En Argentina, Escherichia coli enteropatogénico (EPEC) es uno de los agentes más prevalentes aislados de niños con diarrea. Debido a que la contaminación con este patotipo en productos de pollo podría ocurrir durante el proceso de faena, nos planteamos como objetivo aislar y caracterizar EPEC de muestras de animales vivos (cloacas), carcasas evisceradas sin lavar, carcasas lavadas y agua del tanque de enfriamiento. Se caracterizaron 29 aislamientos de EPEC que presentaron una amplia variedad de serotipos, algunos de los cuales (O2:H40, O8:H19 y O108:H9) han sido informados en otras especies animales. También se encontró el serotipo O45:H8, aislado con anterioridad de niños con diarrea. Se detectaron aislamientos de los serotipos O2:H40, O108:H9 y O123:H32 en distintas etapas del proceso de faena, lo que sugiere que el procesamiento no se realiza en forma adecuada. Se torna necesario reforzar las medidas de control e higiene en las distintas etapas del proceso para disminuir la contaminación microbiana.
In Argentina, EPEC is one of the most prevalent agents isolated from children with diarrhea. Because contamination with this pathotype could occur during slaughter, the aim of this study was to isolate and characterize EPEC strains obtained from live animals (cloacae), eviscerated carcasses, washed carcasses and water from chillers. Twenty nine isolates of atypical EPEC were characterized. These isolates presented a wide variety of serotypes, some of which (O2:H40, O8:H19 and O108:H9) had been reported in other animal species. Serotype O45:H8, previously isolated from children with diarrhea was also found. Isolates of serotypes O2:H40, O108:H9 and O123:H32 were detected at different stages of the slaughtering process, suggesting that the process is not adequately performed. This latter fact highlights the importance of reinforcing control and hygienic measures at different stages of the chicken slaughtering process in order to reduce microbial contamination.
Escherichia coli enteropatogénico [enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)] produce diarrea acuosa en niños y ha sido responsable de varios brotes a nivel mundial. En Argentina, la incidencia de diarreas infantiles es de 150/100 000 en niños menores de cinco años12, y EPEC es uno de los agentes más prevalentes. EPEC produce una lesión característica denominada A/E (“attaching and effacing”) mediada por la intimina (codificada por el gen eae), el receptor traslocado de la intimina y otras proteínas secretadas. La intimina puede presentar variantes que difieren en la región de unión al receptor2,9. Es importante aclarar que el gen eae no es exclusivo de EPEC, ya que existen cepas de E. coli productoras de verotoxinas que también lo portan.
Algunas cepas EPEC tienen la capacidad de expresar una fimbria llamada BFP (“bundle forming pili”), que permite formar redes tridimensionales entre las bacterias y cuya subunidad principal está codificada por el gen bfpA. La presencia o ausencia de BFP permite clasificar a las cepas EPEC en típicas y atípicas, respectivamente14. Las cepas EPEC atípicas tienen mayor prevalencia que las típicas, tanto en los países en desarrollo como en los desarrollados10.
Los serotipos más frecuentes entre las cepas EPEC típicas son O55:H6, O55:H-, O86:H34, O111:H2, O111:H-, O114:H2, O119:H6, O119:H-, O127:H6, O142:H6 y O142:H3414. Dentro de las EPEC atípicas se ha descrito una amplia variedad de serotipos a nivel mundial, entre los cuales predominan O33:H6, O51:H40, O51:H49, O111:H-, O119:H2, O127:H40, O132:H34, O145:H-, OR:H- y una gran proporción de ONT6. Sin embargo, un mismo serogrupo puede estar asociado a una cepa típica o a una atípica (O55, O86)13.
Al igual de lo que sucede con otras E. coli diarreogénicas, la transmisión de EPEC ocurre por vía fecal-oral a través de manos, agua y alimentos contaminados. La contaminación de los alimentos puede ocurrir durante el proceso de faena de los animales que son reservorios de la bacteria: bovinos, cerdos y pollos, entre otros1,8. En el caso de los pollos, y específicamente en la planta de faena muestreada, una vez que arriban a la planta los pollos son colocados en una noria de colgado, insensibilizados y desangrados. Luego se realizan los pasos de escaldado y pelado. El eviscerado es automatizado, ayudado por operarios que quitan restos de la evisceración. La carcasa es lavada tanto en la superficie externa como interna con agua potable corriente y clorinada aplicada a presión, y luego ingresa en dos tanques para su enfriamiento. Por último, la carcasa es escurrida y envasada.
Debido a que EPEC ha sido comunicado en materia fecal, carne y carcasas de pollo, pero no durante su procesamiento, nos planteamos como objetivo aislar y caracterizar cepas EPEC de muestras eae positivas obtenidas en distintas etapas del proceso de faena (animales vivos, carcasas evisceradas sin lavar, carcasas lavadas después del pasaje por los tanques de enfriamiento y muestras de los tanques de enfriamiento) en un trabajo previo1.
En el presente trabajo, a partir de las zonas confluentes positivas para eae conservadas a −70°C se sembraron en estría placas de agar Mac Conkey y se cultivaron 24h a 37°C. Se realizaron pools de 5 colonias y se realizó PCR multiplex para detectar eae y los genes de verotoxinas vt1 y vt21. De los pools positivos a eae, cada colonia individual se cultivó en 800μl de caldo LB durante 18 h a 37°C con agitación y se realizó nuevamente la PCR multiplex. La detección de los genes vt1 y vt2 se incluyó para identificar a los aislamientos correspondientes a EPEC (eae-positivos pero vt-negativos) y diferenciarlos de E. coli productores de verotoxinas.
Cada aislamiento de EPEC se procesó para detectar bfpA por PCR monoplex según Gunzburg et al.5 y la presencia de las variantes α, β, γ y ε del gen eae según la metodología descrita por Oswald et al.11. Los antígenos O y H se determinaron por la técnica de microaglutinación en placa y tubo, respectivamente, con un kit de antisueros (O1-O186) y 56 antisueros H producidos por el Laboratorio de Referencia de E. coli (LREC) (Lugo, España).
Se obtuvo un total de 29 aislamientos EPEC, ninguno de los cuales presentó el gen bfpA, lo que indica que los pollos y las carcasas estaban contaminados con cepas EPEC atípicas, en concordancia con los resultados obtenidos por Krause et al.9 y Farooq et al.3 en materia fecal de pollos. Este dato también concuerda con los publicados por Trabulsi et al.14, quienes demostraron que serotipos de cepas EPEC atípicas estaban asociados con huéspedes animales.
Los aislamientos presentaron 12 antígenos O diferentes (O2, O3, O4, O8, O25, O45, O108, O119, O123, O153, O177 y OR), mientras que 5 aislamientos fueron NT (ausencia de reacción con los antisueros empleados) y uno se clasificó como O? (reacción con más de un antisuero en título similar), combinados con 10 antígenos H diferentes (H4, H8, H9, H19, H21, H26, H28, H32, H40 y H49), mientras que un aislamiento fue no móvil. No se observó predominio de ningún serotipo en particular (tabla 1).
Serotipos de EPEC en la planta de faena. Se indica la variante de intimina entre paréntesis.
| Muestreo | Cloacas | Carcasas evisceradas sin lavara (superficie interna) | Tanque de enfriamiento | Carcasas lavadas | |
|---|---|---|---|---|---|
| Superficie externa | Superficie interna | ||||
| 1° | O8:H19 (ND)a | O45:H8(β)b | OR:H32(β)c | ||
| O119:H4 (β) | O8:H28(β)b | ONT:H19(β)c | |||
| ONT:H49 (ND) | |||||
| 2° | O108:H40 (β) | O2:H40 (ND) | O4:H21 (β) | ||
| O177:H40 (ND) | O3:H26 (β) | O4:H- (ND) | |||
| ONT:H40 (ND) | O8:H21 (β) | ||||
| O25:H32 (β) | |||||
| O153:H26 (β) | |||||
| O2:H40 (β) | |||||
| 3° | O2:H40 (ND) | O123:H32 (β) | O108:H9 (β) | O8:H21 (ND) O108:H9 (β) | ONT:H21 (β) |
| O108:H40 (β) | O123:H32 (β) | O123:H32 (β) | O?:H40 (ND)d | ||
| ONT:H40 (ND) | |||||
Algunos serotipos se encontraron en distintas etapas del proceso de faena, por ejemplo, en el segundo muestreo se detectó un aislamiento O2:H40 en el interior de una carcasa eviscerada sin lavar y otro en el interior de una carcasa lavada. Además, en el tercer muestreo se detectaron aislamientos O123:H32 tanto en el interior de carcasas evisceradas sin lavar como en la superficie de una carcasa lavada, mientras que se identificaron aislamientos del serotipo O108:H9 en el agua de un tanque de enfriamiento y en la superficie de una carcasa lavada en el mismo muestreo.
Se ha informado la presencia de algunos de los serotipos EPEC encontrados en cloacas y carcasas en otras especies animales (O2:H40, O8:H19 y O108:H9) y en niños con diarrea (O45:H8)9. El serotipo O4:H- fue identificado previamente como VTEC portador de intimina en bovinos con diarrea y carne picada, y estuvo asociado a casos de SUH7. Este dato es importante, ya que algunos autores postulan que tanto cepas VTEC como así también cepas EPEC típicas pueden convertirse en EPEC atípicas durante la infección debido a la pérdida de elementos genéticos móviles como bacteriófagos o plásmidos codificantes de vt y bfp, respectivamente6.
Por otra parte, en el presente trabajo se detectaron nuevos serotipos de EPEC como O3:H26, O4:H21, O8:H21, O8:H28, O25:H32, O108:H40, O123:H32, O153:H26 O177:H40 y OR:H32, que no habían sido comunicados previamente en la bibliografía a nivel mundial.
La mayoría de los aislamientos (65 %) presentó la variante β de la intimina, en concordancia con lo hallado por Kobayashi et al.8, quienes detectaron dicha variante en 12 cepas EPEC atípicas provenientes de cloacas de pollos parrilleros. Esta variante se encuentra ampliamente distribuida en cepas EPEC aisladas del hombre y de varias especies animales como bovinos, cerdos, conejos, perros y aves11. Además, es una de las variantes más frecuentemente encontradas en cepas EPEC atípicas de diferentes serotipos4,14. El resto de los aislamientos fueron negativos a las variantes α, β, γ y ε. Estos datos sugieren que los aislamientos de pollo y sus productos podrían ser portadores de otras variantes conocidas, pero aisladas con menor frecuencia, o de nuevas variantes. Los serotipos O8:H19 y O108:H9 presentaron la misma variante informada por otros autores en aislamientos de bovinos y cerdos4,9. Sin embargo, el serotipo O2:H40 ha sido comunicado en otras especies animales con otra variante4, y, aunque en muchos casos cepas EPEC atípicas correspondientes a un mismo serotipo aisladas en diferentes países portan una misma variante de intimina, también se ha informado la presencia de diferentes variantes en EPEC atípicas de un mismo serotipo6.
En la planta de faena se detectó EPEC en cloacas, y su presencia a lo largo del proceso posterior de faena demuestra que este no se realiza bajo las condiciones adecuadas. Se detectaron aislamientos correspondientes a un mismo serotipo en distintas etapas del proceso de faena, lo que refuerza esta idea. Además de la detección de EPEC en carcasas en distintas etapas, es llamativa su detección en el agua de un tanque de enfriamiento, dado que algunos autores sostienen que aquel reduce los niveles de contaminación con E. coli y coliformes.
Sobre la base de los resultados de este trabajo, se considera necesario reforzar las medidas de control e higiene, en particular, se recomienda realizar una evisceración completa de las carcasas, un recambio permanente del agua clorinada de los tanques de enfriamiento y el control de la carga microbiana, de acuerdo con las BPM recomendadas.
Responsabilidades éticasProtección de personas y animalesLos autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.
Confidencialidad de los datosLos autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
Derecho a la privacidad y consentimiento informadoLos autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
FinanciaciónEste trabajo fue apoyado por becas de CONICET tipo I y II (M. Z. Alonso) y por subsidios de la Secretaría de Ciencia, Arte y Tecnología, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNICEN-SECAT) y PICT 2010 Proy. 1655. P. M. A. Lucchesi es miembro de la Carrera del Investigador del CONICET. N. L. es miembro de la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia Buenos Aires (CICPBA).
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Los autores agradecen a María Rosa Ortiz por su asistencia técnica, al MV Guillermo Arroyo y al Dr. Daniel Fernández por su asistencia en la toma de muestras.
