmado por otra técnica más específica.
La determinación de anticuerpos totales IgG parece bastante útil por ser sensible y específica, y determinar las subclases de las inmunoglubulinas de tipo IgG nos proporciona información de gran utilidad.
Los anticuerpos de subclase IgG1 son positivos en el 98,8% de los pacientes de nuestra serie, lo que implica que la determinación de estos anticuerpos puede ser utilizada para el diagnóstico de hidatidosis, aportando gran sensibilidad. Esta sensibilidad disminuye en las hidatidosis extrahepáticas.
Las inmunoglobulinas de tipo IgG2 e IgG3, sin embargo, no aportan ninguna información útil de los pacientes, ya que toman valores positivos y negativos de forma aleatoria y no parecen estar relacionados con el estado del paciente ni con la evolución de la enfermedad.
La utilización de la subclase IgG4 como único marcador en el diagnóstico de la hidatidosis debe ser interpretada con precaución, ya que en los quistes calcificados y en los de localización extrahepática puede ser negativa (fig. 1). Las inmunoglubulinas de tipo IgG4 deben ser valoradas siempre junto a las de tipo IgG1 y en dos determinaciones consecutivas que permitan detectar una posible seroconversión indicativa de actividad. En nuestro estudio, la subclase IgG4 es positiva en todos los pacientes con sintomatología de hidatidosis, excepto en dos que presentaban hidatidosis vertebral y pulmonar, respectivamente. En ambos casos se observaron escólex en el líquido hidatídico de la punción en el primer caso y en la vómica en el paciente con hidatidosis pulmonar. En estos casos de hidatidosis, y al igual que los documentados en otras fuentes, los quistes son mucho menos inmunógenos, lo que justifica la ausencia de anticuerpos en estos pacientes. Algo similar ocurre en con los quistes calcificados, que tienen una capacidad inmunógena mucho menor que aquellos que se encuentran en actividad2-4.
Por otra parte, el seguimiento de los enfermos de hidatidosis ha sido durante años un gran problema. Force et al15 estudiaron varios métodos, buscando aquel que permitiera llevar a cabo un seguimiento de los pacientes, encontrando que el mayor problema que plantean los distintos métodos diagnósticos es el tiempo que tardan en negativizarse. Cuando la IgE disminuye tras la cirugía indica buen pronóstico16, y un aumento de la misma va asociada a una progresión de la enfermedad, pero esta disminución suele observarse a partir de los 6 meses, pudiendo llegar a años en algunos casos. Otro inconveniente de la IgE es su falta de especificidad, ya que aparece elevada en otras parasitosis distintas de la hidatidosis y otros procesos no infecciosos, como cirrosis hepática y enfermedades malignas4.
También Force et al sugieren la utilización de la hemoglutinación indirecta para el seguimiento posquirúrgico, aunque según nuestro estudio es una técnica poco apropiada para este fin, ya que permanece invariable durante años a pesar de la evolución favorable de los pacientes.
Como podemos observar en la tabla 1, la paciente 4 mantiene el título de hemoglutinación indirecta estable desde 1986, cuando fue intervenida la primera vez de hidatidosis, hasta 1998, momento en el que comienza a descender a títulos menores. Lo mismo ocurre en la mayoría de los pacientes, aunque hay algún caso (paciente 2) en el que desciende tras el éxito del tratamiento quirúrgico.
La IgG4 aparece también en otras parasitosis de larga duración, como esquistosomiasis, filariasis o estrongiloidiasis crónica1, entre otras. La síntesis de IgG4 por los leucocitos de sangre periférica depende de la producción de interleucina (IL)4. Rigano et al10 proponen la IL-4 para el seguimiento de los pacientes y encuentran que aquellos que responden al tratamiento producen significativamente (p = 0,001) menos IL-4 que aquellos que no responden. Esto implica menor producción de IgG4 y menor producción de IgE.
Navarro-Zorraquino et al17, en otro estudio, siguieron la evolución de pacientes con hidatidosis hepática y pulmonar tras la cirugía, midiendo los valores de IL-4, y encontraron resultados similares. La continua exposición antigénica a la que se encuentran sometidos los pacientes infectados por E. granulosus implica que la producción de IL-4 es elevada y, por tanto, la IgG4 alcanza valores mayores. Cuando el quiste desaparece o se calcifica, la producción de antígenos parasitarios desciende hasta niveles indetectables, no hay producción de IL-4 y la IgG4 disminuye hasta valores negativos. Ravinder18 mide los valores de antígenos en suero de pacientes afectados y encuentra que tras ser sometidos a intervenciones quirúrgicas las concentraciones de antígenos circulantes descienden gradualmente a partir del séptimo día, y desaparecen después del primer mes de la cirugía y del sexto mes de tratamiento farmacológico.
La subclase IgG4 se negativiza si la evolución es favorable; el tiempo de negativización no ha podido determinarse con certeza en este estudio por no disponer de muestras obtenidas en pequeños intervalos de tiempo para poder determinar en qué momento se produce la misma. En algún paciente en el que sí se ha podido realizar un seguimiento minucioso (pacientes 1 y 7) el tiempo de negativización ha sido de 2 y 3 meses, respectivamente. Se positiviza en pacientes asintomáticos si estos sufren recaídas y se mantiene constante si la cirugía no ha sido completa.
A la vista de los datos que se desprenden de este estudio, podemos concluir que la IgG4 es un marcador eficaz para llevar a cabo un seguimiento de pacientes con hidatidosis y, junto a la subclase IgG1, es útil en el diagnóstico de esta afección.
