La leptina, hormona secretada por adipocitos, es una proteína clave en diversas funciones más allá de las descritas inicialmente como indicador de las reservas energéticas periféricas y controlador de la homeostasis energética (Friedman y Halaas, 1998). Se ha descrito el papel crucial de la leptina en procesos biológicos como la angiogénesis, la función inmune, la inflamación y la función reproductora (Brewer y Balen, 2010; Cervero et al., 2005; Pérez-Pérez et al., 2015).

La leptina juega un rol crítico en la función reproductora, es esencial en el inicio de la pubertad, en el dimorfismo sexual y en la regulación de la señalización neuronal para modular el eje hipotálamo-hipófiso-ovárico (HHO) (Moschos et al., 2002). La hormona se une a su receptor a nivel hipotalámico y activa una cascada de señalización bien establecida en la que participa el sistema janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) (Villanueva y Myers, 2008). Esta cascada de señalización está compartida por otras citoquinas, como interleucinas o el factor inhibidor de la leucemia. También se han descrito acciones directas de la leptina en otros tejidos relacionados con la función reproductora, estableciéndose acciones directas de la hormona en el ovario, el embrión y el endometrio, capaces de modular el desarrollo folicular, la calidad embrionaria, la tasa de implantación y la placentación (Brewer y Balen, 2010; Cervero et al., 2005; Elias y Purohit, 2013; Pérez-Pérez et al., 2015). Se ha descrito su actividad como un activador inicial de la cascada de señalización obligatoria en el proceso de implantación embrionaria (Ramos et al., 2005), en la que JAK/STAT son pasos críticos del proceso (Gonzalez et al., 2004; Salamonsen et al., 2010).También se ha establecido la implicación de la leptina en la prevención del aborto (Maheshwari et al., 2007). Por lo tanto, no parece sorprender que en enfermedades o alteraciones metabólicas dependientes de leptina, obesidad o síndrome del ovario poliquístico, entre otras, exista un alto riesgo de infertilidad debido a deficiencias en la ovulación y a la implantación embrionaria (Duggal et al., 2000). Así, la ausencia, el exceso y/o la resistencia a la leptina están claramente relacionadas con una baja eficiencia reproductiva o infertilidad (Elias y Purohit, 2013).

El tungstato sódico (Na2WO4) es una sal inorgánica de tungsteno con una actividad inhibidora de fosfatasas moderada, que ha evidenciado que ejerce un incremento de la actividad de leptina, entre otras citoquinas, modulando la señalización intracelular de estas hormonas señalizadoras, especialmente la cascada que involucra a JAK-2/STAT-3 (Amigó-Correig et al., 2011; Canals et al., 2009). La seguridad y la tolerabilidad de esta molécula tras su administración en humanos y animales son conocidas por los diversos estudios preclínicos y clínicos (estudios de fasei yii) realizados hasta la fecha (Hanzu et al., 2010).

Se ha demostrado que el Na2WO4 es capaz de disminuir la glucemia y mejorar la diabetes a través de una mejoría de la sensibilidad a la insulina, entre otros mecanismos (Claret et al., 2005). También se ha demostrado un claro efecto sobre el peso corporal, a través del control del gasto energético y la ingesta, a través de un mecanismo dependiente de leptina y mediante la modulación de JAK-2/STAT-3 (Amigó-Correig et al., 2011; Canals et al., 2009; Claret et al., 2005).

La evidencia disponible sugeriría que el Na2WO4 podría mejorar la eficiencia reproductiva a través de efectos sistémicos sobre el eje HHO y efectos directos en el endometrio, el ovocito y el embrión para alcanzar mayores tasas de implantación.

En el modelo de ratón IRS-2−/−, desarrollado por Burks et al. (2000), se induce una deleción del gen insulin receptor substrate-2 (IRS-2), que se traduce en un claro dimorfismo sexual en relación con la fertilidad y al metabolismo de los hidratos de carbono.

Los machos de este modelo presentan resistencia a la insulina y una severa hiperglucemia iniciada desde edades tempranas. Por contra, en edades tempranas las hembras se mantienen relativamente euglucémicas y desarrollan una ligera resistencia a la insulina, que se mantiene hasta edades avanzadas (4-5meses). Las hembras IRS-2−/− en edades tempranas, alrededor de 10 semanas de edad, muestran un bajo desarrollo folicular y una anovulación persistente, acompañada de la ausencia del ciclo estral en la mayoría de los ratones. La tasa de embarazos de los ratones hembra IRS-2−/− es del 9%, frente a una tasa del 100% en ratones hembra IRSwt (IRS-2+/+ wild-type). Dado que en estas edades las hembras se mantienen euglucémicas y que únicamente desarrollan una ligera resistencia a la insulina, la profunda alteración en la fertilidad no es una consecuencia directa de las anomalías en el metabolismo de la glucosa. Las hembras de este modelo presentan alteraciones en los niveles circulantes de leptina desde edades tempranas. Así, ya en las 4 primeras semanas de edad los niveles circulantes de esta leptina son 2,5 veces superiores a los animales wild-type y a las 8 semanas son 5 veces superiores. Una evidente resistencia hipotalámica a la leptina se sugiere como el mecanismo más plausible responsable de la infertilidad en las hembras de este modelo animal.

Las características de este modelo animal le hacen útil para el estudio de la infertilidad relacionada con estados de resistencia a la leptina como la obesidad o el síndrome del ovario poliquístico, entre otros. Por lo tanto, este modelo animal abarca una serie de factores importantes relacionados con infertilidad, y como tal es un modelo adecuado para estudiar la eficacia del Na2WO4 en el tratamiento de la infertilidad.

El trabajo actual pretende hacer una primera aproximación experimental para determinar el efecto del Na2WO4 sobre la capacidad reproductiva de un modelo animal, ratones hembra IRS-2−/−, en los que se ha descrito una limitada capacidad reproductiva como consecuencia de una profunda anovulación. Los resultados de esta prueba de concepto permitirán determinar el interés del Na2WO4 en el tratamiento de la fertilidad, que deberá confirmarse con estudios controlados y bien diseñados para determinar su alcance.

Para la realización de esta prueba de concepto se utilizaron ratones hembra IRS-2−/− mantenidos en una colonia con background genético mixto C57Bl/6 x 129Sv, generados como ha sido previamente descrito (Withers et al., 1998, 1999). Ratones hembra IRS-2−/− y ratones macho wild-type (IRS-2wt) de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas se estabularon en ciclo luz/oscuridad de 12h y temperatura y humedad normales. Los animales tuvieron acceso ad libitum tanto al agua de bebida como al alimento (pienso estándar tipo A04 Panlab, Barcelona).

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron realizados de acuerdo a las guías de cuidado de animales de laboratorio (regulación local y europea) y aprobados por el comité de experimentación animal de la Universitat de Barcelona.

Los ratones hembra IRS-2−/− se estabularon en grupos de 4-6 ratones/jaula. Tras un periodo de aclimatación, los animales se mantuvieron 2 semanas en fase de pretratamiento, durante las que se administraron comida y bebida en las condiciones previamente descritas. Tras este periodo se administró Na2WO4 (tungstato sódico dihidrato CAS-num 6132-04-3 Sigma-Aldrich) en el agua de bebida (2mg/ml en agua bidestilada) con acceso ad libitum. El tratamiento se inició inmediatamente después de la fase de pretratamiento (día 0 de tratamiento) y hasta 4 semanas antes del sacrificio de los animales. La dosis diaria de Na2WO4 ingerida por los ratones no fue controlada, pero se estima que fue aproximadamente de 180mg/kg de peso corporal, según ha sido descrito previamente en modelos animales y diseños experimentales similares (Canals et al., 2009; Claret et al., 2005). En un grupo de animales se monitorizó el peso corporal y la glucemia durante los primeros 12días de tratamiento. Tras 6h de ayuno se midieron los niveles de glucosa en sangre en los días 2, 5, 7, 9 y 12 de tratamiento, las medidas se realizaron con un sensor de glucosa Accutrend (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Este grupo de animales no se incluyó en la determinación del ciclo estral ni en el análisis posterior de la tasa de embarazo, con la intención de evitar interferencia que pudiesen ser causadas por el estrés generado por los repetidos periodos de ayuno.

Se eligieron 6 ratones hembras IRS-2−/− al azar para la determinación del ciclo estral. Se les realizaron frotis vaginales en los días pretratamiento (−8, −5, −2 y −1) y en los días de tratamiento (7, 8, 14, 15 y 22). Para la realización de los frotis vaginales se introdujo en la vagina de los ratones entre 1 y 2ml de solución salina con una pipeta Pasteur. Con la misma pipeta se recogió el exudado vaginal y se extendió en un portaobjetos. Una vez secado al aire, se fijó y se tiñó con la técnica de Papanicolaou. Las preparaciones se analizaron por personal entrenado y a ciego simple para eliminar el sesgo del evaluador. Las muestras se clasificaron en las siguientes fases: diestro, proestro, estro, metaestro, anestro o no evaluable.

A partir la tercera semana de tratamiento, los ratones hembra IRS-2−/− se estabularon por parejas junto a un ratón macho IRS-2wt competentes durante 12semanas. Los ratones se observaron diariamente en busca de signos de embarazo o parto. El tratamiento con Na2WO4 se mantuvo durante las 8semanas de estabulación conjunta de machos y hembras, periodo tras el que se retiró el tratamiento. En el caso de embarazo las hembras fueron estabuladas individualmente hasta el parto, manteniendo el tratamiento según el diseño del estudio. Estas hembras no se reincorporaron al estudio Transcurridas las 12semanas, las hembras que permanecían en el estudio fueron sacrificadas y biopsiadas en busca de indicios de embarazo, para calcular la tasa de fertilidad.

En la evaluación de las citologías de ratones hembra IRS-2−/− se identificaron fases anestro/diestro, proestro, estro, metaestro. La presencia de las 4 fases del ciclo en periodos de 4 a 6días es indicativa de la ciclicidad estral y de un ciclo ovárico normal. Sin embargo, la persistencia en fases anestro/diestro o proestro son indicadores de la ausencia de ciclicidad. Teniendo en consideración este patrón, se pueden determinar patrones diferenciales en el ciclo estral entre las fases de pretratamiento y tratamiento (tabla 1). Así, se observa que en las fases de pretratamiento todos los animales estudiados permanecen en fases anestro/diestro o proestro, mientras que en la fase de tratamiento se observa que todos los animales alcanzan fases tardías del ciclo (estro y metaestro), indicando que han recuperado el ciclo estral. Estos cambios en el ciclo se observan ya desde la primera medida realizada durante el periodo de tratamiento (día7), indicando una rápida recuperación del ciclo estral con la administración de Na2WO4. Adicionalmente se puede observar una reducción de los ciclos en estro y metaestro en las citologías realizadas en el día22 de tratamiento. No obstante, el diseño del estudio no permite determinar si se trata de un efecto aleatorio en el que la mayoría de los animales se encuentran en fases tempranas del ciclo o de una disminución del efecto del tratamiento.

Se monitorizó la evolución de la ganancia ponderal en ratones hembra IRS-2−/− durante los primeros 12días de tratamiento con Na2WO4. En este periodo no se observaron cambios significativos en el peso corporal de los ratones (fig. 1). De la misma forma, se monitorizaron los niveles de glucosa en sangre en los mismos animales tras 6h de ayuno. Como previamente estaba descrito, los animales mostraron niveles de glucosa ligeramente superiores a los normales, pero en los márgenes de la euglucemia (fig. 2). Durante los primeros días de tratamiento no se observaron cambios en los niveles de glucosa en sangre.

Figura 1.

Evolución del peso corporal en ratones IRS-2−/− tratados con Na2WO4.

(0,08MB).

Figura 2.

Evolución de la glucosa en sangre en ratones IRS-2−/− tratados con Na2WO4.

(0,09MB).

Tras finalizar el periodo de cruces entre hembras IRS-2−/− y machos IRS-2wt, se sacrificaron las hembras que no habían parido y se biopsiaron en búsqueda de signos de embarazos. Cuatro hembras habían parido durante el periodo de estudio. En el momento del sacrificio 4 hembras estaban embarazadas en diferentes estadios de gestación. Así, un total de 8 de las 10 hembras tratadas (80%) estaban embarazadas o habían parido en el momento del sacrificio (tabla 2). Esta tasa de embarazo es muy superior al 9% descrito previamente en hembras IRS-2−/− no tratadas (Burks et al., 2000).

El número medio de crías/embriones por hembra embarazada fue de 4,7 (mediana 6,5 crías/hembra). No se observaron anomalías a nivel macroscópico en los fetos ni en las crías nacidas.

Estos resultados sugieren que la administración de Na2WO4 mantiene la recuperación de la ovulación y permite la recuperación de la fertilidad en ratones hembra IRS-2−/−

Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del comité de experimentación humana responsable y de acuerdo con la Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki.

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.