Se ha sugerido que en el rechazo celular del injerto hepático, la lesión inducida por los linfocitos T citotóxicos pudiera estar mediada por el sistema FasAg/FasL, produciendo la muerte celular por apoptosis.
OBJETIVO: Comprobar si durante el rechazo se produce un aumento de los valores de Fas soluble (sFas) y valorar su respuesta al tratamiento.
Material y métodos: Se han estudiado 14 pacientes con trasplante ortotópico hepático (TOH) que presentaron un episodio de rechazo celular agudo. Los valores séricos de sFas se detectaron mediante enzimoinmunoanálisis en el momento del diagnóstico y 5 días después de efectuado el tratamiento. Se analizó el sFas en 12 pacientes con trasplante hepático sin rechazo y en 10 sujetos sanos, siendo éstos los grupos control.
Resultados: En los pacientes con rechazo, los valores de sFas se encuentran significativamente elevados respecto a los pacientes sin rechazo y a los sujetos sanos (24,2 ± 39,1 frente a 2,8 ± 4,0 frente a 0,6 ± 1,5 Ul/ml; p = 0,003). En los pacientes con rechazo celular agudo, el tratamiento inmunosupresor indujo un descenso significativo de los valores de sFas con respecto a los valores basales (24,2 ± 39,1 frente a 9,9 ± 30,2 Ul/ml; p = 0,005). Se observó una clara correlación entre las concentraciones séricas de sFas, GOT, GPT y gamma-GGT.
Conclusiones: a) El aumento del Fas soluble durante el rechazo y su descenso en los pacientes con buena evolución sugiere que el sistema Fas pudiera desempeñar un papel importante en la lesión hepatocitaria producida en estos pacientes por un mecanismo de apoptosis, y b) la monitorización del Fas soluble puede ser de ayuda en el diagnóstico de rechazo y en la valoración de la respuesta al tratamiento.
It has been suggested that in the cellular rejection of hepatic graft, the lesion provoked by cytotoxic T-lymphocytes might be mediated by the Fas antigen/Fas ligand system, producing cell death by apoptosis.
Aim: To determine whether soluble Fas (sFas) is increased during treatment and to evaluate response to treatment.
Material and methods: Fourteen patients with orthotopic liver transplantation who presented an episode of acute cellular rejection were studied. Serum levels of sFas were detected by enzyme-immunoanalysis at diagnosis and again 5 days after treatment was completed. As control groups, sFas was analyzed in 12 patients with liver transplantation without rejection and in 10 healthy subjects.
Results: sFas levels were found to be significantly higher in patients with rejection than in those without rejection and in healthy subjects (24.2 ± 39.1 vs. 2.8 ± 4.0 vs. 0.6 ± 1.5 UI/ml; p = 0.03). In patients with acute cellular rejection, immunosuppressive treatment significantly decreased sFas levels compared with basal values (24.2 ± 39.1 vs. 9.9 ± 30.2 UI/ml; p = 0.005). A clear correlation between the serum levels of sFas, glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), glutamate-pyruvate transaminase/glutamic-pyruvic transaminase (GPT) and gamma-glutamyl transferase (GGT).
Conclusions: a) The increase of sFas during rejection and the decrease in patients with a good evolution suggests that the Fas system may play an important role in the hepatocyte lesion produced by an apoptosis mechanism in these patients. b) Monitoring sFas could be useful in diagnosing rejection and in evaluating response to treatment.
INTRODUCCION
El rechazo celular agudo del injerto hepático se produce en un 40-80% de los pacientes sometidos a un trasplante ortotópico hepático (TOH). La inmensa mayoría de los episodios de rechazo celular se desarrollan entre el sexto día y la sexta semana postrasplante. Aunque habitualmente revierte con el tratamiento inmunosupresor, origina el 15% de las pérdidas del injerto. La inmunopatogénesis del rechazo se inicia con el reconocimiento de los aloantígenos (complejo mayor de histocompatibilidad [HLA]) del donante por los linfocitos, lo que desencadena una cascada de eventos inmunológicos que culminan en el desarrollo de células efectoras que median el daño tisular1. Estudios recientes tanto en animales de experimentación como en humanos, sugieren que la apoptosis es un mecanismo de muerte celular implicado en el rechazo del injerto hepático; este proceso está mediado por los linfocitos T citotóxicos (CTL)2-7. Estos CTL pueden producir apoptosis por vía perforina/granzyma B o vía Fas (APO-1/CD95)8. El Fas antígeno (FasAg) o Fas receptor es una proteína de membrana tipo I perteneciente a la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) que se expresa constitutivamente en células del sistema inmune y en tejidos no linfoides como el cardíaco, el pulmonar, el renal y el hepático, y se sobreexpresa en respuesta a distintos estímulos (antígenos virales y células tumorales, entre otros). El FasAg desencadena la muerte celular al interactivar con el Fas ligando expresado en los linfocitos T citotóxicos.
Estudios recientes sugieren la importancia del sistema Fas en el rechazo del injerto cardíaco, renal y hepático, habiéndose encontrado elevación de la expresión de Fas ligando en los CTL que infiltran el órgano rechazado9, y sobreexpresión de FasAg en los hepatocitos de pacientes con rechazo. La forma soluble del FasAg (sFas) se detecta en el suero de estos pacientes10; su papel en esta situación es controvertido.
Nuestro objetivo ha sido comprobar si durante el rechazo se produce un aumento de los valores plasmáticos de sFas y valorar su respuesta al tratamiento.
MATERIAL Y MÉTODOS
Pacientes
Hemos estudiado 14 pacientes a los que se les realizó un TOH en nuestra unidad durante el período comprendido entre enero de 1996 y enero de l998, que presentaron durante su evolución un rechazo agudo moderado-severo que respondió al tratamiento inmunosupresor. Se diseñaron grupos de control: a) 12 pacientes sometidos a un TOH en los que la biopsia del día 15 evidenció un injerto hepático sin lesiones, y b) 10 sujetos sanos de edad y sexo semejantes provenientes del banco de sangre de nuestro hospital.
En todos los pacientes se realizó el mismo protocolo quirúrgico de TOH y recibieron triple terapia inmunosupresora consistente en ciclosporina neoral a dosis de 15 mg/kg/día, azatioprina 2 mg/kg/día y metilprednisolona 1.000 mg/día durante 3 días, con descenso rápido hasta 20 mg de prednisona al día del tratamiento. El diagnóstico de rechazo celular del injerto hepático se realizó sobre la base de criterios clínicos e histológicos; una vez confirmado éste se realizó un reciclaje de corticoides (bolos de 1.000 mg/día de metilprednisolona durante 3 días, seguido de una pauta descendente hasta llegar a una dosis de mantenimiento de 20 mg/día de prednisona). Por definición, todos los pacientes incluidos en este estudio respondieron al tratamiento inmunosupresor, normalizando progresivamente las pruebas de función hepática. En los pacientes con rechazo se extrajo suero en el momento del diagnóstico y a los 5 días de acabado el tratamiento. Las muestras de suero se congelaron a 20 °C en alícuotas de 1ml.
Determinaciones serológicas
Mediante autoanalizador se determinaron GOT, GPT, GGT, fosfatasa alcalina y bilirrubina total. Asimismo, se analizaron la actividad de protrombina y los valores séricos de ciclosporina. En todos los pacientes con sospecha de rechazo se descartaron otras causas de disfunción hepática, realizándose determinaciones de serología de hepatitis A, B y C, citomegalovirus, herpes simple y Epstein-Barr, así como realización de ecografía Doppler hepática.
Estudio histológico
Las biopsias se incluyeron en parafina y se realizó tinción de hematoxilina-eosina. El rechazo se clasificó en leve, moderado o severo según la clasificación de Snover según los hallazgos de infiltrado portal con linfocitos y eosinófilos, daño del conducto biliar, endotelitis, balonización de los hepatocitos, necrosis confluente y hemorragia intersticial.
FasAg soluble
Los valores séricos de sFas se detectaron mediante enzimoinmunoanálisis (Laboratorios Zymed, South San Francisco, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras fueron tomadas por duplicado. El coeficiente de variación interanálisis fue de 3,5%.
Análisis estadístico
La comparación de medias se realizó mediante el test no paramétrico de la U de Mann-Whitney para muestras independientes y el test de Wilcoxon para muestras pareadas. Para analizar la correlación entre los valores de sFas y las pruebas de función hepática se efectuó una regresión lineal univariante. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
RESULTADOS
La indicación del trasplante hepático, la edad, el sexo, el momento de aparición del rechazo celular y el grado del mismo se resumen en la tabla I. El tiempo medio de aparición del rechazo celular fue de 32,0 ± 62,8 días postrasplante (límites, 6-240). En el momento del diagnóstico del rechazo celular, los valores séricos de ciclosporina fueron de 212,9 ± 73,4 ng/ml (límites, 70-331). No hubo diferencias significativas en relación con la edad y el sexo respecto a los grupos control.
El estudio histológico de las biopsias hepáticas demostró un rechazo moderado en 11 pacientes y severo en 3 casos (clasificación de Snover). En todas las muestras histológicas analizadas se observaron numerosos hepatocitos periportales y lobulillares con características morfológicas sugestivas de muerte celular apoptótica (condensación del citoplasma, núcleo picnótico y cuerpos acidófilos).
Valores séricos de sFas
El grupo de pacientes con rechazo evidenció unos valores significativamente elevados (24,26 ± 39,16 Ul/ml) con respecto al grupo de trasplante sin lesiones (2,8 ± 4,0 Ul/ml) y al grupo control sano (0,65 ± 1,5 Ul/ml); p = 0,03 (fig. 1). En los pacientes con rechazo celular, tras el tratamiento se produjo un descenso significativo de los valores de sFas (9,9 ± 30,2 Ul/ml; p = 0,005), alcanzando unos valores semejantes al grupo control (fig. 2). No se objetivó una relación significativa entre los valores séricos de sFas y la severidad del rechazo celular.
Correlación entre sFas y parámetros bioquímicos en función hepática
Se ha objetivado una correlación fuertemente positiva entre los valores de sFas y GOT (r = 0,86; p < 0,001), GPT (r = 0,78; p = 0,02) y GGT (r = 0,86; p < 0,001). En el resto de los parámetros analizados no se evidenció correlación, FA (r = 0,52; p = 0,068), bilirrubina total (r = 0,065; p = NS) y actividad de protrombina (r = 0,1; p = NS). Tampoco se evidenció correlación entre los valores de ciclosporina y el sFas en el momento del rechazo.
DISCUSION
En los pacientes sometidos a un trasplante hepático que presentan durante su evolución un rechazo celular del injerto hepático, hemos demostrado un aumento significativo de los valores séricos de sFas, siendo éste el primer trabajo publicado en el que se observa un marcado descenso de dichos valores con el tratamiento inmunosupresor y la normalización del injerto. Estos hallazgos apoyan la importancia del sistema Fas en la inmunopatogenia del rechazo celular, tal y como ya se había sugerido con anterioridad en trabajos realizados tanto en trasplante hepático, como cardíaco y renal9.
El FasAg es una proteína de membrana perteneciente a la familia del TNF que se expresa constitucionalmente en los hepatocitos y que, al interaccionar con el Fas ligando expresado en los linfocitos T citotóxicos, desencadena la muerte de la célula por apoptosis. El papel del sistema Fas en el rechazo del injerto hepático ha sido estudiado recientemente, observándose un incremento de la expresión del Fas ligando en los CTL que infiltran el órgano rechazado, y una sobreexpresión del FasAg en los hepatocitos de pacientes con rechazo celular11.
La forma soluble del FasAg se produce por fragmentación de su dominio transmembrana; su significado clínico y fisiopatológico no está, en la actualidad, totalmente dilucidado. Se ha especulado que: a) el sFas podría guardar relación con la actividad inflamatoria tisular; a favor de este papel proinflamatorio del sFas está el hallazgo de valores elevados tanto en hepatopatías agudas12 y crónicas13,14 como en múltiples enfermedades reumatológicas15,16; b) el sFas podría ser tan sólo un reflejo del daño tisular producido por diferentes agresiones, como el rechazo celular, la isquemia del injerto o la presencia de una infección sistémica; c) el sFas podría tener un papel preferentemente modulador, inhibiendo de forma parcial la muerte celular programada al interactivar con el Fas ligando17,18, y d) podrían existir diversas formas del sFas, quizá con actividades contrapuestas, tal y como sugiere el hallazgo de Krams et al, al describir una variante del FasAg que se expresa en el tejido hepático y cuya forma soluble está disminuida en los pacientes con rechazo agudo en relación con los injertos estables19, en nuestro trabajo hemos detectado la forma no mutada del Fas. El incremento significativo de los valores séricos de sFas en el grupo de pacientes con rechazo celular que hemos analizado y la estrecha correlación entre éstos y los valores séricos de GOT, GPT y GGT, nos permiten sugerir que los valores séricos de sFas se comportan como un marcador del daño tisular hepático y podría ser útil en la monitorización de la respuesta al tratamiento. Este aumento de los valores séricos de sFas también se ha observado en los pacientes sometidos a un trasplante hepático por una cirrosis relacionada con el virus de la hepatitis C que presentan una recidiva de su enfermedad en el injerto hepático. Aunque no es el motivo de este trabajo, los valores séricos de sFas en los sujetos con recidiva de la enfermedad por VHC fueron inferiores a los observados durante el rechazo celular (datos pendientes de publicación).
Finalmente, hay que considerar el papel que pueden desempeñar los fármacos inmunosupresores modificando la expresión del sistema Fas. Los corticoides se usan como primera línea de tratamiento en el rechazo agudo: el mecanismo preciso de su actividad inmunosupresora no está totalmente aclarado, pero potenciales mecanismos incluyen la disminución de la síntesis de citocinas (interferón alfa o IL-2), reducción de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad, o la modulación de la apoptosis. El hecho de que en nuestros pacientes tras el tratamiento del rechazo consistente en dosis altas de corticoides se produzca un descenso de los valores de sFas nos sugiere un papel directo de los corticoides en la regulación de la apoptosis. Por otra parte, la ciclosporina y el tacrolimus usados comúnmente en el trasplante hepático para suprimir la respuesta inmune y prevenir el rechazo pueden modular la apoptosis por un mecanismo dependiente de calcineurina20,21, sin embargo, en nuestro estudio, los valores de sFas fueron independientes de los de ciclosporina, y los pacientes estudiados presentaban en el momento de desarrollar el rechazo concentraciones adecuadas de ciclosporina salvo en 2 casos, cuyos valores eran inferiores a 150 ng/ml, pero no supuso un rechazo más grave ni unos valores superiores de sFas. El estudio de todos los mecanismos implicados en la regulación de la apoptosis durante el rechazo permitirá en el futuro el desarrollo de nuevos fármacos inmunosupresores, dado que en teoría un fármaco capaz de inducir la apoptosis de los linfocitos T activados podría usarse para inhibir la respuesta inmune durante el rechazo.
En conclusión, el aumento del sFas durante el rechazo sugiere que el sistema Fas pudiera tener un papel importante en la lesión hepatocitaria producida en estos pacientes por un mecanismo de apoptosis. En los pacientes con buena respuesta clínica se produce un descenso de los valores de sFas: por tanto, la monitorización del sFas puede ser de ayuda en el diagnóstico de rechazo y en la valoración de la respuesta al tratamiento.
