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Fig. 1. A) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos a partir del ADN correspondiente a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del gen del ARN ribosomal 28S, utilizando 6 #µ#l del ADN genómico crudo que como mínimo contiene de 10-20 ng del ADN. Carriles: 1) marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS); 2) una larva de Anisakis simplex grande (unos 24 mm); 3) una larva de A. simplex mediana (alrededor de 18 mm); 4) una larva de Anisakis simplex pequeña (13 mm aproximadamente); 5) una larva de Hysterothylacium aduncum; 6) una larva de H. aduncum; 7) control negativo; 8) marcador de peso molecular PCR Marker (SIGMA). B) Electroforesis en gel de agarosa al 4% con bromuro de etidio de los productos de restricción obtenidos tras digestión con la endonucleasa Taq I de los amplicones correspondientes a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del
Fig. 2. A) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación con los cebadores universales HUF-UNR utilizando como molde ADN de ratón. Carriles: 1) marcador de peso molecular 100 pb Ladder (BIOTOOLS); 2) 1 #µ#l ; 3) 2 #µ#l; 4) 4 µl; 5) 6 #µ#l; 6) 1 #µ#l (1/10); 7) 4 #µ#l (1/10); 8) 1 #µ#l (1/10#2#); 9) 4 #µ#l (1/10#2#); 10) negativo; 11) 1 #µ#l (1/10#3#); 12) 4 #µ#l (1/10#3#); 13) 1 #µ#l (1/10#4#); 14) 4 #µ#l (1/10#4#); 15) marcador de peso molecular 100 pb Ladder (BIOTOOLS). B) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación con los cebadores de anisákidos NC5-NC2 utilizando como molde ADN de Anisakis simplex. Se mantiene el orden de las muestras indicados en el apartado A.
Fig. 3. A) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos a partir de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conjunta. Los moldes y cebadores utilizados se indican en cada uno de los carriles: 1) marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS); 2) PCR conjunta A: molde: ADN Anisakis (cebadores NC2-NC5); 3) molde ADN Anisakis (cebadores HUF-UNR); 4) molde ADN ratón (cebadores HUF-UNR); 5) ADN ratón (cebadores NC2-NC5); 6) molde: ADN Anisakis más ADN ratón (cebadores NC2-NC5); 7) ADN Anisakis más ADN ratón (cebadores HUF-UNR); 8) ADN Anisakis más ADN ratón (cebadores NC2-NC5/HUF-UNR); 9) control negativo; 10) marcador de peso molecular de 100 pb Ladder (BIOTOOLS). B) Electroforesis en gel de agarosa al 4% con bromuro de etidio de los productos de restricción obtenidos tras digestión con la endonucleasa Taq I de los obtenidos en el apartado A. Se mantiene el orden de las muestras, salvo que en el carril 10 se sustituye el marcador de peso mol
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Fundamento y objetivo: Desarrollo de una técnica molecular que permita la identificación específica de especie de anisákidos parásitos humanos con el mínimo de muestra, independientemente de su estado evolutivo. Material y método: Se utilizaron larvas de nematodos obtenidas de pescados para el consumo humano. Se realizó reacción en cadena de la polimerasa con análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP). Para ello se amplificó el ADN de anisákidos correspondiente a las regiones ITS-1, gen del ARN ribosomal 5.8S, ITS-2 y aproximadamente 70 pares de bases del gen del ARN ribosomal 28S, incluyéndose un control de reacción interno. Los productos se digirieron posteriormente con la endonucleasa Taq I y por otra parte se secuenciaron. Resultados: Se obtuvieron patrones de amplificación (fragmentos de 960 y 1.010 pb) y restricción diferentes según la especie de anisákido (Anisakis simplex/Hysterothylacium aduncum), que coincidieron con los ya descritos para los mismos parásitos pero de otras procedencias geográficas, y se confirmó una divergencia genómica. Conclusiones: La especificidad del ensayo y la alta sensibilidad de la técnica, así como la ausencia de variaciones intraespecíficas, confirman la utilidad de esta prueba en la identificación de parásitos causantes de la anisakiasis humana, tanto en biopsias como a partir de las larvas extirpadas.
Palabras clave:
Anisakiasis
Anisakis
Hysterothylacium
PCR-RFLP
Background and objective: We intended to develop a molecular test allowing a species-specific identification of the anisakid human parasite independently of its evolutive stage. Material and method: Anisakid larvae were obtained from fish destined to human consumption. In the PCR-RFLP test, the DNA corresponding to the ITS-1, 5.8S rRNA gene, ITS-2 and approximately 70 of the 28S rRNA gene region was amplified and a positive control was included. Products were digested with the endonuclease Taq I and subsequently sequenced. Results: Different anisakids (Anisakis simplex/Hysterothylacium aduncum) yield different amplification (960 and 1,010 bp fragments) and restriction patterns, which were in accord with previously described patterns of the same parasites from others geographical regions. Conclusions: The high sensitivity of the test and the absence of intraspecies variations confirms the utility of this assay in the identification of human parasites involved in human anisakiasis including larvae from resected biopsies.
Keywords:
Anisakiasis
Anisakis
Hysterothylacium
PCR-RFLP
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