Las variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus (VCPSA) constituyen una subpoblación con características especiales.
MétodosSe estudió el comportamiento fenotípico y la sensibilidad antibiótica de 4aislados clínicos de VCPSA.
ResultadosLas colonias crecieron en los medios de cultivo habituales excepto en Mueller Hinton. Todos los aislados fueron resistentes a ciprofloxacino y cotrimoxazol.
DiscusiónLas VCPSA son aisladas con baja frecuencia, y es necesario conocer los métodos óptimos para su identificación y el estudio de su sensibilidad antibiótica.
Small colony variants of Staphylococcus aureus (SCVSA) are a sub-population with special features.
MethodsThe phenotypic features and antibiotic susceptibility of four clinical isolates SCVSA were studied.
ResultsColonies grew in the usual culture media, except in Mueller Hinton. All isolates were resistant to ciprofloxacin and co-trimoxazole.
DiscussionAs SCVSA are isolated with low frequency, it is necessary to determine the optimal methods for their identification and antibiotic susceptibility study.
Desde la primera descripción de las variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus (VCPSA) hace alrededor de 80años1, se han descrito múltiples casos de infecciones producidas por estas. Tradicionalmente las VCPSA se han relacionado con infecciones en pacientes con fibrosis quística e infecciones crónicas como osteomielitis, debido a su capacidad de permanecer intracelularmente haciéndose resistentes a la acción de antimicrobianos; pero también se han descrito como agentes causantes de infecciones agudas como sinusitis, timpanitis e infecciones del sistema nervioso2-5. Las VCPSA tienen características fenotípicas propias que las diferencian de sus parientes normales, dificultando su identificación en el laboratorio de microbiología. Sus principales rasgos son: lento crecimiento, tamaño reducido, disminución de la pigmentación, inhibición de la β-hemólisis y posible disminución de las reacciones de la catalasa y la coagulasa6. Las VCPSA pueden presentar dependencia de timidina, hemina o menadiona, sustratos implicados en la cadena transportadora de electrones y en la síntesis de ADN. La deficiencia de estos compuestos y el conocimiento de las rutas en las que están implicados pueden explicar sus características especiales7. Las implicaciones clínicas de las VCPSA y su difícil diagnóstico microbiológico hacen imprescindible conocer las características de crecimiento de las mismas, así como los métodos para su cultivo, identificación y estudio de sensibilidad antimicrobiana. El objetivo de nuestro estudio fue la búsqueda de los métodos óptimos para la identificación de VCPSA, así como para la detección de resistencias.
MétodosMuestrasSe estudiaron 4aislados de muestras clínicas obtenidas a lo largo de un año en nuestro hospital. Las muestras incluían un exudado ótico y 3esputos de fibrosis quística, 2 de los cuales pertenecían al mismo paciente. Como control de los ensayos se utilizó la cepa S.aureus ATCC 25923.
IdentificaciónSe estudió el comportamiento de los 4aislados en medios habituales: Columbia agar sangre (AS), Agar chocolate, Mueller Hinton (MHA), Mueller Hinton sangre (MHS) y Agar Schaedler. Los cultivos se incubaron 96h a 35-37°C en atmósfera aerobia, anaerobia y enriquecida con CO2, realizándose lecturas cada 24h. La identificación fenotípica de S.aureus se realizó mediante tinción de Gram, pruebas de la catalasa, y coagulasa en tubo (BD BBL™ Coagulase Plasma, rabbit with EDTA®) con lecturas a las 2, 4 y 24h y aglutinación en látex para detección de coagulasa (Staphaurex Plus remel®). Paralelamente se realizó panel MIC/ID GRAM POSITIVOS (WIDER) con sistema semiautomatizado. La identificación genotípica se realizó mediante la amplificación por PCR y secuenciación del gen de la proteínaA (spa)8.
Ensayos de dependenciaLa dependencia de timidina, hemina y menadiona (Sigma Aldrich®) se ensayó con discos y con medios suplementados, ambos preparados en nuestro laboratorio9. En el método con discos, la dependencia de timidina se estudió utilizando discos impregnados con 15μl de solución de timidina a distintas concentraciones (100 y 200μg/ml) y para hemina y menadiona con discos impregnados con 15μl de solución de menadiona o hemina a distintas concentraciones (10 y 20μg/ml). Los ensayos se llevaron a cabo en medio MHA utilizando un inóculo de 0,5 McFarland. Un aislado fue considerado dependiente cuando se objetivó crecimiento de colonias solamente alrededor de los discos tras 24h de incubación en atmósfera aerobia a 35-37°C. Para el método en medio suplementado, se utilizó MHA suplementado con timidina (MHT) (100 y 200μg/ml); MHA suplementado con menadiona (10 y 20μg/ml), y MHA suplementado con hemina (10 y 20μg/ml). Los medios se incubaron en atmósfera aerobia a 35-37°C durante 24h y se reincubaron hasta 72h en caso de resultado negativo. Un aislado fue considerado dependiente cuando creció en el medio MHA suplementado con el correspondiente sustrato y no en medio MHA.
Sensibilidad antibióticaLa sensibilidad antimicrobiana fue estudiada por 2métodos. Panel MIC/ID GRAM POSITIVOS (WIDER) en sistema semiautomatizado, y difusión con discos en medio AS y MHT para eritromicina, clindamicina, linezolid, cefoxitina, teicoplanina, vancomicina, ciprofloxacino, tetraciclina, gentamicina, trimetoprim-sulfametoxazol y rifampicina. Los valores de CMI y los diámetros de inhibición de los halos fueron interpretados según los puntos de corte de CLSI para S.aureus10. En aislados resistentes a cefoxitina se confirmó la resistencia mediante aglutinación de látex (MRSA Screen, Denka Seiken®) y PCR para detección del gen mecA (BD GeneOhm™). El tipo de SCCmec fue determinado usando una PCR múltiple. La presencia de ccrB2 fue confirmada por PCR según está descrito. Las parejas de cebadores IS5, MA6, IS1272-F y mecR1-R fueron usadas para determinar la presencia del complejo SCCmec clase B8.
Estudio de la relación clonalTodos los aislados fueron genotipados mediante electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) tras digestión del ADN cromosómico con enzima de restricción SmaI. Los geles fueron analizados por inspección visual. Las secuencias de nucleótidos obtenidas en la amplificación del gen spa fueron analizadas utilizando Ridom StaphType™ software 1.5 (Ridom GmbH, Würzburg, Alemania)8.
ResultadosIdentificaciónA las 24h de incubación en AS, las colonias fueron puntiformes o con aspecto de «huevo frito», de tamaño aproximadamente 10veces menor que el habitual, con disminución de la pigmentación y la hemólisis, independientemente de la atmósfera de incubación. El crecimiento en agar chocolate y en agar Schadler correspondía a las características de VCP. No hubo reversión del fenotipo a la morfología normal durante el período de estudio. En medio MHA y en MHS no se obtuvo crecimiento de ninguno de los aislados. En la tinción de Gram se observaron cocos grampositivos compatibles con estafilococos. En la tabla 1 se muestran las características fenotípicas de los aislados estudiados. La identificación en el sistema comercial fue S.hyicus (bajo porcentaje). La amplificación del gen spa se confirmó en todos los aislados.
Características de los aislados estudiados
| Aislado | Muestra | Catalasa | Coagulasa | Tipado spa | Hemólisis | Morfología | Dependencia con discos | |||||
| Látex | Tubo | Timidina | Hemina | Menadiona | ||||||||
| 2h | 4h | 24h | ||||||||||
| VCPSA1 | Exudado ótico | + | + | − | − | + | T1482 | Disminuida | Huevo frito | + | − | − |
| VCPSA2 | Esputo FQ | + | + | + | + | + | T1341 | Disminuida | Huevo frito | + | − | − |
| VCPSA3 | Esputo FQ | + | + | + | + | + | T067 | Disminuida | Puntiforme | + | − | − |
| VCPSA4 | Esputo FQ | + | + | − | − | + | T067 | No | Huevo frito | + | − | − |
Todos los aislados fueron dependientes de timidina en el ensayo con discos, independientemente de la concentración empleada; ningún aislado presentó dependencia de hemina ni menadiona. A las 24h de incubación todos los aislados crecieron en el medio MHT a ambas concentraciones; un aislado creció en medio suplementado con hemina a las 2concentraciones empleadas.
Sensibilidad antibióticaNo se obtuvo crecimiento en el pocillo control del sistema comercial y este lo interpretó como sensible a todos los antimicrobianos. En el test de difusión con discos en AS todos los aislados fueron resistentes a ciprofloxacino y a trimetoprim-sulfametoxazol, y sensibles al resto. Los 2aislados del paciente con fibrosis quística fueron resistentes a cefoxitina; dieron positiva la PCR del gen mecA y la aglutinación en látex para detección de SARM. Los aislados portadores de gen mecA fueron identificados como SCCmec tipoiv. Los resultados de sensibilidad fueron los mismos en AS y en MHT.
Estudio de la relación clonalLos aislados de diferentes pacientes no estuvieron relacionados clonalmente, mientras que los 2aislados del mismo paciente mostraron idéntico patrón de bandas. Los resultados del tipado spa se muestran en la tabla 1.
DiscusiónLas variantes de colonia pequeña de S.aureus son aisladas con baja frecuencia en los laboratorios de microbiología clínica11; en nuestro centro se aislaron con una prevalencia del 1% con respecto a los S.aureus totales, mientras que en pacientes con fibrosis quística la prevalencia se situó en el 11%. Su baja prevalencia puede ser debida en parte a la dificultad de reconocimiento y aislamiento de las mismas, ya que pueden quedar enmascaradas por el crecimiento de colonias normales de S.aureus y de otras especies. Este hecho supone un reto para los microbiólogos clínicos: es importante reconocer sus rasgos fenotípicos, conocer los métodos para su identificación y el estudio de su resistencia12. En nuestra serie, 3de los aislados procedían de pacientes con fibrosis quística, confirmando así lo descrito en cuanto a la mayor prevalencia de VCP en este cuadro13. Proctor et al.7 describen la existencia de una asociación entre aislados de fibrosis quística y dependencia a timidina, así como resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol; esta asociación se demuestra en nuestro estudio, ya que todos los aislados de fibrosis quística presentaron dependencia de timidina y fueron resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol. Spanu et al.3 describen un caso de meninigitis por VCP S.aureus, y demostraron que la identificación por sistemas semiautomatizados puede ser errónea, como ocurrió en nuestro caso. Las variantes de colonia pequeña pueden actuar como reservorio de resistencia a meticilina, y es necesario conocer las opciones para la detección de resistencia. En nuestro caso la detección de resistencia a meticilina se realizó por 3métodos diferentes sin detectarse discrepancias entre los resultados; se ha demostrado que los métodos más sensibles son la aglutinación en látex y la PCR del gen mecA14.
En conclusión, es necesario tener en cuenta a las VCPSA en la etiología de infecciones crónicas, así como conocer las características especiales de las mismas y los métodos a emplear para su correcta detección. Los ensayos de dependencia son útiles para su caracterización, y junto con las pruebas de la catalasa y la coagulasa se puede llegar fácilmente a una correcta identificación. Para la detección de resistencias es mejor emplear métodos manuales a métodos semiautomatizados, utilizando medios ricos como Columbia AS o MH suplementado con timidina; para la detección de aislados SARM se pueden emplear tanto técnicas rápidas como test de difusión con discos.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
