Objetivo:Los neutrófilos juegan un papel esencial en la respuesta innata inmunitaria. No existe ningún estudio que haya correlacionado los neutrófilos de la placa, sa- liva, y fluido crevicular gingival (FCG) con la profundi- dad de sondaje de la bolsa (PSB) y entre ellos en sujetos con periodonto sano y sujetos con enfermedad perio- dontal. El propósito de este estudio fue valorar y corre- lacionar los niveles de neutrófilos en la placa dental, saliva y FCG en sujetos con periodonto sano y con en- fermedad periodontal.
Material y métodos:Se reclutaron cuarenta y cinco suje- tos, que se dividieron en tres grupos en función de su Índi- ce Gingival (IG) e Índice Periodontal de Russell (IP): su- jetos clínicamente sanos (Grupo 1), sujetos con gingivitis (Grupo 2), y sujetos con periodontitis crónica generaliza- da (Grupo 3). Las muestras de saliva y FCG se obtuvieron mediante filtros Durapore, y las de placa mediante curetas subgingivales específicas de área. El recuento de neu- trófilos se obtuvo con una cámara Neubauer mejorada.
Resultados:Se hallaron neutrófilos en las tres muestras de placa, saliva y FCG de todos los grupos. Se encon- traron diferencias estadísticamente significativas entre el número de neutrófilos y la severidad de la enferme- dad periodontal. La mayor fuerza de asociación se en- contró entre la PSB y los neutrófilos de la placa.
Conclusión:Existe una correlación positiva entre los neutrófilos de la placa dental y la PSB en sujetos con pe- riodonto sano y con enfermedad periodontal.
La enfermedad periodontal se define como una reac- ción inflamatoria que se produce como respuesta a una infección microbiana asociada a la placa dental y que termina produciendo pérdida de tejido. Los neutrófilos o leucocitos polimorfonucleares (PMNs) juegan un papel fundamental como parte de la respuesta inmunitaria in- nata, puesto que actúan como primera línea de defensa frente a los agentes invasores1. La presencia de leucocitos en la cavidad oral ha despertado el interés de los cientí- ficos desde hace bastantes años. Calonius comparó el nú- mero de leucocitos salivares en pacientes con encía sana, pacientes con encía inflamada y pacientes edéntulos. Encontró que los pacientes edéntulos tenían los niveles leucocitarios más bajos y los pacientes con gingivitis los más altos, lo que sugirió que el acceso de los leuco- citos a la saliva tenía lugar a través del surco gingival2. Schiott y Loe confirmaron estos hallazgos3.
En el periodonto sano de humanos y de animales de experimentación, los PMNs migran hacia el epitelio sul- cular y epitelio de unión o residen en ellos y se encuen- tran también en el tejido conectivo subyacente4. La acu- mulación de placa y el desarrollo de inflamación clínica producen un aumento del número de leucocitos presentes en la lesión5–7. La localización de los PMNs en la interfase de la placa, su actividad fagocítica, y los signos de liberación de enzimas lisosomales; aportan evidencia morfológica de que estas células parecen proteger a los tejidos frente a los ataques bacteriológicos y, al mismo tiempo, inducen daño tisular y aumento de la inflama- ción mediante la liberación de enzimas lisosomales. Por todo ello, un número elevado de leucocitos subgingiva- les puede ser indicativo de lesión periodontal activa8. De esta manera, el recuento leucocitario subgingival puede resultar muy útil para identificar puntos de enfermedad periodontal activa. Para comprobarlo hay que establecer si existe una correlación entre la profundidad de sondaje de la bolsa (PSB) y los neutrófilos de la placa.
La fase activa de la enfermedad periodontal es un periodo de exacerbación de la enfermedad que cursa con pérdida ósea, pérdida de tejido conectivo, y respuesta in- flamatoria. Esta actividad ha sido evaluada por diversos métodos, como la actividad enzimática y las pruebas mi- crobiológicas, pero todos ellos resultan complicados por lo que tienen una escasa aplicación clínica. Los esfuer- zos por encontrar otros métodos más sencillos y fáciles han resultado infructuosos9.
Raeste y Aura fueron los primeros en proponer la cuantificación neutrofílica para evaluar la actividad de la en- fermedad periodontal y medir la efectividad terapéutica10. Parece ser que la detección de neutrófilos en las mues- tras de placa reflejaría la respuesta del huésped a todos los periodontopatógenos. Esta superioridad del recuento de neutrófilos como herramienta diagnóstica para la en- fermedad periodontal puede transferirse al marco clíni- co. Hay estudios que han relacionado los neutrófilos sa- livares con la salud gingival y los neutrófilos del fluido crevicular gingival (FCG) con la salud periodontal4,11–15. Existe muy poca literatura sobre evaluación de neutrófilos en la placa16. No existen estudios que hayan abordado la relación entre los niveles de neutrófilos en la placa, la saliva, y el FCG y su correlación con parámetros clínicos como la PSB. Por ello, la finalidad de esta investigación fue valorar la correlación de los niveles de neutrófilos en la placa salivar y el FCG en sujetos con periodonto sano y enfermo, así como su correlación con la PSB.
Material y métodosEl estudio se llevó a cabo en el Departamento de Perio- doncia e Implantes Orales de la Facultad de Ciencias Dentales y Hospital Sri Dharmasthala Manjunatheswara, Dharwad, Karnataka, India, en abril a junio del 2010. Se reclutaron cuarenta y cinco sujetos (25 mujeres y 20 hom- bres) de entre 20 y 65 años de edad. Todos ellos firmaron el consentimiento informado. El comité de ética de la institución aportó la consiguiente autorización. Se diseñaron tres grupos de 15 sujetos cada uno: grupo 1 (clínicamente sanos), grupo 2 (gingivitis), y grupo 3 (pe- riodontitis crónica generalizada) (basándose en el Índice Gingival [IG] y el Índice Periodontal de Russell [IP]17,18).
Los criterios de inclusión fueron: (1) grados varia- bles de enfermedad periodontal (salud, gingivitis, y pe- riodontitis crónica generalizada);(2) salud sistémica; y (3) ausencia de tratamiento periodontal invasivo en los últimos 6 meses. Los criterios de exclusión fueron: (1) enfermedades sistémicas como diabetes mellitus; (2) embarazo; (3) tabaco y alcoholismo; (4) existencia de cualquier enfermedad con posible repercusión en el sistema inmunitario como la infecciones crónicas y cán- cer; (5) tratamiento con fármacos que pueden alterar el número o la función de los PMNs; (6) uso de cual- quier antibiótico durante el estudio o en el pasado re- ciente e historia de tratamiento periodontal no invasivo; y (7) presencia de lesiones de caries o de cualquier tipo de ulceración en la mucosa.
Se recopiló la historia dental y médica de todos los participantes, y se sometió a todos ellos a una explora- ción oral, que incluyó la valoración de caries. Se obtu- vieron las puntuaciones del IG e IP de Russell para cada sujeto. La recopilación de datos y las exploraciones fue- ron llevadas a cabo por un mismo investigador.
Recogida de salivaSe pidió a los participantes que se abstuvieran de escu- pir media hora antes de la obtención de saliva para la es- timación de neutrófilos. La saliva total no estimulada se obtuvo del suelo de la boca. Para ello se emplearon filtros de membrana hidrofílica de 0,22 f.Lm de difluo- ruro de polivinilo (Durapore, Millipore; Pall India Pvt, lot no. 0910ISOO 64). Para recoger las muestras de sali- va se utilizaron tiras de 2 X 7mm (fig. 1). Las tiras se colocaron en el suelo de la boca durante 10 s (fig. 2).
Recogida del FCG
Un minuto antes de la recogida de muestras se secaron las encías con aire y bolitas de algodón, y se aisló el área con rollitos de algodón. Antes de obtener la muestra de FCG se retiró el cálculo supragingival mediante una cureta estéril. Se colocó una tira de 7 X 2mm en la en- trada del surco y se dejó durante 10 s (fig. 3). Se recogió el FCG de los sujetos sanos y de los sujetos con gingivitis, mientras en los sujetos con periodontitis, las mues- tras se tomaron de los lugares con inflamación severa y mayor PSB. Se excluyeron las zonas sin FCG y se des- echaron las tiras Millipore contaminadas con sangre y saliva.
Recogida de la placa dental
Para la toma de muestras de placa dental se utilizó una cureta Gracey estéril específica de área. En los pacientes con gingivitis, se obtuvo la placa subgingival de las zo- nas que presentaban máxima inflamación. En el grupo de periodontitis, la placa se obtuvo de los sitios con ma- yor PSB. Se puso mucho cuidado en prevenir la conta- minación (fig. 4).
Determinación de neutrófilos
Se insertaron las tiras de saliva y las muestras de FCG, y se suspendieron las muestras de placa en tubos de polipropileno siliconizados de plástico (Sigma) con 40 f.Ll de suero salino tamponado con fosfato sin calcio, ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) 3 mM, y 1% de al- búmina sérica bovina (ASB); y se agitaron con vórtex durante 30 s (fig. 5). Se mezclaron veinte ml de esta suspensión con 10ml de solución Turks durante 10min. A continuación se calcularon los neutrófilos con una cámara Neubauer mejorada (Reichert Technologies) (fig. 6).
Se introdujeron los datos en Microsoft Excel, y se realiza- ron los análisis estadísticos usando GraphPad Prism 5.03 (GraphPad Software). Para valorar las diferencias en- tre los grupos se utilizó el análisis de la varianza de un factor (ANOVA). Se realizó el test de Mann-Whitney para la comparación intergrupal de las cifras de neutrófilos en la placa, saliva y FCG; y para determinar qué pare- ja era significativa con un intervalo de confianza al 5%. La correlación entre los índices clínicos y los neutrófilos se midió mediante el análisis de correlación de Pearson y pruebas de significación estadística. La fuerza de asociación entre los neutrófilos y la PSB se calculó mediante el análisis de regresión lineal. Se considera- ron estadísticamente significativos los valores con una p < 0,05.
ResultadosSe encontraron neutrófilos en todas las muestras. Los valores más altos para placa, saliva, y FCG se hallaron en el grupo 3, mientras que los valores más bajos se en- contraron en el grupo 1. En la tabla 1 pueden verse los valores de neutrófilos de cada grupo en placa, saliva y FCG. Como puede observarse en la tabla 2, se encon- traron diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA univariante, en el número medio de neutrófilos en placa, saliva y FCG entre los grupos. Los resultados del test de Mann-Whitney mostraron diferencias estadís- ticamente significativas y sugirieron que el número de neutrófilos en la placa, saliva y FCG aumentaba según se avanzaba de periodonto sano a gingivitis y a perio- dontitis en todas las muestras (tablas 3 a 5). Se halló una correlación positiva entre los índices clínicos y las cifras de neutrófilos (tabla 6). Basándose en el análisis de re- gresión lineal, la mayor asociación entre la PSB y las ci- fras de neutrófilos se encontró en la placa. Se encontró una asociación similar entre los neutrófilos del FCG ob- tenidos intracrevicularmente y los de la placa. Esta aso- ciación fue más débil en los neutrófilos obtenidos extra- crevicularmente, y no se halló ninguna asociación entre los neutrófilos salivales y la PSB (tabla 7).
Cifra media de neutrófilos en la placa, saliva y FCG de periodonto sano y enfermo (en cada grupo, n = 15)
| Grupo | Media ± DE | |
| Placa | 1 | 15.33 ± 5.61 |
| 2 | 52.67 ± 14.14 | |
| 3 | 171.20 ± 84.81 | |
| Saliva | 1 | 10.17 ± 3.97 |
| 2 | 18.08 ± 3.65 | |
| 3 | 4.42 ± 6.48 | |
| FCG | 1 | 17.67 ± 6.66 |
| 2 | 59.42 ± 20.55 | |
| 3 | 70.08 ± 17.54 |
DE: desviación estándar; FCG: fluido crevicular gingival. Ver el texto para la explicación de los grupos.
Fuerza de asociación entre la PSB y las cifras de neutrófilos en placa, saliva, y FCG (intracrevicular y extracrevicular) utilizando el análisis de regresión lineal
| Placa | FCG intracrevicular | FCG extracrevicular | Saliva |
| 0,9446 | 0,9394 | 0,6485 | 0,09207 |
| p<0,0001 | p<0,001 | p=0,0226 | p = 0,7760 |
LCG, líquido crevicular gingival; PSB: profundidad de sondaje de la bolsa.
La principal fuente de neutrófilos de la cavidad oral es la migración de estos a partir del surco gingival2. Los resultados de este estudio muestran que el número de PMNs en la saliva y el FCG, así como en la placa, aumen- ta conforme se incrementa la severidad de la enfermedad periodontal. Esto pudo verificarse por la correlación positiva hallada entre el IG e IP de Russell, y las cifras de neutrófilos. La razón puede encontrarse en el aumento de la superficie de epitelio ulcerado, lo que incrementa la migración de PMNs a través del mismo12. El empleo del recuento de neutrófilos en el FCG para evaluar la ac- tividad de la enfermedad periodontal se ha usado en otros estudios y en ellos se ha observado una correlación positiva con la PSB. Existen numerosas formas de obte- ner el FCG para la determinación de neutrófilos. Las ti- ras de Styroflex (BASF) no suelen dar resultados fia- bles porque las células tienden a agruparse4. El método de lavado de Skapski y Lehner y Salonen y Paunio presenta un inconveniente: no se puede precisar el factor de dilución, y por ello no es un buen método19,20. El método empleado en este estudio es el más recomenda- ble para la estimación de PMN15. Se necesitan filtros Mi- llipore especiales para analizar los PMNs recogidos del FCG. Los estudios previos empleaban exclusivamente para la obtención de LCG, el método extracrevicular, y encontraban una buena correlación entre la PSB y el nú- mero de neutrófilos del FCG en las bolsas superficiales, pero no en las bolsas más profundas15. En este estudio se utilizaron métodos de recogida ex tracreviculares e in- tracreviculares, ya que el empleo único del FCG extra- crevicular puede no reflejar la actividad de enfermedad en la base de la bolsa. En este estudio se encontró una fuerza de asociación similar entre los neutrófilos del FCG y los de la placa. Para tomar muestras de FCG se necesitan filtros Millipore especializados. Sin embargo, las muestras de placa pueden obtenerse mediante curetas subgingivales, por lo que en el marco clínico habitual es más fácil su empleo. El análisis de regresión lineal del estudio mostró una fuerte asociación entre la PSB y el número de PMN de la placa, y la fuerza de correla- ción fue equiparable a la encontrada entre el número de PMN del FCG cuando se obtuvo la muestra intracrevicu- larmente de la zona con profundidad de sondaje mayor. La asociación fue más débil cuando los niveles de PMN y la PSB se obtuvieron mediante un método de recolec- ción extracrevicular. Esto apoya los resultados del otro estudio15. No se encontró ninguna correlación entre los niveles de PMN salivales y la PSB; lo que sugiere que la muestra de saliva no es útil cuando se busca un diag- nóstico periodontal específico de área.
A pesar del enorme desarrollo que han experimenta-do los marcadores diagnósticos microbiológicos e in- munológicos, la mayoría de ellos no tienen aplicación clínica. Con los marcadores microbiológicos existen nu- merosas dificultades técnicas, sobre todo para el culti- vo de periodontopatógenos anaerobios; por otro lado, se necesita bastante tiempo para obtener los resultados. La biopsia gingival para marcadores inmunológicos tiene sus propias limitaciones16. Sin embargo, el examen mi- croscópico, en el mismo sillón dental, de la estimación cuantitativa de PMN no se ve afectado por todas estas li- mitaciones.
Actualmente, la herramienta diagnóstica más utilizada es el sondaje periodontal, pero supone una medida uni- dimensional de un espacio tridimensional. Por otra par- te, un error de tan solo 1mm puede arrojar lecturas erró- neas de hasta el 50%. No obstante, este método permite una gran velocidad de ejecución y su interpretación es inmediata en comparación con la de otros métodos mi- crobiológicos e inmunológicos. El sondaje periodontal aporta información clínica de la profundidad de la bolsa y de su configuración. Sin embargo, las bolsas periodon- tales atraviesan periodos de exacerbación y de quiescen- cia. Estos últimos se caracterizan por una respuesta in-flamatoria disminuida, una menor pérdida ósea y muy poca o ninguna pérdida de tejido óseo y de tejido conec- tivo adyacente; lo contrario de lo que ocurre en los pe- riodos de actividad. Por consiguiente, es imprescindible conocer la actividad de la enfermedad actual, puesto que ello resulta determinante para establecer las opciones te- rapéuticas. Estas consideraciones muestran que las ven- tajas del sondaje, a pesar de resultar aceptable e irrem- plazable en la práctica periodontal rutinaria, resultan inútiles cuando se quiere evaluar la actividad de la en- fermedad. De ahí que se puedan usar medidas alterna- tivas, basadas en indicadores del proceso inflamatorio, para valorar la actividad de la enfermedad periodontal16. Los neutrófilos de la placa podrían usarse para valorar la actividad de la enfermedad siempre y cuando pudieran correlacionarse con la PSB. Este artículo es el primero de este tipo, y muestra una correlación positiva entre la PSB y los neutrófilos de la placa; abriendo de este modo un nuevo horizonte para un estudio longitudinal que in- vestigue la relación entre los cambios de la PSB y los neu- trófilos de la placa, y que los convierta en primera elec- ción como marcadores de la actividad de enfermedad.
Estudios posteriores pueden dirigirse hacia el desa- rrollo de agentes que cambien de color y que puedan emplearse en el sillón dental, de forma similar a los agentes de revelado de la placa que tiñen los neutrófilos de la placa y que permitieran identificar y monitorizar a lo sujetos con periodontitis. Se pueden utilizar los neu- trófilos de la placa, en clínica, para controlar la actividad de la enfermedad en sujetos con tratamiento periodon- tal de soporte. Posteriormente, esto se podría desarrollar todavía más para el cribado de sujetos con periodonti- tis agresivas que cursan con anomalía cuantitativa en los neutrófilos.
ConclusiónEl número de neutrófilos hallados en la placa, saliva y FCG aumenta con la severidad de la enfermedad perio- dontal, lo que refleja la naturaleza inflamatoria de la en- fermedad. Existe una correlación positiva entre los neu- trófilos de la placa y la PSB.
Los autores agradecen su ayuda en el estudio al Dr. Arvind Yeri (pató- logo clínico) y el Dr. Shwetha Acharya (patólogo oral), SDM College of Dental Sciences and Hospital, Dharwad, India, así como a todos los participantes.